Bei der Parkinson-Krankheit (PD), Substantia Nigra (SNC) dopaminergen Neuronen degenerieren, was zu Motorstörungen. Hier berichten wir über ein Protokoll zur Kultivierung von ventralen Mittelhirns Neuronen aus einer Maus eGFP durch eine Tyrosinhydroxylase (TH) Promotorsequenz angetrieben exprimieren, Ernten einzelnen fluoreszierenden Neuronen aus den Kulturen, und die Messung ihrer Transkriptom RNA-seq verwenden.
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Methodenartikel
Zuverlässige Identifikation von Wohn dopaminerge Neurone in Mittelhirns Kulturen unter Verwendung von RNA-Sequenzierung und TH-Promotor getriebene eGFP Expression
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Bei der Parkinson-Krankheit (PD) ist weit verbreitet Verlust von Neuronen im Gehirn mit ausgeprägter Degeneration dopaminerger Neurone in der SNc, was zu Bradykinesie, Rigidität und Tremor. Die Identifizierung von lebenden dopaminergen Neuronen in der primären ventrale mesencephalen (VM) Kulturen einen fluoreszierenden Marker bietet eine alternative Möglichkeit die selektive Anfälligkeit dieser Neuronen, ohne sich auf die Immunfärbung von fixierten Zellen zu studieren. Hier isolieren wir distanzieren und Kultur Maus VM Neuronen für 3 Wochen. Wir identifizieren dann dopaminergen Neuronen in den Kulturen mit eGFP-Fluoreszenz (angetrieben von einem Tyrosin-Hydroxylase (TH) Promotor). Einzelne Neuronen werden in Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung von Glasmikropipetten geerntet. Als nächstes wir die geernteten Zellen lysieren und cDNA - Synthese und Transposon-vermittelte "tagmentation" leiten einzelne Zelle RNA-Seq - Bibliotheken 1, 2, zu erzeugen ,ass = "xref"> 3, 4, 5. Nach dem Passieren wird eine Qualitätskontrollprüfung werden Einzelzellen-Bibliotheken sequenziert und die anschließende Analyse durchgeführt Genexpression zu messen. Wir berichten Transkriptom Ergebnisse für einzelne dopaminergen und GABA-erge Neuronen aus Mittelhirns Kulturen isoliert. Wir berichten, dass 100% der lebenden TH-eGFP-Zellen, die geerntet wurden und sequenziert wurden dopaminergen Neuronen. Diese Techniken haben weit verbreitete Anwendungen in der Neurowissenschaft und Molekularbiologie.
Einleitung
Parkinson-Krankheit (PD) ist eine unheilbare, altersbedingte neurodegenerative Erkrankung. Die Ursache für diese relativ häufige Erkrankung bleibt kaum verstanden. Es ist weit verbreitet Neuronenverlust im gesamten Gehirn, mit ausgeprägter neuronaler Degeneration von dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra (SNC), was zu einem diagnostischen klinischen Merkmale der Bradykinesie, Rigor und Tremor.
Primäre Mischkulturen SNc dopaminergen Neuronen enthalten, sind besonders relevant für die Parkinson-Krankheit. Ventralen Tegmentum (VTA) dopaminergen Neuronen wurden in Lohn und Sucht beteiligt. Ventrale mesencephalen (VM) primären gemischt....
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Protokoll
HINWEIS: Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren durch die National Institutes of Health durchgeführt und Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee am California Institute of Technology genehmigt.
1. Ableitung der primären dopaminergen Zellkulturen von embryonalen Mäusegehirn
- Lösungen und Kulturmedium
- Herstellung von Ascorbinsäure-Stammlösung
- Man wiegt 352 mg Ascorbinsäure. Hinzufügen sterilem H 2 O zu einem endgültigen Gesamtvolumen von 20 mL. Platz in 37 ° C warmen Wasserbad auflösen. Man filtriert durch 0,....
- Herstellung von Ascorbinsäure-Stammlösung
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Ergebnisse
Hier berichten wir ein Protokoll zur Kultivierung ventralen Mesencephalon - Neuronen von einem Maus - eGFP durch eine Tyrosinhydroxylase - Promotor - Sequenz angetrieben exprimieren, Ernten einzelnen fluoreszierenden Neuronen aus den Kulturen und Messung ihrer RNA Transkriptom unter Verwendung von RNA-seq (Abbildung 1). Die Daten zeigten, dass 100% der TH-eGFP-positive Zellen, die geerntet wurden und dopaminergen Neuronen wurden sequenziert, basierend auf der Anwesenheit.......
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Diskussion
Hier isolieren wir einzelne Zellen aus einer heterogenen Population einen Fluoreszenzmarker verwenden, dann jede Zelle studieren mit Single-Cell-RNA-seq. Wir berichten, dass 100% der lebenden TH-eGFP-Zellen, die wir waren tatsächlich dopaminergen Neuronen geerntet und sequenziert, basierend auf der Anwesenheit der folgenden drei DA-verwandtes Gen-Transkripte, TH, DDC und SLC6A3. Alle der TH-eGFP positiven Zellen, die diese drei Gene exprimiert durch RNA-Seq beurteilt wie. Das war konkordant mit elektrophysiologischen St.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), der Michael J. Fox Foundation und der Caltech Innovation Initiative unterstützt, die das Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory am California Institute of Technology finanziert. Wir danken Brian Williams für die Optimierung des RNA-Seq-Bibliotheksprotokolls und die Unterstützung durch diese Hilfe. Wir danken Henry Amrhein für das computergestützte Training. Wir danken Barbara J. Wold für die Nutzung ihrer Geräte und Laborräume. Wir danken Igor Antoshechkin für die Sequenzierung der Bibliothek und für das Facility Management.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | ||
| Hanks-balancierte Salzlösung (HBSS), 1x | Gibco | 14175-095 | |
| Spenderserum für Pferde | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: Neurobasales Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Nährmedien, die eine stabilisierte Form von L-Glutamin, L-Alanyl-L-Glutamin, enthalten: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0,5 mM Endkonzentration. |
| L-Ascorbinsäure | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50x Stammlösung, 1x Endkonzentration. |
| 35 mm Glasbodenschalen | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poly-L-Ornithin | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Gelagert bei -20 Grad C in 20 & Mikro; L aliquote |
| Desoxyribonuklease I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| Blaue Pipettenspitzen P1000 | Sorenson Bioscience | Inc. 10130 | |
| 10 mm flache | Petrischale VWR | 25384-324 | |
| 37 ° C Wasserbad | |||
| 37 > C, 5 % Luftfeuchtigkeit, Inkubator | |||
| 16 % Paraformaldehyd (PFA) | Elektronenmikroskopie | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Eselsserum | Equitech | SD-0100HI | 100%ige Stammlösung, 1% Endkonzentration. |
| Chirurgische Schere mit Standardmuster | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Pinzette - 2x3 Zähne | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Pinzette - Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Pinzette - Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10x PBS, pH 7,4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco's Phosphatgepufferte Lösung (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
| 21 G Nadel | BD PrecisionGlide Nadel | 305167 | 100 Nadeln |
| Mikropipettenabzieher | Sutter Instrument | Modell P-87 | |
| Mikromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit für die Illumina-Sequenzierung | Clontech | 634936 | 100 rnxs, inkl. Advantage2PCR Kit |
| Oligonukleotid (12 & Mikro; M): SMARTer IIA Oligonukleotid (12 & Mikro; m) | Aus dem SMARTer Kit | ||
| Reverse Transkriptase (100 Einheiten) | SMARTcribe reverse Transkriptase | Aus dem SMARTer Kit | |
| Grundierung 1 | 3' CDSIIa Grundierung | Aus dem SMARTer Kit | |
| Primer 2 | IS PCR-Primer | Aus dem SMARTer Kit | |
| 50x 2 Polymerase-Mix | 50x Advantage 2 Polymerase-Mix | Aus dem SMARTer Kit | |
| 10x PCR-Puffer | 10x Advantage 2 PCR-Puffer | Aus dem SMARTer Kit | |
| RNA Spikes | ThermoFisher | 4456740 PCR-Kühler | |
| Rack IsoFreeze PCR-Kühler Rack | |||
| Kit zur Vorbereitung von DNA-Proben | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 Proben |
| PCR-Mastermix | Nextera PCR-Mastermix (NPM) | Aus dem Nextera-Kit | |
| PCR-Primer-Cocktail (PPC) | Nextera PCR-Primer-Cocktail (PPC) | Aus dem Nextera Kit | |
| Fluorometer | Das Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer Kit | Agilent | 5067-4626 | 110 rxns |
| Elektrophoresesystem | Agilent 2100 Bioanalysator. | G2938C | |
| Magnetische Kügelchen: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
| RNAse Wipe: RNAse Zap Wipes | Ambion | AM9786 | Größe 100 Blatt |
| Qubit ds HS Assay Kit | Molekulare Sonden | Q32854 | 500 Assays |
| Gel-Extraktionskit: Qiaquick Gel-Extraktionskit | Qiagen | 28704 | |
| Glaskapillarrohr | (Kimax-51, 1,5 - 1,8 mm Außendurchmesser) | ||
| Microforge | Narishige (oder gleichwertig) | ||
| Sequenzierer | Illumina HiSeq-Instrument | ||
| GENSAT Tyrosinhydroxylase-eGFP-Mausstamm | MMRRC Aktiennummer: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center |
Referenzen
- Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
- Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
