Abstract
アポトーシスによって死細胞は、隣接する生細胞の機能に影響を与えることを可能に複数の新たな活動を取得し、調整された細胞死と呼ばれます。このような生存、増殖、成長、および分化などの生命活動は、アポトーシス細胞によって変調された多くの細胞機能の一つです。認識し、アポトーシス細胞に応答する能力にかかわらず、発信の系統または器官の、すべてのセルの普遍的な特徴であるように思われます。しかし、細心の注意が任意の特定の結果の責任シグナル伝達事象および経路を解剖に取られるアポトーシス細胞の義務に対する応答の多様性と複雑さ。特に、1はアポトーシス細胞を含む、実行可能な応答細胞内の細胞内シグナル伝達経路に影響を与えることが可能な複数のメカニズムを区別する必要がありますの受容体媒介アポトーシス細胞の認識、アポトーシス細胞による可溶性メディエーターの放出、および/または婚約をphagocytic機械。ここでは、アポトーシス細胞への曝露後の生存可能な応答細胞に誘導される細胞内シグナル伝達事象を識別するためのプロトコルを提供します。プロトコルの主な利点は、アポトーシス細胞が応答する細胞内シグナル伝達事象を調節するメカニズムの解剖に支払う注意にあります。プロトコルは、条件付きで不死化したマウスの腎臓近位尿細管細胞株（BU.MPT細胞）に特異的であるが、それは容易に原点非上皮細胞および/または腎臓以外の臓器に由来する細胞系に適合されます。刺激として死んだ細胞の使用は、細胞内シグナル伝達事象の検出を妨げることができますいくつかのユニークな要素を紹介します。これらの問題だけでなく、それらを最小化または回避するための戦略は、プロトコル内で議論されています。このプロトコルの適用は健康にし、diseaの両方で、死亡または瀕死の細胞は、それらのライブの隣人に及ぼす幅広い影響の私達の拡大の知識を支援する必要がありSE。
Introduction
アポトーシス、または規制された細胞死1は 、組織の維持・発展に不可欠な方法で貢献しています。最も単純に見ると、アポトーシスが損傷し、高齢者許可、または過剰な細胞が組織2,3の周囲に害を及ぼすことなく排除されます。組織ホメオスタシスに対するアポトーシスの寄与は、しかしながら、かなり動的で変化します。アポトーシスによる死細胞は、複数の新たな活動を取得し、両方の分泌され、細胞関連、隣接する生きた細胞4-10の機能に影響を与えるために、それらを可能にします。以前の研究は、炎症11-16を抑制するために、アポトーシス細胞の能力に焦点を当てたが、アポトーシス細胞はまた、生存4,9,10、増殖4,9,10、分化17、などの重要な活動を含む細胞機能の広い範囲を調節しますマイグレーション18、および成長19。また、これらの効果は、マクロファージのような専門の食細胞に限定されるものではありませんsの、そのような上皮および内皮細胞7,9,10,18-21として伝統的に非食細胞を含む、実質的にすべての細胞型および系統、にまで及びます。
アポトーシス細胞への曝露後に隣接する生きた細胞の特異的な応答は、生存応答細胞およびアポトーシス細胞自体の両方に関連する複数の要因に依存します。アポトーシス細胞への曝露は、マウスマクロファージおよび腎臓の近位尿細管上皮細胞（PTECs）の両方の増殖を阻害するが、例えば、これら2つの細胞型は、アポトーシス細胞4,6,9,10に対する生存応答に劇的に異なります。アポトーシス細胞は、マクロファージの生存を促進するが、PTECs 4,6,9,10のアポトーシス死を誘導します。特に、アポトーシス細胞に対する応答は、乳房上皮対 例えば 、腎臓PTECs（起源10の応答細胞の器官に応じて、同じであっても系統の応答細胞の間で異なる場合があります細胞）または活性化22の状態（ 例えば 、好中球）。逆に、アポトーシス細胞は、アポトーシス10,23またはアポトーシス10,14のステージを刺激の性質に依存して全く同じセル内の異なる応答を誘発することができます。
アポトーシス細胞に対する応答の多様性と複雑さを考えると、細心の注意は、任意の特定の結果の責任シグナル伝達事象および経路を解剖に注意しなければなりません。まず、生存可能とアポトーシス細胞との間の直接的な物理的相互作用を必要とする回答は、アポトーシス細胞3,6-10によって放出されたか、生成された可溶性メディエーターによって誘発されるものと区別されなければなりません。物理的な相互作用が必要な場合は、さらなる分化が行われるべきです。シグナル伝達事象は、アポトーシス細胞に特異的に結合する特異的受容体とは無関係に、その後の飲み込みの独立したアポトーシス細胞の受容体媒介認識、上、または貪食取り込みに依存してもよいです 3-7,9,10,19。後者の場合、応答は、アポトーシス細胞に特異的ではなく、任意の食作用物質4,6によってトリガすることができます。
これらの区別の重要性は、再びマクロファージおよび腎臓PTECsの応答を対比することによって理解することができます。両方の細胞型のために、アポトーシス細胞への暴露は、プロ生存キナーゼAktの活性を変化させます。 0.4μmのポリカーボネート膜により応答とアポトーシス細胞の分離が応答4,9,10,19を廃止するので変調は、物理的な相互作用に依存しています。マクロファージの応答は貪食4,9,10,19によって駆動されるのに対し、しかし、PTECsの応答は、受容体媒介および食作用とは無関係です。この結論は、ラテックスビーズ、中性食作用の刺激への曝露は、PTECsにおけるAkt活性に影響を及ぼさないという事実が、模倣マクロファージ4,9におけるアポトーシス細胞の効果によって強化されます。
">あまり研究が、壊死により死細胞、または偶発的な細胞死1、また3-10,19近くの生細胞の機能を調節する。アポトーシス細胞と同様に、壊死細胞は、様々なメカニズム、特に漏れを介してその効果を発揮しますその破裂し、細胞膜3,5,6,9,24を介して細胞内のコンテンツの。PTECsおよびマクロファージを含む多くの細胞は、壊死5,9により死細胞のための明確な非競合受容体を有する。これらの受容体の婚約があるシグナリング事象を誘発しますアポトーシス細胞は、リン酸化9,10,19を減少させる一方、アポトーシス細胞の受容体4-10,19の係合によって誘発されたものとしばしば反対。例えば、PTECsに、壊死細胞は、Aktのリン酸化を増加させます。ここでは、隣接するアポトーシスPTECsの受容体媒介性の認識によって実行可能な腎臓PTECsに誘導される細胞内シグナル伝達事象を識別するためのプロトコルを記述します
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Protocol
1.準備
注意：このプロトコルでは、2つ以上の細胞株または初代細胞培養物は、独立して、特定の条件下で調製されます。これらの製剤は、アポトーシス細胞（プロトコル1）、壊死細胞（プロトコル2）、および健康な応答細胞（プロトコル3）が挙げられます。独立した調製後、アポトーシスまたは壊死細胞は、応答細胞に添加し、得られたシグナル伝達は、（プロトコル4、5、および6）監視されます。
- 培地および試薬を準備
- 培養液Aの500 mLの準備（許容条件下での使用のために成長する細胞を、1.2節を参照）、以下を組み合わせることにより：1×ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）は4.5グラム/ Lのグルコース、584 mg / Lのʟグルタミン、110を含みますmg / Lのピルビン酸ナトリウム、100単位/ mLペニシリン - ストレプトマイシン、10％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）、および10単位/インターフェロンγ（IFN-γ）のミリリットル。
- 使用WHのための培養培地Bの500ミリリットル（調製非許容条件下での血清欠乏細胞エン、前血清飢餓に非許容条件（）で細胞を成長させるために培養液AのレシピからFBSおよびIFN-γを省略することによって、セクション1.2）を参照してください、10％vを追加培地Bへ/ v FBS
- 死細胞を固定するための4％ストックパラホルムアルデヒドから1×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で、0.4％（v / v）のパラホルムアルデヒド、pHを7.2に調製します。
注：パラホルムアルデヒドは毒性があり、かつ適切な注意が、その使用に注意を払うべきです。
- 文化BU.MPT細胞
- 液体窒素からBU.MPT細胞の1バイアルを解凍します。
注：BU.MPTが主要なマウスの制御下でSV40ラージ腫瘍抗原（タグ）の温度感受性（TS）突然変異（株tsA58）を有するトランスジェニックマウス由来のマウス腎臓近位尿細管上皮細胞（PTEC）ラインであります組織適合遺伝子複合体（MHC）H-2K bのクラス私は25,26プロモーター。 - 無菌polystyr上のプレートの細胞エン真空ガスプラズマ処理された組織培養皿（直径100mm皿当たり約5×10 6細胞）。
- 加湿した5％（v / v）のCO 2雰囲気中で許容条件下で細胞を成長させます。
注：33で培養物として定義されている許容条件下、 - IFN-γの存在下で、37ºCでは、株tsA58変異タグの導入遺伝子の安定な発現を可能にします。単一の通路または2以上生存しないマウス腎臓PTECの初代培養物とは異なり、BU.MPTは無期限に継代することができる許容する条件下で培養しました。- 実験においてそれらを使用する前に、解凍後の継代細胞は、少なくとも3回。
- 継代細胞を、5分間、37ºCで（v / v）のCO 2雰囲気の加湿5％の100mmディッシュあたり0.05％トリプシンの1 mLを加え、そしてインキュベートします。媒体Aを吸引し、10mLのを分離した細胞を添加することによりトリプシンを中和し、そして1分割：滅菌ポリスチレン真空ガスプラズマTISSを処理し、新しい100 mmのに5：1〜3UE培養皿。 100ミリメートル皿当たり10ミリリットルの合計にボリュームを起動するために培地Aを追加します。
- 実験においてそれらを使用する前に、解凍後の継代細胞は、少なくとも3回。
- 細胞応答としての実験的な使用のための準備では、非許容条件下で、加湿5％でコンフルエンスする細胞（v / v）のCO 2の雰囲気を成長させる（ すなわち、IFN-γの不在下で39ºCで[培地Bは、10％vを含みます/ vのFBS]）。
注：非許容条件下で、株tsA58変異タグの導入遺伝子の発現は、> 95％阻害される、とBU.MPT細胞は、マウス腎臓PTECの初代培養のように振る舞います。
- 液体窒素からBU.MPT細胞の1バイアルを解凍します。
アポトーシスBU.MPT細胞（プロトコル1）の調製
注意：このプロトコルは、アポトーシス誘導の方法として、アポトーシス細胞の供給源、およびスタウロスポリンなどBU.MPT細胞に特異的です。あるいは、別の細胞株、または初代細胞培養は、標準化されたprotocoによって誘導されるアポトーシスに、アポトーシス細胞の供給源として使用することができますその特定の細胞型とアポトーシス誘導の方法LS。
- 直径100mmの滅菌ポリスチレン真空ガスプラズマ処理された組織培養皿に継代した後、で培地A中で37ºCで、すなわち （許容条件下（v / v）のCO 2雰囲気の加湿5％コンフルエントにBU.MPT細胞を成長させますセクション1.2.3で説明したように100ミリメートル皿当たり10 mL）で、。
- 接着細胞単層をリンス当たり10ミリリットルを用いて培養液Bで3回リンス。
- 37ºCで加湿した5％（v / v）のCO 2雰囲気下で3時間に1μg/ mLで、スタウロスポリンを含む培養培地B中で細胞をインキュベートすることによって非選択的タンパク質キナーゼ阻害剤のアポトーシスを誘導します。
- 単層から剥離してきた「フローティング」アポトーシス細胞を含むスタウロスポリン含有培地を吸引除去します。遠心分離機500×gで10分間この培地上清を捨て、培地Bでペレットを3回洗浄し、そして次のステップ、2.5に回収した細胞に戻ってペレットを追加します。
- Mg 5分間ディッシュあたり1 mLの2 +フリーDPBS - 1XのCa 2 + 5 mMの（エチレンジアミン四酢酸）、EDTAの添加によりステップ2.3および2.4から残りの接着細胞を切り離します。取り外したアポトーシス細胞を含むEDTA含有培地を吸引除去し、滅菌した15 mLのポリスチレン遠心管にステップ2.4からの「フローティング」アポトーシス細胞と分離した細胞をプールします。
- そして洗浄あたりのMg + 2を含まないDPBS - 500×gで再懸濁1XのCa + 2 10mL中で10分間遠心分離することにより、アポトーシス細胞を3回洗浄します。
- 最後の洗浄後、応答細胞を刺激するために使用する前に、mL当たり〜5×10 6個の細胞で新鮮な培養培地B中のアポトーシス細胞を懸濁。代替的に、30分間、1×DPBS中の0.4％（v / v）のパラホルムアルデヒド中で洗浄し、アポトーシス細胞を固定し、その後培養で3回洗浄し培地Bに中断前の媒体B、
- 必要に応じて、以前6,9,10,15に記載されているように 、アポトーシス細胞（またはこの目的のためにいくつかのセルを予約することによって）の別々の準備を使用したフローサイトメトリーによるアポトーシスの誘導を確認します。
注：初期のアポトーシス細胞が無傷の細胞膜を有し、そしてヨウ化プロピジウム（PI）として現れる陰性及びアネキシンV陽性細胞（生細胞と比較して）セルのサイズを減少させました。後期アポトーシス細胞は、非無傷の細胞膜を有し、およびPI陽性およびアネキシンV陽性細胞は、細胞の大きさの減少として現れます。現在のプロトコルを使用して、典型的な調製物は、〜85％初期アポトーシス及び〜15％後期アポトーシス細胞を含みます。 - 直接的または1x DPBS中0.4％（v / v）のパラホルムアルデヒドで30分間、アポトーシス細胞の固定後、1：1のアポトーシスへの応答細胞の割合で細胞（プロトコル3）レスポンダBU.MPTするアポトーシス細胞を追加。
注：アポトーシス細胞の固定を前に応答者の刺激にする必要があります観察されたシグナル伝達事象は、可溶性媒介物質（ 表1）の放出によるものでない限り、結果には影響しません。
壊死BU.MPT細胞（プロトコル2）の調製
注意：このプロトコルは、壊死の誘導方法として壊死細胞の供給源、および加熱などBU.MPT細胞に特異的です。あるいは、別の細胞株、または初代細胞培養物は、その特定の細胞型および壊死を誘導する方法を標準化されたプロトコルによって誘導される壊死で、壊死細胞の供給源として使用することができます。
- 直径100mmの滅菌ポリスチレン真空ガスプラズマ処理された組織培養皿に継代した後、で培地A中で37ºCで、すなわち （許容条件下（v / v）のCO 2雰囲気の加湿5％コンフルエントにBU.MPT細胞を成長させますセクション1.2.3で説明したように皿当たり10 mL）で、。
- 使用して、培地Bで接着細胞単層を3回リンスすすぎあたり10 mLです。
- およびMg + 2 5分間ディッシュあたり1 mLのフリーDPBS - 1XのCa + 2で5 mMのEDTAを添加することによって細胞を切り離します。剥離した細胞を含むEDTA含有培地を吸引し、滅菌した15 mLのポリスチレン遠心管に細胞懸濁液を加えます。
- およびMg + 2の洗浄あたりフリーDPBS -のCa + 2の10ミリリットルで500×gで再懸濁で10分間の遠心分離によって細胞を3回洗浄します。
- 最後の洗浄後、ミリリットル当たり約5×10 6個の細胞で新鮮な培養培地Bで細胞を懸濁。
- 穏やかに細胞懸濁液を10分ごとにボルテックスし、水浴中で45分間70ºCに細胞を加熱することにより壊死を誘発します。
- 37℃で加湿した5％（v / v）のCO 2雰囲気下で2時間、細胞をインキュベートします。静かに細胞懸濁液を15分ごとにボルテックス。
- 必要に応じて、NEの別々の調製物を用いたフローサイトメトリーによって壊死の誘導を確認しますcrotic細胞（またはこの目的のためにいくつかのセルを予約することによって）、先6,9,10,15に記載しました。
壊死細胞は、細胞膜を破裂しており、（生細胞と比較して）増加した細胞サイズのPI陽性細胞として表示注：。現在のプロトコルを使用して、典型的な調製物は、≥95％壊死細胞が含まれています。代替的に、壊死および膜完全性の喪失の誘導は、トリパンブルー染色により確認することができます。
BU.MPTレスポンダー細胞（プロトコル3）の4準備
注意：このプロトコルは、応答細胞の供給源としてBU.MPT細胞に特異的です。あるいは、別の細胞株、または初代細胞培養は、応答細胞として使用することができます。実験的使用に先立ち、休止は、実験室内の標準化されたプロトコルによって一晩誘導することができます。
- それらが達成されるまで〜皿当たり10 mLの培地A中で許容する条件下で、無菌の100mm組織培養皿にBU.MPT細胞を成長させます85％のコンフルエンス。
- 吸引培地A、及びすすぎあたり10 mLで細胞を培地Bで三回洗浄します。 1.2節で説明したように、加湿5％で18〜24時間、非許容条件（ すなわち 39ºCで皿当たり10 mLの培地B中）の下（v / v）のCO 2雰囲気のために細胞を一晩血清餓死静止状態を誘導するために0.4、。代替的に、血清はFBSを含まない培地Bで一晩細胞を飢餓前に一日39ºCで培地B中の細胞に加えて10％（v / v）のFBSを成長させます。
- 各実験条件についてコンフルエントBU.MPT細胞の別個の組織培養皿にラベルを付けます。
- 15分間の車両または上皮成長因子（EGF）のいずれかで実行可能なBU.MPT応答者の刺激、無細胞、アポトーシス細胞、または壊死細胞のいずれかへの30分間の曝露次：次の6つの条件を含みます。
注：死細胞への曝露は、GIの活性のレベルを刺激または阻害することができるいずれかシグナル伝達分子ヴェン。刺激は最高の低ベースラインの上に検出された（ 例えば 、EGFの不在）、阻害は最高の高ベースラインから検出されたのに対し（ 例えば 、EGFの存在）。死細胞による刺激の効果が先験的不明であるので、不在とEGFの存在の両方ですべての試験を実施することをお勧めします。
アポトーシスおよび壊死細胞（プロトコル4）と応答細胞の5刺激
- 静止の前標識された皿から吸引し、培地B（血清飢餓）BU.MPT応答細胞（プロトコル3）。
注：非許容条件下で一晩培養した後、BU.MPT細胞は、マウス腎臓PTECの初代培養のように振る舞うべきです。 - 100ミリメートル皿当たり、次のいずれかの2 mLを追加します。培地B（無細胞）;培地Bで、mL当たり〜5×10 6細胞（プロトコル1）でアポトーシス細胞懸濁液; mLの私あたり〜5×10 6個の細胞で、または壊死性細胞懸濁液nは培地B（プロトコル2）。
- 均等に100ミリメートル皿の上に死んだ細胞の2 mLの懸濁液を配布し、それらを最小限に落ち着くまでの時間を保ちます。これを達成するために、応答細胞皿の表面全体に広い先端ピペットで滴によって死細胞懸濁液滴を分配します。セトリング時間を最小化し、死細胞の凝集を回避することとの間の妥協点として2ミリリットルの容量を使用してください。
注：刺激として死んだ細胞の懸濁液を使用することは、以下に詳細に説明されている特別な考慮事項の数（ 表2および考察）を伴います。 - 〜10×10 6個の細胞が含まれていコンフルエント100ミリメートル皿に、mL当たり〜5×10 6個の細胞で死細胞の2ミリリットルを追加することによって、1：〜1の死者・ツー・レスポンダ細胞比を実現。また、任意の観察されたシグナル伝達事象の用量依存性を確立するために、教団の漸進的希釈により連続的に反応細胞に死者の比率を変化させますプロトコール1及び2で調製した死細胞懸濁液のURE媒体B。
- 均等に100ミリメートル皿の上に死んだ細胞の2 mLの懸濁液を配布し、それらを最小限に落ち着くまでの時間を保ちます。これを達成するために、応答細胞皿の表面全体に広い先端ピペットで滴によって死細胞懸濁液滴を分配します。セトリング時間を最小化し、死細胞の凝集を回避することとの間の妥協点として2ミリリットルの容量を使用してください。
- 静かその後、加湿5％（v / v）のCO 2雰囲気中、37ºCでインキュベート、料理を旋回させます。
- 30分後、培養皿の前標識によれば、車両または50 nmのEGFのいずれかで応答細胞を刺激します。
- 加湿した5％（v / v）のCO 2雰囲気中、37℃で15分間インキュベートします。
- 、氷冷1×DPBS 5mLのを加える料理を旋回し、洗浄液を吸引することにより、死細胞を洗い流します。 3回繰り返します。
- すぐに、さらなる処理のために氷上で応答細胞の皿を置きます。
- 細胞溶解物を準備します
- 以下を含む細胞溶解緩衝液を調製する：1×トリスSDS、10％グリセロール、及び25mMのフッ化ナトリウムw / vの生理食塩水（TBS）、10mMのピロリン酸ナトリウム、Vデオキシコール酸/ W、0.5％、0.1％の緩衝化。
- INDに与えられた正確な順序で以下を追加し、細胞溶解する直前icated濃度：ミニEDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（1錠10溶解緩衝液1mLあたり）、10％（v / v）のトリトンX-100、1mMジチオスレイトール（DTT）、1mMのフェニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF）、及び10オルトバナジン酸ナトリウム。
- ステップ5.7から氷上で新鮮に刺激応答細胞の100ミリメートル皿当たりの氷冷細胞溶解緩衝液の700μLを追加します。セルスクレーパーで細胞をこすり、および1.5 mLのマイクロチューブに予め冷却した溶解液を移します。 15分間氷上でチューブを維持します。
- 20ヘルツ、持続時間が1秒未満それぞれの10パルスと氷上で超音波処理した溶解物。このサンプルを過熱することができるように、気体/液体界面でのフォームの作成を避けてください。完全に超音波処理器を切り替える前に、溶解物を含むマイクロチューブに超音波処理器プローブを浸漬し、溶解物からプローブを取り外す前に、超音波処理器のスイッチを切ります。
- 4℃で10分間20,000×gで遠心分離し、新鮮なあらかじめ冷却マイクロチューブに上清を移します、および-70ºCで保存。
- 以前6,9,10,15に記載されているように 、溶解物の上清のゲル電気泳動およびイムノブロッティングを行います。
- 以下を含む細胞溶解緩衝液を調製する：1×トリスSDS、10％グリセロール、及び25mMのフッ化ナトリウムw / vの生理食塩水（TBS）、10mMのピロリン酸ナトリウム、Vデオキシコール酸/ W、0.5％、0.1％の緩衝化。
6.半透過性ポリカーボネート膜を用いて、目標とレスポンダとの間の直接的な物理的接触を防止する（プロトコル5）
- 1つの例外を除いて、プロトコル3に従ってBU.MPTの応答細胞を準備し;滅菌ポリスチレン組織培養中の細胞を成長させるには、12ウェルのクラスターを処理しました。
- 選択したウェルでは、死んだとレスポンダー細胞との間の物理的相互作用を防止するために、0.4μmのポリカーボネート膜を含む透過性のサポートシステムを配置します。同じ実験における膜なしの対照ウェルを含めます。
- 血清飢餓BU.MPTの応答細胞の実験ウェルから吸引し培地B。
- 以下のように変更して、アポトーシスまたは壊死細胞と応答性細胞の刺激のためのプロトコル4に従ってください：
- ウェルあたりの12ウェルのクラスタは、次のいずれかの0.1 mLを加え：培養液B（細胞なし）。培地Bで、mL当たり〜5×10 6細胞（プロトコル1）でアポトーシス細胞懸濁液;または培養培地B（プロトコル2）で、mL当たり〜5×10 6細胞で壊死性細胞懸濁液。
注：12ウェルクラスターのコンフルエントウェルは、〜0.5×10 6細胞、〜で死んだ細胞の0.1 mLに添加することを含んでいるので 、mL当たり5×10 6細胞を、死んツー応答細胞比〜をもたらす1：1。 - 透過性のサポートシステムを含むウェルに、透過性の支持システム内で0.4μmのポリカーボネート膜の上に死んだ細胞を追加し、その結果、無駄とレスポンダー細胞との間には直接の物理的相互作用はありません。
- ウェルあたりの12ウェルのクラスタは、次のいずれかの0.1 mLを加え：培養液B（細胞なし）。培地Bで、mL当たり〜5×10 6細胞（プロトコル1）でアポトーシス細胞懸濁液;または培養培地B（プロトコル2）で、mL当たり〜5×10 6細胞で壊死性細胞懸濁液。
サイトカラシンDと貪食の7阻害（プロトコル6）
- プロトコル3に従ってBU.MPT応答性細胞を準備します。
- dimethにおける細胞骨格阻害剤サイトカラシンDを準備4 mg / mlで（×1000）でイルスルホキシド（DMSO）。培地Bの10mLに4μgの/ mLの最終濃度を達成するためにBU.MPTの応答細胞車両の10μL（DMSO）またはサイトカラシンDの10μLのいずれかのために予め標識料理を追加します。
注：BU.MPT細胞やマクロファージ細胞株によるサイトカラシンD、食作用のこの濃度で≥90％9,10によって阻害されました。 - 加湿した5％（v / v）のCO 2雰囲気中、37ºCで2時間インキュベートします。
- アポトーシスまたは壊死細胞と応答性細胞の刺激のためのプロトコル4に従ってください。
- 必要に応じて、以前9,10に記載されているように 、（この目的のために予約または細胞）死んだとレスポンダー細胞の別々の調製物を用いて、フローサイトメトリーにより死細胞の貪食の阻害を確認します。
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Representative Results
図1では、我々はタイミングおよびアポトーシス細胞（プロトコル1）および壊死細胞（プロトコル2）の製造およびアポトーシスと壊死細胞（プロトコル4）の懸濁液と応答細胞の刺激に関与する重要なステップを示す概略図を提供します。
図2において、我々は、セリン-スレオニンキナーゼグリコーゲンシンターゼキナーゼ-3（GSK-3）、GSK-3αおよびGSK-3βの二つのアイソフォームのリン酸化に対するアポトーシス細胞の効果を示す代表的な結果をもたらします。 GSK-3α/βは、細胞の増殖および生存の調節において重要な役割、ならびにグルコース代謝におけるその重要な役割を担っています。セリン9におけるセリン21及びGSK-3βにおいてGSK-3αのリン酸化は、キナーゼ活性を阻害し、次いで、リン酸化およびβカテニンの増加した安定性の減少につながります。 βカテニンそれは、細胞増殖を刺激し、アポトーシスを阻害することが知られている遺伝子の転写を促進する核に転。 GSK-3α/βのリン酸化の減少増殖および生存と相関が減少したため、GSK-3α/βのリン酸化の増加は、増加した増殖および生存と関連しています。
GSK-3α/β（ 図2A）の30分を強く阻害し基底リン酸化のためのアポトーシス細胞への静止BU.MPT応答者の暴露。同様に、30分間、アポトーシスの標的の前曝露が強く、その後の上皮成長因子（EGF）、GSK-3α/β（ 図2A）の誘導性リン酸化を阻害しました。これとは対照的に、壊死細胞にBU.MPT応答者の暴露は、GSK-3α/βの基礎またはEGF誘導性リン酸化のいずれかに影響を及ぼしませんでした。
プリベンへBU.MPTレスポンダとアポトーシス細胞との間トンの物理的相互作用は、BU.MPTレスポンダは、透過性のサポートシステムで増殖させ、0.4μmのポリカーボネート膜によってアポトーシスターゲットから分離しました。 BU.MPTレスポンダとアポトーシス細胞間の物理的相互作用の防止は、GSK-3α/β（ 図2B）のリン酸化を阻害するアポトーシスターゲットの能力を廃止しました。食作用の役割を評価するために、我々は、死細胞の貪食取り込みを防止するために、細胞骨格阻害剤サイトカラシンDを使用します。アポトーシス細胞に応答したGSK-3α/βのリン酸化の阻害は、食作用の欠如（ 図2C）で発生しました。我々は、以前に使用した濃度で、≥90％9,10によってPTECおよびマクロファージ食作用を阻害し、そのサイトカラシンDを示しています。まとめると、我々の結果は、GSK3α/βのリン酸化のアポトーシス細胞媒介性阻害は、直接的な物理的相互作用betweが必要であることを示しますターゲットと応答細胞アンが、食作用とは無関係です。
図 1。細胞死を受けて隣接する細胞との物理的な相互作用による生存レスポンダー細胞の細胞内シグナル伝達事象の誘導のためのスキーマ。折れ線グラフは、（A）アポトーシス（ アポ ）細胞および（B）、壊死（ ネクロ ）BU.MPT細胞の細胞懸濁液の調製におけるタイミングと重大なイベントを描写し、実行可能なBU.MPTレスポンダの（C）で刺激アポトーシスまたは壊死細胞の懸濁液を持つ細胞。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図 2。アポトーシス細胞への暴露に続いてBU.MPTレスポンダー細胞におけるGSK3α/βのリン酸化の阻害は、直接細胞間相互作用を必要とするが、食作用とは無関係です。血清飢餓BU.MPTの応答細胞は（A、B）は、車両または（C）サイトカラシンD（4μgの/ mL）で2時間前処理し、その後、細胞なしで30分間刺激した（ - ）、アポトーシス細胞（ アポ ）、または1の細胞比レスポンダに死んだ細胞で壊死細胞（NEC）：1。レスポンダー細胞は、次いで収穫前に、EGF（50nMで）の非存在下または存在下で洗浄し、さらに15分間インキュベートしました。アポトーシス細胞の供給源は、スタウロスポリンで処理したBU.MPTの細胞でした。壊死細胞の供給源を熱処理BU.MPT細胞でした。死細胞とBU.MPTレスポンダとの間の相互作用は、直接可能に、いずれかの（A、C）妨げられずにいました透過性のサポートシステムで0.4μmのポリカーボネート膜により死細胞と応答者の分離を伴う死細胞レスポンダ物理的相互作用、または（B）。死細胞および非接着性応答細胞を洗浄により除去し、図のようにBU.MPT細胞溶解物を、抗リン酸化GSK3α/β抗体でプローブしたレスポンダ。同等のローディングは、全グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のためにプローブすることによって確認しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| このメカニズムを想定したイベントをシグナル伝達への影響 | |||||||
| 介入 | 可溶性メディエータ | 受容体媒介認識 | 食作用 | ||||
| アポトーシス細胞の固定* | 排除 | 固執 | 固執 | ||||
| アポトーシスとレスポンダー細胞の物理的分離† | 固執 | 排除 | 排除 | ||||
| stimulus¶として、アポトーシスを起こした細胞から超遠心分離条件培地 | 固執 | 排除 | 排除 | ||||
| 刺激として壊死細胞 | 排除 | 消去又は反対方向の応答（ 例えば 、刺激対阻害） | 固執 | ||||
| 刺激としてラテックスビーズ | 排除 | 排除 | 固執 | ||||
| 食作用の薬理学的阻害 | 固執 | 固執 | 排除 | *予測結果は、固定が受容体媒介性の認識および/または食作用を担う重要な表面決定を変更しないことを前提としています。 | |||
| †予測結果は、2つの仮定を伴う：まず、可溶性メディエーターは、任意の小屋ベシクルまたはマイクロベシクル、しばしば呼ばれるアポトーシス小体は、に対して大きすぎること、膜の孔アポトーシスを分離し、細胞応答、及び第二通過するのに十分に小さいこと膜の孔を通過。小胞または微小胞の役割は、超遠心分離し、馴化培地対アポトーシスとレスポンダー細胞の物理的分離で観察されたシグナル伝達事象における一致の欠如によって示唆されるであろう。 | |||||||
| ¶超遠心分離（30分間、20,000×g）は、任意のアポトーシス小体やEFFEを模倣し得る他の小屋不溶性物質を除去する必要があります無傷のアポトーシス細胞のカラット。 | |||||||
表1。 アポトーシス細胞への曝露後の生存細胞内のシグナル伝達事象を担当メカニズム（複数可）の同定。いくつかの簡単な実験的な戦略がアポトーシス細胞への曝露後に観察されたイベントをシグナル伝達を担う潜在的なメカニズム（複数可）を区別するために設けられています。これらのメカニズムは、次のとおりです。物理的な応答細胞上の特定の受容体とアポトーシス細胞の相互作用、アポトーシス細胞からの可溶性メディエーターの放出、および応答細胞の貪食機構の関与を。
| 実験問題 | 最小化および/または回避のために利用可能な戦略 |
| 限られた数（1：1比〜1）細胞応答あたりのアポトーシス細胞。 | 1.アポトーシス細胞の数が、アポトーシスへの応答細胞の比が維持されるべきである増やし<2：1 * |
| アポトーシス細胞の重力依存的で安定するために必要です。 | 1.アポトーシス細胞が懸濁される媒体の体積を最小化します。 |
| 2.遠心ディッシュまたはプレートは、より迅速に、懸濁媒体を介してアポトーシス細胞を駆動します。 | |
| アポトーシス細胞の不均一な空間分布。 | 1.慎重応答細胞皿の表面全体にワイド先端ピペットを用いてドロップによるアポトーシス細胞懸濁液のドロップを配布します。 |
| 2.半月板の効果が不均一に分布につながることができた直径<35ミリメートル、と培養皿またはウェルを避けてください。 | |
| アポトーシス細胞集団の不均一。 | 1.強力な誘導物質を使用してくださいアポトーシスの。 |
| 誘導後2、パラホルムアルデヒドを用いてアポトーシス細胞を固定し、ソートすることにより、より均一な集団を得るためにフローサイトメトリー。 | |
| *においてアポトーシスへの応答細胞比> 2：1、アポトーシス細胞がコンフルエントカーペットを形成し、付加的なアポトーシス細胞は、もはや応答細胞と直接接触しないであろう | |
表2。 細胞内シグナル伝達イベントの刺激としての細胞懸濁液を使用して実験的問題関連。刺激として細胞懸濁液の使用に関連するいくつかの実験的な障害物が記載されている、並びにそれらの部分的な救済のための戦略されています。
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Discussion
ここでは、アポトーシスまたは細胞死の他の形態を経ている細胞への曝露後の生存細胞に誘導される細胞内シグナル伝達事象を特徴づけるためのプロトコルを提供します。プロトコルは、アポトーシス細胞の曝露は、生存応答細胞内の細胞内シグナル伝達経路を調節することが可能な複数の機構を強調しています。これらのメカニズムは、次のとおりです。対話を（死んだ細胞またはその小屋の小胞および微小胞の分子または表面決定をブリッジを経由して、多くの場合、アポトーシス小体と呼ばれる）応答細胞上の特定の受容体と; （偶数またはその細胞外世代27）可溶性メディエーターの放出;そして、貪食機械の締結。実質的な食作用が発生する状況下では、考慮すべき追加的なメカニズムは、アポトーシス細胞またはその小胞21内に濃縮されたようなマイクロRNAなどのメディエーター、の配信です。 Oと比較して、私たちのプロトコルの重要性、THERの方法論は、アポトーシス細胞が応答する細胞内シグナル伝達を調節することができることにより、複数のメカニズムのその慎重な解剖です。主な利点は、必要な技術の大部分は簡単で、細胞培養に標準装備されていることです。
プロトコルは、不死化マウス腎臓PTEC線BU.MPT細胞に特異的であるが、両方とも死んだと応答細胞の供給源として、他の細胞株または初代細胞培養物へのプロトコルの適合は簡単であり、容易に実施します。また、私たちの以前の出版物のように、死んだと応答細胞の供給源は、必ずしも同じ9,10,19である必要はありません。我々は、アポトーシスおよび壊死の誘導因子としてスタウロスポリン及び熱の使用を記載しているが、それぞれのモードと細胞死のトリガーはまた、変化してもよいです。アポトーシス細胞への曝露後BU.MPTレスポンダに誘導されるシグナル伝達事象は、アポトーシス誘導のモードの大部分は独立しているが、我々ヘクタールいくつかの相違点9,10を観察しまし。このような理由から、我々は、アポトーシス細胞死のいくつかの異なるトリガと複製キーの結果をお勧めします。例えば、マクロファージのような高度に食細胞は、応答4,6として使用される場合、または応答と死細胞との相互作用の持続時間が実質的な食作用が発生するために十分な長さである場合、一つの非毒性のインデューサーを考えることができ紫外またはガンマ線照射4,9,10は 、毒素の潜在的な貪食配信を排除するなど、アポトーシス、。壊死の誘導の別の方法も考えられます。私たちは加熱や細胞の凍結融解と同じ結果が得られているが、凍結融解で発生した大規模な細胞凝集や破片は、その使用が問題となります。
いくつかの簡単な戦略は、アポトーシス細胞への曝露後に観察され、任意のシグナル伝達事象を担当する特定のメカニズム（ 表1を解明するのに役立つことができます表1に詳述されるように、観察されたシグナル伝達事象に対する影響は、責任のメカニズムを特定することができます。例えば、アポトーシス細胞の受容体媒介性の認識の場合には、シグナリング事象は、アポトーシス細胞の固定化にもかかわらず持続するべきであり、馴化培地またはラテックスビーズによってアポトーシス細胞の交換に除去されるべきであるだけでなく、物理的に分離すると死んだと応答細胞の。壊死細胞に対応して、シグナル伝達事象を排除するか、逆向きになる（ 例えば 、刺激に対する阻害）。
缶デッドへの応答者細胞比を制限し、このいくつかの影響があります。減少またはシグナル伝達事象の隠蔽につながります。実行可能なレスポンダー細胞と物理的に相互作用するために、アポトーシス細胞は、最初の懸濁媒体のカラムに通して落ち着く必要があります。でも、最小限のボリュームで、細胞のセトリング時間は、限り10〜20分で、かなりのことができます。細胞内シグナル伝達イベントは、このように応答する細胞の間で調整されていないことになります。したがって、応答者と死んだ細胞との間の最初の接触は、正確なタイミングにすることはできません、むしろ時代のやや広い範囲内です。セトリングのために必要とされるよりも短い時間スケールで発生するイベントを知らせるために、同期の欠如は、それがもはや背景から識別可能であるように、信号の隠蔽につながることができます。延長期間の、そうでない場合は十分な大きさのさえ信号は、この問題の影響を受けやすいことができます。
これらの一時的な問題に加えて、空間的な事項も悪影響結果に影響を与えることができます。半月板、特にウェル内の効果、およびsの料理あまりにも力強いピペット操作によって生成されたモールの直径（ 例えば 、ポリスチレン組織培養は、96ウェルのクラスターを処理した）、または流体電流は、それによって細胞レスポンダーの間でごちそうや飢饉の状態を作成し、死細胞の不均一な分布につながることができます。測定された信号は、単一のウェルまたはプレート内のすべての応答細胞のことから派生しているので、死細胞の取り込みの変化は弱い信号を不明瞭にすることができます。
最後の問題は、アポトーシス細胞集団の不均一性に関連します。でも、このようなスタウロスポリンなどのアポトーシスの強力なトリガ、で、死細胞の任意の調製物は、死のプロセスの複数の段階で細胞が含まれています。アポトーシス細胞に対する応答の強さは死のプロセス10,14内のそのステージに依存する場合、これは、関連になります。平均して、各応答セルは一つだけアポトーシス細胞を検出したので、この場合の不均一性は、全体的に検出されたシグナル伝達イベントの弱体化につながることができます。 表2
一意刺激として死んだ細胞の使用に関連するいくつかの他の実験の懸念があります。重要なことには、培養条件は、応答細胞だけでなく、死んだ細胞自体だけでなく、影響を与えることができます。例えば、血清タンパク質が存在する場合、死細胞の表面に付着することができ、細胞応答によるその認識を増強または阻害します。矛盾した結果のトラブルシューティング、または結果が文献で報告されたものとは異なるでは、注意が（レスポンダーと死細胞の両方のために）、以下の培養条件に与えられるべきである：コンフルエンス、継代数、血清の存在下、血清の熱不活性化の度合いを、自然と休止の期間。最後に、一つは細胞死が、すべての細胞培養の容赦ない側面であることを認識する必要があり、応答細胞は、したがって、継続的に死者の低レベルにさらされています細胞。検討中の非常信号を継続的に誘導されているので、この露出は潜在的に、死細胞の塊に実験的応答に影響を与えることができます。信号変調は、誘導されたシグナル伝達事象が生存や増殖を伴う場合は特に、通常のフィードバック経路を通じて、あるいは応答細胞の亜集団の選択によって結果として起きることがあります。
要約すると、我々は、隣接した死亡または瀕死の細胞との物理的相互作用によって生細胞内で誘導される細胞内シグナル伝達事象の決意するためのプロトコルを記載しています。焦点は、死細胞の受容体媒介性の認識によって誘発されるシグナル伝達事象に主にですが、プロトコルは、食細胞取り込みまたは死んだ細胞からの可溶性メディエーターの放出によって誘発されるシグナル伝達事象の同定を可能にします。刺激として死んだ細胞の使用は、細胞内シグナル伝達事象の検出を妨げることができますいくつかのユニークな要素を紹介します。これらのuの意識niqueの要因だけでなく、死んだ細胞が細胞内シグナル伝達を調節することにより、複数のメカニズムは、研究のこの成長分野の設計や実験の解釈に重要です。ここで説明するプロトコルは、死んでいるか死にかけている細胞は、健康と病気の両方で彼らのライブの隣人に影響を与えるメカニズムの理解を助ける必要があります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1x with [4.5 g/L] glucose, ʟ-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100x | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/mL] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1x DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+- and Mg2+-free, 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10x, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 mL | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
References
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