病の診断のためのポータブルイメージングおよび分析と相まって磁気浮上

Introduction

ここでは、技術プラットフォームと疾患のための指標として患者の細胞の密度分布を分析するために自動化されたイメージングと分析して結合された磁気浮上を使用する技術を提示します。密度ベースのサイトメトリー分析のために、この多目的なアプローチは、最終的には疾患診断の範囲に適用することができます。しかし、途上国でのポイント・オブ・ケア検査と使用と互換性があるために、技術は、低コスト、携帯性、およびユーザビリティの要件を満たさなければなりません。デバイスおよび消耗品は、低コストで容易に得られなければなりません。サンプル調製は単純でなければならない、解析はユーザの入力や解釈のための最小限の要件を自動化する必要があり、結果はすぐに返されるべきです。さらに、デバイスは、臨床現場だけでなく、発展途上国で有用であるために、コンパクトでポータブルにする必要があります。したがって、我々は、ポイントオブケア互換工の磁気浮上を使用する装置および方法を開発しました患者の細胞集団の密度分布についての結果を返すように自動化された撮像画像解析を結合することにより術。

ポイント・オブ・ケアの技術は、現在の臨床検査の手順よりも顕著な利点を提供します。現在利用可能な技術は、臨床医または医療スタッフによって行われるには余りにも複雑によって所有されるには余りにも高価です。これらの手順の多くは、訓練を受けた技術者によって行われなければならない労働集約型のプロトコルを必要とします。これらの理由から、例えば、血液や尿などの患者サンプルは、一般的に、テストの結果を受信するために、医師のために数日を要することがあり、臨床試験のためのリモート、集中検査室に移し、医師のオフィスで収集されます。これは、（保険支払者の経済的負担を引き起こす）は、このテストは非常にコストがかかり、非効率的になり、いくつかのケースでは、治療の過程で遅延や合併症を引き起こし、さらに多くを行うことができます低リソース設定と途上国におけるアクセス不能の診断。

ここでは、埋め込まれた撮像処理（ 図1）およびスマートフォン対応機器（ 図2）とのデバイスの両方で自動イメージングおよび分析と結合された磁気浮上技術を提示します。これらの磁気浮上ベースのデバイスは、異なる医療診断用途の範囲に適用される可能性を有する広く適用プラットフォーム技術を表します。磁気力と浮力^1、2、3：二つの力の間の平衡に基づく磁気浮上アプローチ機能。粒子は、常磁性媒体中に懸濁二つMAGN間の中心線の方向に粒子の磁力が作用し、互いに対向するように極を有する2つの磁石によって発生する磁場の中に挿入されたとき ETS。浮力は、懸濁媒体に比べ粒子の相対密度によって引き起こされると周囲の媒体よりも高密度粒子の場合にはあまりメディアより緻密で下方粒子の場合には上向きになっています。これらの二つの力に基づいて、粒子は、これらの二つの力がバランスフィールドに平衡浮上位置に到達します。この位置は、低密度の粒子よりもフィールドに低い浮上密度の高い粒子と、粒子の密度に直接関係しています。撮像モジュール、内蔵スマートフォンカメラ^4、5、6または拡大レンズ^7,8を備えた独立した光学部品、粒子の位置を視覚化するために使用されていますか。画像処理のいずれかのスマートフォン・アプリケーションを介して^4、5、= "外部参照"> 6または埋め込み処理部^7、8は 、その後、したがって、人口の密度分布を空間分布を定量化し、するために撮影した画像を処理します。例えばミリリットル当たり関心のほんの数の粒子を有するもののような、より大きな試料（分析するために、流れは、それらが、撮像領域（ 図2）を通過するように、そのような粒子が浮遊し、分析するデバイスに直接統合することができます。

図1：自己完結型の磁気浮上プラットフォーム。 （a）は、表示画面を有する磁気集束モジュール、撮像コンポーネント（発光ダイオード（LED）、光学レンズ、およびカメラ検出器）、及び処理装置を含む小型磁気浮上装置。 （b）は、CROでの磁界強度サンプルが挿入された磁石との間の領域のSS-セクション。電界強度は、磁石の表面で最大であり、それらの間の中心でゼロに近づきます。 （c）の粒子は、このような細胞として、磁場の経験、いくつかの軍内：磁気間の中心線に向かう磁気力（F _mの）、大きさの粒子の位置により異なります。懸濁媒体のそれに比べ粒子密度に依存する重力（Fと_G '）、および粒子の動きに抵抗する抵抗力（F _d）は。 Yenilmezから、許可を得て、再現し、 ら。 ⁸ この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

イチジクURE 2：スマートフォン互換フローアシスト磁気浮上プラットフォーム。 （ - c）の前（a）の背面、側面（b）および（c）の磁気浮揚装置（d）のデバイスの構成要素としてのビュー：1）磁気浮上モジュール、永久磁石、拡大レンズを含む、およびLEDと光拡散、マイクロコントローラ、ポンプドライバ、およびBluetoothレシーバーを含む2）スマートフォンケース、3）エレクトロニクス、4）マイクロポンプホルダー、5）調整可能なオリフィス、6）廃棄物管ホルダー、7）電池ホルダー、8 ）試料ホルダー、9）兼用スタンドとカバー。 （e）の磁場を通して試料のポンプを示す、概略的なフロー。 （F）は、フィールドを介してポンピングされるように異なる密度の粒子を整列する方法を示す磁気浮上モジュールの断面図。このような粒子1のような密度の低い粒子は、高い浮上高さトンで平衡化しますこのような粒子2と漢より高密度の粒子は、 らアミン、から、許可を得て、再現します。 ¹ この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

このシステムにおける密度分布の分析のために任意のサンプルを使用するための最低限の要件は、細胞または約5μmと約250μmの大きさよりも小さく（撮像と画像処理用）との適合性よりも大きい粒子の懸濁液を得る能力を含みますそのようなここで使用ガドブトロールとして常磁性液の溶液中で混合します。疾患の診断のために、互換性のあるアプリケーションは、健康な対照と比較して疾患を運ぶときに、目的のもの（I）において、細胞は本質的に密度変化が、試薬または一部を添加することによって細胞内で誘導することができる（II）、改変された密度を有し含みます要するにための代替治療cubation時間、または（iii）異なる細胞型は、単一のサンプル中で同定され、本質的に（またはいくつかの処理を介して ）されているが独特の特徴密度を有します。

鎌状赤血球症、間欠血管閉塞事象および慢性溶血性貧血⁹をもたらすことができる人の赤血球（RBC）で製造されるヘモグロビンの変異型、HBSを引き起こす遺伝性疾患です。これは、ヘモグロビンの等電非常に正確であるが、それらは、ポイントオブケアの設定と互換性がないため、臨床検査室で行わなければならない、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分画、又はヘモグロビン電気焦点のいずれかを使用して診断されます。鎌状赤血球症のための溶解度及び紙ベースのテストが提案されているが、一般的に主観的なユーザの解釈や確認試験を必要とされてきました。ここでは、RBよりも高い密度を達成する、鎌状赤血球を同定するための密度ベースのアプローチを使用し鎌状赤血球疾患のない人からのCs。機構は、脱酸素化条件^{10、11、12、13}の下鎌状赤血球症の赤血球に赤血球脱水を起こすヘモグロビン、HBSの変異型の重合を含みます。

白血球（WBC）および赤血球^7：この密度に基づくアプローチは、密度に基づいて、異なる種類の細胞を分離するために適用することができます。白血球は、一般的に、体内の感染症との戦いに関与しています。 WBCサイトメトリーは、血液中のこれらの細胞の数を定量化するために使用され、有用な診断ツールとして機能することができます。 WBCは、通常よりも高いカウント（一般μLあたり11,000細胞よりも大きいと考えられる）感染、免疫系障害、または白血病を示すことができます。 （μLあたり3500細胞の周囲の）正常範囲以下のWBC数は、自己免疫疾患またはコンディットによって引き起こされることがあります骨髄を損傷するイオン。代替技術とは異なり、ここで紹介する方法は、白血球を識別するために、赤血球や汚れの溶解に依存しません。 WBC集団密度は密度勾配遠心^2、3を使用して、以前に計算されたRBCの集団よりも低いことが報告されているように、この細胞ベースの試験は、分離を行うために、2つの細胞タイプの固有の固有の密度を利用します。

15分、および1分未満を必要とし、自動イメージング及び分析-遠隔地に代替の試験と比較して、この試験は、単純な試料調製（ 図3）、10内のデバイス内の細胞の分離と、迅速です。この方法では、装置は、治療は、物理的および心理的苦痛を軽減し、合併症のassociのリスクを低減するために、すぐに投与されることを可能にする、より良い医療の意思決定を通知するために迅速に結果を返すことができ医療における遅延でated。この技法は、サイトのいずれかの単純なサンプル調製、最小限のユーザ入力または解釈に結果を返し、自動画像化及び分析のために臨床的状況において実施することができます。そのため、サンプルの分析およびスマートフォンや画像撮影・画像処理のための単純な電気部品のいずれかを使用するための永久磁石を使用した簡単なアプローチの使用により、デバイスだけでなく、あたりのテストコストはいくつかの洗練されたテスト手順に比べてごくわずかです。

Protocol

倫理文：ヒトの血液サンプルを含むすべての手順は、制度の規制に従って実施しました。すべてのプロトコルを見直し、治験審査委員会によって承認されました。インフォームドコンセントは、全ての参加者によって与えられました。

鎌状赤血球症の診断^5、8 1.試料の調製

1. ハンクス平衡塩溶液（HBSS）でガドブトロールの50 mM溶液を準備します。
2. ガドリニウム溶液中10mMのメタ重亜硫酸ナトリウムを溶解します。
   注：メタ重亜硫酸ナトリウムは、吸入による毒性が強く、皮膚や組織を刺激します。水と混合した場合には、腐食性の酸です。これは、高温に加熱すると、硫黄及びナトリウムの有毒な酸化ガスを排出するために分解してもよいです。
3. 指先または静脈穿刺のいずれかを介して血液サンプルを入手します。
   1. クリーンな、使い捨てのランセットで穿刺装置を用いて血液を描画します。 APプライピアスサイト付近の圧力と3〜4回ピペットを用いて血液を採取する前に形成された血液滴を拭いてください。世話をしていない、これは組織液と試料の汚染につながるよう、組織を圧迫することにより、「ミルク」指をします。
   2. 代わりに、標準的な静脈穿刺手順^14を用いて血液を描画します。
      注：サンプルは数時間以上保存される場合は、EDTAなどの抗凝固剤とバキュテナーに血液を集めます。
4. ガドリニウムメタ重亜硫酸ナトリウム溶液100μlに血液の1未満μLを追加します。

WBCサイトメトリー⁷ 2.サンプル調製

1. セクション1のように、指先または静脈穿刺のいずれかを介して血液サンプルを入手します。
2. オプション：RBC溶解バッファーとを溶解赤血球。ピペット5 RBC溶解緩衝液500μLへの血液のμLと3室温でインキュベート - 5分。
   注意：これは、白血球の単離された集団の浮上範囲を確認するために行われてもよいです。ここに提示した結果は、赤血球は白血球よりも明らかに低い位置に浮揚することを実証しかし、このステップを実行する必要はありません。
3. HBSS中の25mMのGd 1,000：全血1に希釈します
   注：1溶解サンプル：250mMのGdを25 mMののGdを含む試料を得るために、細胞溶解を行った場合には、溶解サンプル9を希釈。

磁気浮上プラットフォーム^{4、5、6、7、8を}用いて試料の3分析

1. 磁気浮上装置を起動します。
   1. 自己完結型のデバイスの場合、デバイスを接続し、それがパワーアップし、平らな、水平な面に配置することができます。
   2. スマートフォンと互換性のあるバージョンについては、スマートフォンのアプリケーションを起動し、画像を入力するために、左にスワイプキャプチャモード、およびフラット、レベルの表面上の場所。
2. 静磁気浮上のために：
   1. 溶液に終わりを浸漬し、毛細管現象を介してキャピラリを埋めるために、サンプルを可能にすることにより、角のガラスマイクロキャピラリーチューブに調製した試料をロードします。
   2. ゆっくり一端材料へのキャピラリを押すことによって、チューブシーラントと端をシールします。
   3. チューブのわずか1センチ表示されたままとなるよう磁気浮上装置の磁石の間の毛細管を挿入します（図試料調製のために、図3を参照してください）。
      注：この手順はスマートフォンと互換性と自己完結型デバイスの両方で同じままです。
   4. デバイスまたはキャピラリーを乱すことなく10分を待ちます。
3. 流れアシスト磁気浮上のために：
   1. サンプル管にサンプルをロードします。
   2. 試料容器とMI間の入口チューブを接続crocapillaryとマイクロキャピラリーと廃棄物容器の間の出口チューブを接続します。
   3. LED輝度と流れパラメータを設定します。
4. その後、（自己完結型のデバイスとスマートフォンのアプリケーションの画面の下部にあるカメラボタンにボタン3）画像をキャプチャするキャプチャボタンを押して、細胞が視野内に表示されていることを確認してください。
   注：USBは、画像を格納するために使用されている場合は、「画像」というフォルダを作成し、前にデバイスをオンにUSBを挿入します。いかなるドライブが存在しない場合、装置は、その内部メモリに画像を保存し、後で転送されます。
   注：複数の画像を撮影し、撮影の間に1/2センチメートル程度または外キャピラリを移動させることにより、異常のリスクを低減するために分析することができます。
   注：（検出されたユーザインタフェース上で報告として）視野内の細胞数が高すぎるか低すぎる場合、またはデバイスからキャピラリをシフトまたは別のSAを調製mple。
5. サンプルを削除し、制度や地域の規則に従ってサンプルを捨てます。毛細血管はシャープとして配置する必要があります。

図3：サンプル調製とユーザーインターフェイス。 （a）は、サンプル調製手順は、対象の指を穿刺血液の液滴を形成し、試料試験溶液に血液滴を移送、試料を撹拌し、毛管作用を介して、毛細管にロードし、磁気浮上にサンプルを挿入することを含みますデバイス。 （b）は、これらのサンプル調製ステップは、サンプル調製を導くために、デバイスの画面上に表示されます。 （c）のデバイスは、4つのボタンが含まれます。適切に調整ノブを使用してフォーカスを調整するために、サンプル画像にズームインするためのボタンを。単一メートルを取得するためのボタンeasurement（5秒遅延は、サンプルを挿入するユーザのための時間を許可するように実装されています）。タイムラプス測定（6イメージは5秒間隔で採取されています）。ボタンは使用後に、デバイスの電源をオフにします。 Yenilmezから、許可を得て、再現し、 ら。 ⁸ この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

前記画像解析^{4、5、6、7、8}

1. 適切なサンプル（細胞分布または細胞型分離）するためのデバイスに含まれる画像解析ソフトウェアを実行します。
   注：自己完結型デバイスでは、分析が自動的に実行され、グラフィカル・ユーザ・インターフェース上に表示されます。スマートフォン対応機器については、分析を実行するために、ギャラリーaに行きます所望の動画ファイルを選択しNDが分析されます。
2. 画面上に表示された分析の出力を観察し、記録します。
   注：（例えば、鎌状赤血球症の診断など）の細胞分布分析のために、出力は、細胞集団の閉じ込めの幅です。
   注：（このようなWBCの識別など）の細胞型の分離のために、出力は、識別されたWBC集団とイメージとなります。マイクロリットル当たりの細胞の数を計算するために、2,000倍の画像あたりの白血球の平均数を乗算します。 5白血球が観察された場合、これは、10,000のWBC /μLを示すであろう。 11000のWBC /μL - 正常範囲は、一般的に3500であると考えられています。
3. あるいは1/2センチ約装置から試料管を移動させ、上記のように分析される他の画像を撮像して分析を繰り返します。
   注：これは、分析に5繰り返すことをお勧めします - エラーを回避するために、サンプルあたり6回。

Representative Results

鎌状赤血球症の診断に使用される技術である細胞密度分布分析のために、目的は、細胞集団の分布の幅を特定することです。鎌状赤血球疾患のない患者からの血液細胞は、予測可能な幅内に限定されます。鎌状赤血球症を有する患者からの細胞は、細胞分布の下方スキューで、広い領域にわたって分配される任意の特定の用途のために（ 図4参照 ）、閾値は、健康の対対照試料の分布幅との間で設定することができます^5、8 "病気のための陽性」「健康」との間のカットオフなどのサンプル。

図4：Densit を分析するための磁気浮上の例血液サンプル中の鎌状赤血球病の指標としてのyの分布。左側には、赤血球は、十分に狭い領域内に閉じ込められます。右側には、赤血球のサブセットが下向き分布をスキューと閉じ込めの幅を大きく、より高い密度、したがって、より低い浮上高さを達成します。スケールバー=200μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

サンプルの濃度分布を分析するために、計算アルゴリズムは、装置内で実施されます。まず、垂直および水平軸に沿った画素強度の勾配が計算されます。マグネットのエッジと毛細管エッジは、垂直方向の画素勾配プロファイルのピークとして検出されます。内側毛細管の端の間の距離は、ピクセル単位で0.7 mmとすることが知られており、従ってscaliとして使用されていますミリメートルの画素からの距離を変換するための係数をngの。セルが配置される水平軸に沿った画素強度勾配が最大です。この勾配プロファイルを分析し、ガウス曲線に適合されます。この曲線の値の4倍標準偏差を閉じ込め幅として報告されます。

図5の結果は、対照と鎌状赤血球症試料の両方のための閉じ込め幅を示しています。ここで、（50ミクロン以上）大きい閉じ込め幅のサンプルは、鎌状赤血球症が陽性とみなされるであろうと、そのしきい値以下のものは病気のために陰性であることが考えられるであろう。鎌状赤血球分布の分析の他の方法がら 、調査しYenilmezによって報告されていることに留意すべきです。 ⁸

フィギュア5： 鎌状赤血球症の診断のための閉じ込め幅の定量化。コントロール（n = 4の被験者を超える48画像）と鎌状赤血球症（N = 93画像10を超える科目を）赤血球の閉じ込め幅の実験結果。結果は、マン・ホイットニー・ウィルコクソン両側検定（正規近似、n = 3の_{1、N 2} = 10、Z = -2.6764、P = 0.0074）に応じて統計的に有意です。ウィスカは、サンプルからの最小値と最大閉じ込め幅がテスト表し、アスタリスクは、外れ値を表します。 Yenilmezから、許可を得て、再現し、 ら。 ⁸ この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

血液試料中の白血球を識別するために使用することができる粒子の分離については、目的は、2つの異なるpopulを同定することですations。集団は異なる密度を持っている場合は、それらが視野内に別個の領域で観察されます。従って、異なる密度を有する2つ以上の粒子の均一な集団を分離すると、複数の集団は、画像内の観察及び画像解析アルゴリズム^4を使用して検出することができ、浮上することができる（ 図6参照）。

2つの異なる細胞型の分離を分析するために、アルゴリズムが平衡状態にある2つの分離した集団を区別する実現されます。鎌状赤血球症の分析のために記載したのと同様に、2つのガウス分布のサンプルではなく、単一の曲線に適合しています。画素強度勾配における各ピークは、異なる細胞集団を表します。ガウス曲線の平均として両方与えるこのデータに適合（下部磁石の位置に対して）平均浮上高さのガウス曲線と曲線⁷の標準偏差として閉じ込め幅。

図6：明確な密度を有する微粒子の混合集団の磁気浮上の例。 （a）は、12.5から200 mMの範囲の5の異なるGdの濃度の浮上高さの微小球密度を関連付ける較正曲線。スロープは、このように大きな解像度（小さな密度差にすなわち感度）を提供する、のGdの最低濃度で最大です。スロープは、検出のより低い解像度で増加した範囲を実証し、Gdの高濃度の最安です。 （b）は 2分間かけて二つの異なる密度を有する均質なサンプル微小球体の時間依存分離。平衡（右）では、二つの別個のバンドが画像肛門によって検出されますysisアルゴリズム。 Yenilmezから、許可を得て、再現し、 ら。 ⁷ この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

任意の所与の用途のための異なる密度を有する個々の細胞型を同定するためには、まず予想浮上高さを定量化するために一度に一つの細胞型を浮上することが望ましいです。 図7aは、赤血球が溶解された血液サンプルから白血球の浮上高さを示しています。これは、さらなる分析のために白血球の閉じ込め領域を規定します。結果は、赤血球は、このように、白血球の浮上位置に基づいて、血液試料から区別することができる白血球および、より低い浮揚ことを示しています。ビューの任意のフィールド内の容積は0.5μLです。 1希釈された試料において：1,000、白血球の数/μLをカウントすることによって計算することができます。2000 ⁷倍のビューと乗算の分野における白血球の数。

図7： 全血中のWBCサイトメトリー。 （a）は、RBC溶解後の血液からのWBCの浮上。これは、白血球は、25 mMのGdの中の磁場中で浮上する範囲を定義します。 （b）は WBCカウント（青矢印で示されたWBC）の例を。トップフレームのインレイは、白血球を示し、ボトムフレームと下部フレームインレイは、RBC集団を示しています。 Yenilmezから、許可を得て、再現し、 ら。 ⁷ この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

プロトコル内の重要なステップ
このプロセスにおける重要な要素は、磁石の適切な位置合わせが含まれます。磁石が押しのけなったり、装置内に通常よりも多くを分離した場合、これは結果に影響を与えることができます。プロセスにおけるこの障害等を制御するために、密度制御された粒子は、ポリスチレン微小球などの経時変化を制御するために定期的に使用することができます。また、浮上時間は、細胞が平衡状態に到達させることが重要です。赤血球のために、10分のすべてのセルが平衡に到達させるのに十分です。しかし、より小さな粒子または細胞が平衡に達するのに長い時間を必要とし得ることに留意することが重要です。これは、5秒間隔でタイムラプス画像を撮影し、経時狭窄幅をプロットすることによって評価することができます。平衡が閉じ込め幅の変化は無視できる程度となる点として決定することができます。

プロトコル内の他の重要なステップは、事前を含みますこのよう正確な濃度でガドリニウム溶液のparationが大幅サンプル浮上高さに影響を与えます。これは、事前に行われ、ストック溶液から使用されるが、溶液及び濃度の意図しない増加の蒸発を防ぐため、適切にシールされなければならないことがあります。さらに、注意が使用され、細胞の健康状態を維持するために注意しなければなりません。指先を経由して描かれたヒトの血液のためには、採血の1時間以内に使用し、密封容器に保存することにより、乾燥させないようにする必要があります。静脈穿刺によって描かヒト血液については、サンプルを抗凝固剤とせいぜい一週間4℃で保存すべきである（エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、共通の抗凝固剤を、ここで使用しました）。接着細胞株の場合は、死んだ細胞は、前トリプシン処理し、細胞に培養物から徹底的に洗浄する必要があり、使用するまでインキュベートする必要があります。細胞の健康は、密度、したがって、浮上おいに影響を与えることが知られているので、浮上時の細胞の健康が重要ですトン。

修正およびトラブルシューティング
私たちは、磁場中で予測可能な場所で二つの異なる密度の細胞の分離および閉じ込めを実証しました。他のアプリケーションにこの技法を拡張するために、常磁性媒体の異なる製剤は、代替アプリケーション³の検出の所望の範囲を得るために使用され得ます。ガドリニウムの濃度は、（ 図6aを参照してください）検出の分解能だけでなく、範囲を支配します。ガドリニウムの高い濃度は、細胞に適用した磁気力の強度、懸濁溶液中のガドリニウムの高い濃度を増加させるため、より小さな浮上高さの差は、細胞密度の差のためであろう。これは、細胞密度のわずかな違いを区別する能力として定義される解像度を制限するが、それは分析することができる濃度の範囲を増加させますD。同様に、ガドリニウムの濃度を減少させると、分解能を増加させるが、検出の範囲を減少させます。さらに、媒体の密度は、上下検出限界をシフトするように変更することができます。浮上高さを制御する第2の力は、懸濁媒体のそれと比較して細胞の相対密度に依存する浮力です。ここで、水性懸濁溶液を用いて（低密度または密度の高い細胞は、それぞれ、中心線の上または下に浮上を有する2つの磁石間の中心線における媒体浮揚と同じである濃度でその細胞を意味し、使用されています前述のように磁力によって制御範囲）。浮力は、相対密度に依存するため、媒体の密度を増加させることは、細胞密度の高い領域に検出範囲をシフトします。同様に、低密度の媒体を使用して細胞密度の低い領域に向かって検出範囲をシフトします。< / P>

我々はまた、毛細管幅（毛管幅を横切る距離で流れる粒子のすなわち確率）にわたって正規化された粒子数を定量することによって、フローアシスト磁気集束装置の性能を調べました。低い流量は、粒子のより多くの閉じ込めを有するが、大容量のサンプル中の希少な物体検出のための欠点であることができる低い体積スループットをもたらします。しかし、これは、磁場中で以上の磁石を介して複数回通過することによって対処することができます。複数の細胞型間の分離はまた、磁場の終わりに、マイクロ流体分離器を利用して異なる密度の粒子を分離するために、将来の研究に活用されてもよいです。

複数の細胞型を分離する際には、平均高さと均質な集団を浮上する前に、各細胞型の範囲を確立するために、個々の集団を浮揚するために有用であり得ます。

e_content ">テクニックの制限事項
ここに提示プロセスは、異なる密度の粒子の分離に制限されます。複数の細胞型の信頼できる識別を達成するために、重複しない個別の密度範囲を有することが重要です。さらに、検出することができる粒子のサイズは制限されています。彼らは、マイクロキャピラリーチューブ内を自由に動くことができなければならない - 200μmの粒径上の推奨上限です。さらに、粒子が明確に画像化されるのに十分な大きさでなければならない - 5μmの直径上の範囲の下限です。

既存の/代替方法に関して技術の意義
細胞解析へのこのアプローチは、オンサイトのユーザーフレンドリーな分析を可能にする、シンプルです。多くの医療診断手順は、臨床検査室で行わなければならないおよび検査機器、訓練を受けた実験室specialisの処理手順を専門に必要トン。しかし、このプロトコルは、医療クリニックによりアクセス可能な簡単な装置を必要とします。試料調製は簡単であり、分析には、ユーザーエラーのリスクを最小化する、自動化されています。

このデバイスは、種々の医学的状態のための迅速な、オンサイト試験を可能にします。デバイスは、ユーザーフレンドリーな、ラベルフリー、およびポータブル、ポイント・オブ・ケア疾患の診断のために最適ですです。リモート臨床検査の現在の標準と比較すると、このアプローチは、迅速に患者のケアに関する情報に基づいた意思決定を行うために医師を可能にし、潜在的ケアの遅れに起因する合併症を防ぐことができます。プラットフォームは、臨床設定でこの方法の普及を可能にし、発展途上国や医療への世界的なアクセス性を向上させる、容易にアクセス可能で安価な部品を使用して設計されています。

このテクニックをマスターした後、将来のアプリケーションや行き方
ことに注意することが重要ですここで説明するテストは、まだ大規模な患者集団で検証されていません。現在までに、鎌状赤血球症の診断は、小さい患者コホート^2、5で確認されており、WBCサイトメトリーは、概念実証として実証されています。これらのアプリケーションと、将来的に開発されたものを用いた臨床試験は、前臨床使用には、この方法を検証するために行われますが、ここで示された結果は、ポイントオブケア臨床診断のためのこの技術と技術の最終的な使用のための約束を示しておく必要があります。

密度ベースのサイトメトリー分析のためにこのアプローチを使用すると、最終的には、追加の疾患の診断用途に拡張することができます。ここに記載されるように、疾患の診断のための単一細胞の磁気浮上のこのアプローチは、患者の細胞の単一細胞懸濁液を起因使用解像度の制限が、現在のシステムを使用して画像化することができる細胞の使用を必要としますスマートフォンのカメラまたは低コストの光学系。さらに、この技術は、次のいずれかの条件を満たす疾患に適用されます。関心の（ⅰ）細胞、彼らは健康な対照と比較して、病気を運ぶときに変更された密度を達成しなければならないこと、（ii）細胞密度の変化は、の添加により誘導可能である必要があります試薬（または任意の利用可能な代替治療）、または（iii）の診断は、固有の密度を有するいずれか、本質的に、またはいくつかの治療を経由して、単一のサンプル中の異なる細胞タイプを識別する伴う必要があります。同じプラットフォームのデバイスを使用して、他の疾患への将来のアプリケーションは、世界の健康に多大な影響を与える可能性があります。これらの密度によって区別される生物学的成分の検出を含むことができます。細胞死を受けている特定の細胞型、細胞、および疾患細胞は、すべての固有の密度シグニチャしたがって異なる磁性パターンを有することが示されており、したがって定量化することができ、このプラットフォームを使用して分離しました。非常に少数の細胞はBもできますeが流れアシスト磁気浮上装置内の流体の流れを活用することで検出しました。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gadavist (Bayer)	Jefferson Medical and Imaging	2068062	Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 ml vials with 15/ca.
Square glass microcapillary tubes	Vitrocom	8270	50 mm length is sufficient
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	S9000	Chemical formula: Na2S2O5
Leica Microsystems Critoseal tube sealant	Fisher Scientific	02-676-20
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9269 SIGMA
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Or other reagent as recommended for the cell type used
MICROLET 2 Adjustable Lancing Device	Walgreens	246567	Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols
Microlet Lancets	Walgreens	667474	Must be dispoable and not reused
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-6	Or any preferred method for cell counting
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A1049201