Bioengineering

Магнитной левитации В сочетании с Портативный визуализации и анализа для заболевания Диагностика

Published: February 19, 2017 doi: 10.3791/55012

Stephanie M. Knowlton¹, Bekir Yenilmez², Reza Amin², Savas Tasoglu^1,2

¹Biomedical Engineering Department, University of Connecticut, ²Mechanical Engineering Department, University of Connecticut

Introduction

Здесь мы представляем технологическую платформу и методику, которая использует магнитную левитацию в сочетании с автоматизированной обработки изображений и анализа для анализа распределения плотности клеток пациента в качестве показателя заболевания. Этот универсальный подход для цитометрии анализа плотности на основе могут в конечном счете быть применены к диапазону диагностики заболеваний. Однако для того, чтобы быть совместимым с пунктом оказания медицинской помощи тестирования и использования в развивающихся странах, методика должна удовлетворять требованиям, предъявляемым к низкой стоимости, портативности и удобства использования. Устройство и расходные материалы должны быть легко получены при низкой стоимости. Подготовка образца должна быть простой, анализ должен быть автоматизированы с минимальными требованиями для ввода или интерпретации пользователем, и результаты должны быть возвращены быстро. Кроме того, устройство должно быть компактным и портативным, чтобы быть полезным в клинических условиях, а также развивающихся стран. Таким образом, мы разработали устройство и способ для использования магнитной левитации в пункт-ухода-совместимой Technolлогии с помощью визуализации и анализа изображений сочетания автоматизированы для возврата результатов относительно распределения плотности популяции клеток пациента.

Точка оказания медицинской помощи технологии предлагают заметное преимущество по сравнению с современными клинических процедур лабораторных испытаний. Технология, доступная в настоящее время слишком дорого, чтобы принадлежать клинициста или слишком сложны, чтобы осуществляться медицинским персоналом. Многие из этих процедур требует трудоемких протоколов, которые должны быть выполнены квалифицированным специалистом. По этим причинам, образцы пациентов, такие как кровь или моча, как правило, собираются в кабинете врача затем переданы на удаленный, централизованное тестирование лаборатории для клинических испытаний, которая может занять несколько дней для врача, чтобы получить результаты теста. Это может привести к задержкам или осложнений в процессе лечения в некоторых случаях, делает это тестирование очень дорогостоящим и неэффективным (в результате чего финансовое бремя на плательщиков страховых), а в дальнейшем делает многодиагностика недоступных в условиях ограниченных ресурсов и развивающихся стран.

Здесь мы представляем магнитную технику левитации в сочетании с автоматизированной обработки изображений и анализа как устройства со встроенной визуализации и обработки (рисунок 1) и смартфон-совместимого устройства (рисунок 2). Эти магнитные устройства левитации на основе представл ют собой широко применимой технологии платформы, которая имеет потенциал, чтобы быть применены к ряду различных медицинских диагностических применений. Магнитные функции подход левитации на основе равновесия между двумя силами: магнитной силы и силы плавучести , ^{^1,} ^{^2,} ^3. Когда частица суспендируют в парамагнитной среде и встраивают в магнитное поле, создаваемое двумя магнитами с одноименными полюсами обращены друг к другу, магнитная сила действует на частицу в направлении к осевой линии между двумя MAGN ЭТС. Выталкивающая сила обусловлена относительной плотности частицы по сравнению с суспензионной среды и вверх в случае частиц менее плотной, чем среды и вниз в случае частиц более плотных, чем окружающая среда. На основании этих двух сил, частицы достигнет положения равновесия левитации в поле, которое уравновешивает эти две силы; это положение непосредственно связано с плотностью частицы, с более плотные частицы, левитирующих ниже в поле, чем менее плотных частиц. Модуль формирования изображения, либо встроенный в смартфон камеры ^{^4,} ^{^5,} ⁶ или независимых оптических компонентов , оборудованных увеличительных линз ^{^7,} ^8, используются для визуализации положения частиц. Обработка изображений, либо с помощью приложения смартфон ^{^4,} ^{^5,}= "Xref"> 6 или встроенный блок обработки ^{^7,} ^8, а затем обрабатывает захваченные изображения для количественной оценки пространственного распределения и, следовательно, распределение плотности населения. Для анализа больших проб (например, те , с помощью всего нескольких частиц , представляющих интерес на миллилитр, поток может быть встроен непосредственно в устройство таким образом, частицы левитации и анализируют , как они проходят через область изображения (рисунок 2).

Рисунок 1: Автономный магнитной левитации платформы. (А) Компактный магнитной левитации устройство , включающее магнитный модуль фокусировки, компоненты визуализации (светоизлучающий диод (LED), оптический объектив и датчик камеры), и блок обработки с экрана дисплея. (Б) напряженности магнитного поля в CROSS сечение области между магнитами, где вставлена образец. Напряженность поля максимальна на поверхности магнитов и приближается к нулю при средней линии между ними. (С) частицы, такие как клетки, в опыте магнитное поле нескольких сил: магнитная сила (F _м) по направлению к средней линии между магнетизмом, с величиной определяется в зависимости от положения частицы; гравитационная сила (F _г ') , которая зависит от плотности частиц относительно что суспендирующей среды, и сила сопротивления (F _d) сопротивление движению частиц. Воспроизводится с разрешения от Yenilmez и др. ⁸ Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
инжирЮр 2: смартфон-совместимый поток при содействии магнитной левитации платформы. (А - с) Передний (а), боковой (б) и обратно (с) вид на магнитной левитации устройства (D) компоненты устройства включают в себя: 1) Магнитный модуль левитации, в том числе постоянных магнитов, увеличительных линз, и светодиод и рассеиватель света, 2) смартфон кейс, 3) электроники, в том числе микроконтроллера, привода насоса, и приемник Bluetooth, 4) держатель микро-насос, 5) регулируемое отверстие, 6) держатель трубки отходов, 7) держатель батареи, 8 ) держатель образца, 9) двойного назначения подставка и крышка. (Е) Проточная схема, показывающая накачку образца через магнитное поле. (Е) Поперечное сечение магнитного модуля левитации, показывающий , как частицы различной плотности будут выровнены , поскольку они прокачивают через поле; менее плотные частицы, такие как частицы 1, будет уравновешиваться при более высокой левитации высоты тхань более плотные частицы, такие как частицы 2. Воспроизводится с разрешения от Амина, и др. ¹ Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Минимальные требования для использования любого образца для анализа распределения плотности в этой системе включают в себя возможность получения суспензии клеток или частиц больше, чем приблизительно 5 мкм и менее приблизительно 250 мкм (для визуализации и обработки изображений) и его совместимости с смешивание в растворе парамагнитного раствора, такого как Гадобутрол, используемого здесь. Для диагностики заболевания, совместимые приложения включают в себя те, в которых (I) клетки интерес по своей природе имеют измененную плотность, когда они несут болезни по сравнению с здоровой контрольной группы, (II) изменение плотности можно индуцировать в клетке путем добавления реагента или некоторых альтернативное лечение на короткое замыканиевремя cubation, или (III) различные типы клеток выявляются в одном образце и по своей природе (или через какой - либо обработки) имеют уникальные характерные плотности.

Серповидноклеточная болезнь является генетическим расстройством вызывает мутировавший форму гемоглобина, HbS, чтобы быть произведены в красных кровяных клетках человека (RBCs), что может привести к прерывистой вазо-окклюзионные событий и хроническая гемолитическая анемия ^9. Поставлен диагноз с использованием либо гемоглобина изоэлектрического фокусировки, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) фракционирование или электрофореза гемоглобина, которые обладают высокой точностью, но должны быть выполнены в клинической лаборатории тестирования, поскольку они несовместимы с точки зрения ухода настроек. Растворимость и бумажные тесты для серповидно-клеточной анемии были предложены, но как правило, требуют субъективную интерпретацию пользователя и подтверждающее тестирование. Здесь мы используем подход плотности на основе для выявления серп RBCs, что достичь более высокой плотности, чем РБCs от людей без серповидно-клеточной анемии. Механизм включает полимеризацию мутантной формы гемоглобина, HbS, что приводит к обезвоживанию RBC в серповидных эритроцитах анемией при дезоксигенированных условиях ^{^10,} ^{^11,} ^{^12,} ^13.

Такой подход плотности на основе также может быть применен для разделения клеток различных типов на основе плотности: белых кровяных телец (WBCs) и эритроцитах ^7. Лейкоциты, как правило, отвечают за борьбу с инфекциями в организме. WBC в цитометрии может быть использован для количественного определения количества этих клеток в крови и служит полезным диагностическим инструментом. WBC считает выше нормы (как правило, считается более 11000 клеток на мкл) может указывать на инфекцию, нарушения иммунной системы, или лейкоз. Числа лейкоцитов ниже нормального диапазона (около 3500 клеток на мкл), может быть вызвано аутоиммунными нарушениями или Conditионы, которые повреждение костного мозга. В отличие от альтернативных технологий, процесс, представленный здесь не полагается на лизиса эритроцитов или пятен с целью выявления лейкоциты. Этот тест на основе клеток использует преимущества уникальных присущих плотностей двух типов клеток для выполнения разделения, так как плотность населения WBC, как сообщается, будет ниже , чем у населения RBC, вычисленной ранее с использованием центрифугирования в градиенте плотности ^{^2,} ^3.

По сравнению с альтеративного тестирования в удаленных местах, этот тест является быстрым, с простой подготовки проб (рисунок 3), разделение клеток в устройстве в течение 10 - 15 мин, и автоматизированный анализ изображений и который требует меньше чем 1 мин. Таким образом, устройство может возвращать результаты быстро, чтобы лучше информировать медицинских решений, позволяют лечение следует вводить немедленно, чтобы облегчить физическую и психологическую боль, а также снизить риск возникновения осложнений associованные с задержкой в медицинской помощи. Эта техника может быть выполнена на месте либо в клинических условиях из-за простой подготовки проб и автоматизированной обработки изображений и анализа, который возвращает результат с минимальным входом или интерпретации пользователем. Из-за использования простого подхода с использованием постоянных магнитов для анализа проб и использование либо смартфона или простых электрических компонентов для визуализации и обработки изображений, устройство, а также затраты на-теста являются минимальными по сравнению с некоторыми сложными процедурами тестирования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этическое Заявление: Все процедуры, связанные образцы крови человека были проведены в соответствии с институциональными нормами. Все протоколы были рассмотрены и одобрены Советом по рассмотрению Institutional. Информированное согласие было дано всеми участниками.

1. Подготовка образцов для серповидноклеточная заболеваний Диагностика ^{^5,} ⁸

Готовят 50 мМ раствора Гадобутрол в Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS).
Растворить 10 мМ метабисульфит натрия в растворе гадолиний.
Примечание: метабисульфит натрия токсичен при вдыхании и сильно раздражает кожу и ткани. Это едкие кислоты при смешивании с водой. Он может разлагаться выделять токсичные газы оксидов серы и натрия при нагревании до высокой температуры.
Получение пробы крови через любой или венепункции пальца.
1. Нарисуйте кровь, используя устройство для прокалывания пальца с чистой одноразовой ланцет. Apслойные давление вблизи пробитой участка и протрите капли крови, образованную в три-четыре раза до сбора крови с помощью пипетки; заботиться, чтобы не "молоко" палец, сжимая ткань, так как это приведет к загрязнению образца с тканевой жидкостью.
2. В качестве альтернативы, использовать кровь с использованием стандартных процедур ¹⁴ венепункции.
  Примечание: Если образцы будут храниться в течение более нескольких часов, собирают кровь в Vacutainer с антикоагулянтом, таким как ЭДТА.
Добавить менее 1 л крови, к 100 мкл раствора метабисульфита гадолиний-натрия.

2. Подготовка образцов для WBC цитометрии ⁷

Получить образец крови либо через или венепункции пальца, как и в разделе 1.
Дополнительно: Lyse Эритроциты с буфером для лизиса эритроцитов. Пипетка 5 мкл крови в 500 мкл буфера для лизиса эритроцитов и инкубировать при комнатной температуре в течение 3 - 5 мин.
ЗАМЕТКА:это может быть сделано, чтобы подтвердить выбор левитации изолированной популяции ЗБС. Тем не менее, нет необходимости, чтобы выполнить этот шаг, так как результаты, представленные здесь, показывают, что Эритроциты левитировать в отчетливо низком положении, чем WBCs.
Развести цельной крови 1: 1000 в 25 мМ Б-га в HBSS
Примечание: если лизис клеток проводили, разбавленные лизированных образец 9: 1 лизируют образец: 250 мМ Б-г с получением образца, содержащего 25 мМ Gd.

3. Анализ проб с использованием магнитной левитации платформы ^{^4,} ^{^5,} ^{^6,} ^{^7,} ⁸

Запустите магнитное устройство левитации:
1. Для автономного устройства, подключите устройство, дайте ему власть, и поместить на ровную поверхность.
2. Для смартфона-совместимой версии запустите приложение смартфона и проведите пальцем влево, чтобы войти на изображениережим захвата, и место на ровную поверхность.
Для статического магнитного левитации:
1. Загрузите подготовленный образец в микрокапиллярной трубки квадратного стекла путем погружения конца в раствор и позволяет образец для заполнения капилляра с помощью капиллярного действия.
2. Уплотнение конец с герметиком трубкой, медленно толкая один конец капилляра в материал.
3. Вставьте капилляр между магнитами магнитного устройства левитации , так что только 1 см трубки остается видимой (см Рисунок 3 для иллюстрации приготовления образца).
  Примечание: Этот шаг остается одинаковым для обоих устройств смартфон-совместимым и самодостаточного.
4. Подождите 10 минут, не мешая устройства или капилляр.
Для потока при содействии магнитной левитации:
1. Загрузите образец в пробирку.
2. Подсоедините впускной трубопровод между контейнером образца и миcrocapillary и соедините выпускной трубопровод между микрокапилляр и контейнер для отходов.
3. Установка светодиодных параметров интенсивности и потока.
Убедитесь в том, что клетки видны в поле зрения, а затем нажмите кнопку съемки, чтобы сделать снимок (кнопка 3 на автономный устройства и кнопка камеры на нижней части экрана в приложении смартфона).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если USB используется для хранения изображений, создайте папку с именем "изображения" и вставьте USB перед включением устройства. Если нет диска не присутствует, то устройство будет сохранять изображения во внутренней памяти и переданы позже.
Примечание: Несколько изображений могут быть захвачены и проанализированы с целью уменьшить риск аномалий путем перемещения капилляра в или около ½ см между захватом изображения.
Примечание: Если количество клеток в поле зрения является слишком высокой или слишком низкой (как выявляются и регистрируются на пользовательском интерфейсе), переложить капилляр в или из устройства или подготовить другой саmple.
Извлеките образец и выбросить образец в соответствии с институциональными или местными правилами. Капилляры следует утилизировать как острые.

Рисунок 3: Подготовка образцов и пользовательский интерфейс. (А) Процедура подготовки образца включает прокалывания пальца субъекта, образуя капельку крови, передавая капли крови в раствор тестирования пробы, перемешивая пробу и загрузка в капиллярной трубке с помощью капиллярного действия, и вставив образец в магнитной левитации устройство. (Б) эти примеры стадии получения также отображаются на экране устройства для направления подготовки образца. (С) Устройство включает в себя четыре кнопки: кнопка для увеличения в образец изображения для того , чтобы правильно настроить фокус с помощью ручки регулировки; кнопку, чтобы получить одно ммерка (в 5 сек задержка реализуется, чтобы дать время для пользователя, чтобы вставить образец); измерение замедленной (6 изображений принимаются на 5 с интервалами); и кнопка для выключения питания устройства после использования. Воспроизводится с разрешения от Yenilmez и др. ⁸ Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

4. Анализ изображения ^{^4,} ^{^5,} ^{^6,} ^{^7,} ⁸

Запуск программного обеспечения для анализа изображений включены в устройство для соответствующего образца (распределения клеток или разделения типа клеток).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для автономного устройства, анализ выполняется автоматически и отображается на графическом пользовательском интерфейсе. Для смартфона-совместимого устройства, чтобы выполнить анализ, перейдите в галерею аН.Д. выбрать нужный файл видео, который необходимо проанализировать.
И записывают вывод анализа отображаются на экране.
Примечание: Для анализа распределения клеток (например, серповидно-клеточная болезнь диагностики), выход будет ширина удержания популяции клеток.
Примечание: Для разделения типа клеток (например, идентификация WBC), на выходе будет изображение с WBC населения идентифицированной. Для того, чтобы вычислить количество клеток на микролитр, умножить среднее количество лейкоцитов каждого изображения на коэффициент 2,000. Например, если наблюдались 5 лейкоциты, это будет означать, 10000 лейкоциты / мкл. Нормальный диапазон, как правило, считается 3500 - 11 000 Лейкоциты / мкл.
Повторить анализ путем перемещения образца в пробирку или из устройства около ½ см и захватывая еще одно изображение, чтобы проанализировать, как описано выше.
Примечание: Рекомендуется повторить анализ 5 - 6 раз на пробу, чтобы избежать ошибок.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для анализа распределения плотности клеток, которая является метод используется для диагностики серповидно-клеточной болезни, цель состоит в том, чтобы определить ширину распределения популяции клеток. Клетки крови у пациентов без серповидно-клеточной анемии будет ограничена в пределах предсказуемой ширины. Клетки от пациентов с серповидно - клеточной анемии будут распределены по всей широкой области, с нисходящим перекоса в распределении клеток (см Рисунок 4.) Для любого конкретного применения, порог может быть установлен между шириной распределения контрольных образцов в сравнении у здоровых образцы как отсечка между "здоровой" и "позитивной для болезни" ^{^5,} ^8.

Рисунок 4: Пример магнитной левитации для анализа DENSITу Распределение как индикатор для серповидно-клеточной болезни в образцах крови. Слева, эритроциты хорошо заключены в узкой области. Справа, подмножество красных кровяных клеток достигают большей плотности и, следовательно, меньшую высоту левитации, искажая распределение вниз и увеличения ширины удержания. Шкала бар = 200 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Для анализа распределения плотности образца, вычислительный алгоритм реализован в устройстве. Во-первых, интенсивность пикселя градиенты вдоль вертикальной и горизонтальной осей вычисляются. Магнитные края и капиллярные края детектируются как пики в вертикальных профилей градиента пикселей. Расстояние между внутренними краями капиллярных, в пикселях, как известно, 0,7 мм, и, следовательно, используется в качестве Scaliнг фактор для преобразования расстояния от пикселей в миллиметры. Градиент интенсивности пикселей вдоль горизонтальной оси, является наибольшей, когда клетки расположены. Этот профиль градиента анализируется и подходит к кривой Гаусса. Значение 4 раза стандартное отклонение этой кривой сообщается как ширина удержания.

Результаты на рисунке 5 показаны ширины конфайнмента как для контроля и образцов заболеванием клетки серпа. Здесь, образцы с большей шириной удержания (более 50 мкм), будет считаться серповидно-клеточной анемии положительным и тех, кто ниже этого порога будет считаться отрицательным для заболевания. Следует отметить , что другие методы анализа серпа распределения клеток были изучены и сообщили Yenilmez, и др. ⁸

Рисунок 5
фигура5: Количественная конфайнмента Ширина для серповидноклеточная заболеваний Диагностика. Экспериментальные результаты для ширины удержания контроля (п = 48 изображений в течение 4-х предметов) и серповидно-клеточная анемия (п = 93 изображения более 10 предметов) красных кровяных телец. Результаты являются статистически значимыми в соответствии с Манна-Уитни-Вилкоксона двустороннего критерия (нормального приближения, N ₁ = 3, N ₂ = 10, Z = -2,6764, р = 0,0074). Усы представляют собой минимальные и максимальные ширины удержания из образцов испытано и звездочками представляют собой выбросы. Воспроизводится с разрешения от Yenilmez и др. ⁸ Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Для разделения частиц, которые могут быть использованы для идентификации лейкоцитов в образцах крови, цель состоит в том, чтобы определить два различных Populations. Если популяции имеют различную плотность, они будут наблюдаться в различных регионах, в поле зрения. Таким образом, однородные популяции двух или более частиц с различными плотностями можно левитировать и, при разделении, многочисленные популяции можно наблюдать в изображении и обнаружить с помощью алгоритма ⁴ анализа изображения (рисунок 6).

Проанализировать разделение двух различных типов клеток, алгоритм реализуется, различающий две обособленные популяции в равновесии. Аналогичным образом, как описано для анализа клеточной болезни серп, два гауссовым распределением подходят к образцу, а не единой кривой. Каждый пик градиентов интенсивности пикселей представляет собой различные популяции клеток. Гауссовские кривые подходят к этим данным, как дают среднюю высоту левитации (по отношению к положению нижнего магнита) как среднее значение кривой Гаусса иконфайнмент ширина как стандартное отклонение кривой ^7.

Рисунок 6: Пример магнитной левитации из смешанной популяции микрочастицами с отчетливым плотностях. (А) Калибровочные кривые , коррелирующие плотность микросфер с высотой левитации в пяти различных концентрациях Gd в диапазоне от 12,5 до 200 мМ. Наклон является наибольшей при самых низких концентрациях Gd, таким образом обеспечивая более высокое разрешение (т.е. чувствительность к различиям малой плотности). Наклон является самой низкой для более высоких концентраций Б-га, демонстрируя повышенную дальность обнаружения, но с более низким разрешением. (Б) в зависимости от времени разделения однородного образца микросфер с двумя различными плотностями в течение двух минут. В состоянии равновесия (справа), две отдельные полосы обнаруживаются анальных изображениялиз алгоритм. Воспроизводится с разрешения от Yenilmez и др. ⁷ Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Для того чтобы идентифицировать отдельные типы клеток с различными плотностями для любого конкретного применения, то целесообразно сначала левитировать один тип клеток, в то время, чтобы количественно оценить ожидаемую высоту левитации. На рисунке 7а показывает высоту левитации WBCs из образца крови , в которой были лизированных эритроциты. Это определяет область удержания ЗБС для дальнейшего анализа. Результаты показывают, что Эритроциты левитировать ниже ЗБС и, таким образом, лейкоциты можно отличить от образцов крови на основе позиции левитации. Объем в любом заданном поле зрения составляет 0,5 мкл. В образцах, которые разводили 1: 1000, количество лейкоцитов / мкл можно рассчитать путем подсчетаколичество лейкоцитов в поле зрения и умножив на коэффициент 2,000 ^7.

Рисунок 7: WBC цитометрии в цельной крови. (А) Левитация ЗБС из крови после лизиса эритроцитов. Это определяет диапазон, в котором лейкоциты левитации в магнитном поле в 25 мМ Б-га. (Б) Пример подсчета WBC (лейкоциты отмечены синими стрелками). Верхняя рама декор показывает лейкоциты и нижняя рама и нижняя рама декор показывает население RBC. Воспроизводится с разрешения от Yenilmez и др. ⁷ Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Критические шаги в рамках Протокола
Критические факторы в этом процессе, включают надлежащее выравнивание магнитов. Если магниты сместиться или разделены больше, чем обычно в пределах устройства, это может повлиять на результаты. Для контроля за этой ошибки или других в процессе, плотность контролируемой частиц, такие как полистирол микросферы, могут быть использованы периодически контролировать для изменений с течением времени. Кроме того, время левитации важно, чтобы позволить клеткам достичь равновесия. Для красных кровяных клеток, 10 мин достаточно, чтобы все клетки для достижения равновесия. Тем не менее, важно отметить, что более мелкие частицы или клетки могут потребовать более длительного времени для достижения равновесия. Это можно оценить, принимая Промежуток времени изображения в течение 5 с интервалом и черчения ширину удержания в течение долгого времени; Равновесие может быть определена как точка, в которой происходит изменение ширины удержания незначительна.

Другие важные шаги в рамках протокола включают предварительноторных раствора гадолиния в точной концентрации, как это в значительной степени влияет образец высоты левитации. Это может быть сделано раньше времени и использовали из исходного раствора, но должны быть запечатаны должным образом, чтобы избежать испарения раствора и непреднамеренное повышение концентрации. Кроме того, необходимо соблюдать осторожность для поддержания состояния здоровья клеток, используемых. Для человеческой крови, отобранной с помощью пальца, он должен быть использован в течение одного часа взятия крови и не дают высохнуть при хранении в закрытой посуде. Для человеческой крови, отобранной в венозную, образцы следует хранить при температуре 4 ° С в течение не более чем на одну неделю с антикоагулянтами (этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), общий антикоагулянта, был использован здесь). Для адгезивных клеточных линий, мертвые клетки должны быть тщательно вымыты из культуры до начала обработки трипсином и клетки должны быть инкубировали до использования. Здоровье клеток во время левитации имеет решающее значение, так как здоровье клеток, как известно, влияет на плотность и, следовательно, левитации Heighт.

Модификации и устранение неисправностей
Мы показали, разделение и удержание клеток двух различных плотностей в атрибутивный местах в магнитном поле. Для того чтобы расширить эту технику для других применений, могут быть использованы в различных формулировках парамагнитной среды , чтобы получить желаемый диапазон обнаружения для альтернативных применений ^3. Концентрация гадолиния регулирует разрешение обнаружения, а также диапазон (см Рисунок 6а). Поскольку более высокие концентрации гадолиния увеличить силу магнитного силы, приложенной к клеткам, тем больше концентрация гадолиния в растворе суспендирующие, тем меньше разница в высоте левитации будет для какой-либо разницы в плотности клеток. В то время как это ограничивает разрешение, определяемое как способность различать небольшие различия в плотности клеток, что увеличивает диапазон плотностей, которые можно анализироватьd. Аналогичным образом, снижение концентрации гадолиния увеличивает разрешение, но уменьшить диапазон обнаружения. Кроме того, плотность среды может быть изменена, чтобы сдвинуть пределы обнаружения вверх или вниз. Вторая сила, которая контролирует высоту левитации выталкивающая сила, которая зависит от относительной плотности клетки по сравнению с суспендирующей среды. Здесь используется раствор на водной основе суспендирующий, а это означает, что клетки с плотностью, которая является такой же, как в средней парит на средней линии между двумя магнитами с менее плотным или более плотные клетки левитации выше или ниже средней линии, соответственно (с диапазон управляется магнитной силой, как было описано ранее). Поскольку выталкивающая сила зависит от относительной плотности, увеличение плотности среды будет смещаться диапазон обнаружения до более высокого диапазона плотности клеток. Аналогичным образом, с использованием более низкой средней плотности сместит диапазон детектирования по направлению к нижней части диапазона плотности клеток. < / Р>

Кроме того, мы исследовали эффективность устройства магнитной фокусировкой потока при содействии с помощью количественного анализа нормализованное количество частиц по ширине капиллярной (т.е. вероятность частицы потоку на расстоянии по ширине капилляра). Более низкие скорости потока имеют больше удержания частиц, но приводят к снижению пропускной способности объема, который может быть недостатком для редкого обнаружения объекта в образцах большого объема. Тем не менее, эту проблему можно решить с помощью нескольких проходов в магнитном поле или через более длительные магнитов. Разделение между несколькими типами клеток также могут быть использованы в дальнейших исследованиях, чтобы изолировать частицы различной плотности за счет использования микрожидком сепаратора в конце магнитного поля.

При разделении нескольких типов клеток, это может быть полезно для левитации каждой популяции в отдельности для того, чтобы установить среднюю высоту и диапазон каждого типа клеток перед левитации гомогенную популяцию.

e_content "> Ограничения техники
Процесс, представленный здесь ограничивается разделения частиц различных плотностей. Для достижения надежной идентификации нескольких типов клеток, важно, что они имеют диапазоны дискретные плотности, которые не перекрываются. Кроме того, частицы, которые могут быть обнаружены ограничены в размерах. Они должны иметь возможность свободно перемещаться в пределах микрокапиллярной трубки - 200 мкм рекомендуемый верхний предел диаметра частиц. Кроме того, частицы должны быть достаточно большими, чтобы быть отображены четко - 5 мкм рекомендуемый нижний предел диаметра.

Значимость техники в отношении существующих / альтернативных методов
Такой подход к анализу клеточного прост, что позволяет удобный анализ на месте. Многие медицинские диагностические процедуры должны проводиться в клинических лабораториях и требуют специализированного испытательного оборудования и процедур, выполняемых квалифицированным лабораторным Specialisт. Тем не менее, этот протокол требует простого устройства, которое является более доступным для клиник здравоохранения. Подготовка пробы проста и анализ автоматизирован, сводя к минимуму риск ошибки пользователя.

Это устройство позволит быстро, на месте тестирования для различных медицинских условий. Устройство удобно, этикетки, свободной, и портативный, что делает его идеальным для пункта оказания медицинской помощи диагностики заболеваний. По сравнению с текущим стандартом дистанционного клинического лабораторного тестирования, такой подход позволит врачам быстро принимать обоснованные решения относительно ухода за пациентами и потенциально предотвратить развитие осложнений в связи с задержками в уходе. Платформа была разработана с легко доступными и недорогими компонентами, что позволяет широкое применение этого метода в клинических условиях и в развивающихся странах и повышение глобальной доступности к медицинскому обслуживанию.

Будущие приложения или направления после освоения этой технике
Важно отметить, чтоИспытания, описанные здесь, пока не подтверждено на популяции пациентов крупномасштабной. На сегодняшний день диагноз серповидно - клеточная болезнь была подтверждена в небольшой группе пациентов ^{^2,} ⁵ и WBC цитометрии было продемонстрировано , как доказательство концепции. Клинические испытания с этими приложениями и разработанные в будущем должны быть выполнены для того, чтобы подтвердить этот метод до клинического применения, но результаты, представленные здесь, показывают обещание для возможного использования этой технологии и техники для точки зрения оказания медицинской помощи клинической диагностики.

Используя этот подход для анализа цитометрии плотности на основе может в конечном счете быть продлен до дополнительных диагностических применений заболеваний. Такой подход магнитной левитации отдельных клеток для диагностики заболевания, как описано здесь, требует использования одноклеточных суспензий клеток пациента и к клеткам, которые могут быть визуализируют с помощью существующей системы с ее ограничениями на разрешение из-за использованияиз камеры смартфона или недорогой оптики. Кроме того, этот метод применим к заболеваниям, которые удовлетворяют одному из следующих условий: (I) клетки интерес должен достичь измененное плотности, когда они несут болезни по сравнению с здоровой контрольной группы, (II) изменение плотности клеток должна быть индуцируемым добавлением реагент (или любой другой доступный альтернативный метод лечения), или (III) диагностический должен включать в себя определение различных типов клеток в одном образце, либо по своей природе, или через какой-либо обработки имеют уникальные плотности. Будущие приложения к другим болезням с использованием того же устройства, платформа может иметь огромное влияние на глобальное здоровье. Они могут включать в себя обнаружение биологических компонентов, которые отличаются по плотности. Определенные типы клеток, клеток, которые претерпевают гибель клеток, и больные клетки все было показано, чтобы иметь уникальные сигнатуры плотности и, следовательно, различные магнитные узоры, и, следовательно, могут быть определены количественно, и разделены с использованием этой платформы. Клетки в очень малых количествах также может бе обнаружены путем использования потока текучей среды в устройстве магнитной левитации потока при содействии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gadavist (Bayer)	Jefferson Medical and Imaging	2068062	Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 ml vials with 15/ca.
Square glass microcapillary tubes	Vitrocom	8270	50 mm length is sufficient
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	S9000	Chemical formula: Na₂S₂O₅
Leica Microsystems Critoseal tube sealant	Fisher Scientific	02-676-20
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9269 SIGMA
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Or other reagent as recommended for the cell type used
MICROLET 2 Adjustable Lancing Device	Walgreens	246567	Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols
Microlet Lancets	Walgreens	667474	Must be dispoable and not reused
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-6	Or any preferred method for cell counting
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A1049201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Tasoglu, S., Khoory, J., Tekin, H., Thomas, C., Karnoub, A., Ghiran, I., Demirci, U. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
Tasoglu, S., Yu, C. H., Liadudanskaya, V., Guven, S., Migliaresi, C., Demirci, U. Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication. Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).
Tasoglu, S., Yu, C. H., Gungordu, H. I., Guven, S., Vural, T., Demirci, U. Guided and magnetic self-assembly of magnetoceptive gels. Nature Communications. 5, 4702 (2014).
Amin, R., Knowlton, S., Yenilmez, B., Hart, A., Joshi, A., Tasoglu, S. Smart-phone Attachable, Flow-Assisted Magnetic Focusing Device. RSC Advances. 6, 93922-93931 (2016).
Knowlton, S. M., Sencan, I., Aytar, Y., Khoory, J., Heeney, M. M., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Sickle Cell Detection Using a Smartphone. Sci Rep. 5, 15022 (2015).
Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities. PLoS One. 10 (8), e0134400 (2015).
Yenilmez, B., Knowlton, S., Tasoglu, S. Self-Contained Handheld Magnetic Platform for Point of Care Cytometry in Biological Samples . Advanced Materials Technologies. 1, 1600144 (2016).
Yenilmez, B., Knowlton, S., Yu, C. H., Heeney, M., Tasoglu, S. Label-Free Sickle Cell Disease Diagnosis Using a Low-Cost, Handheld Platform. Adv Mat Tech. 1 (5), 1600100 (2016).
Bender, M. A., Douthitt Seibel, G., et al. GeneReviews. Pagon, R. A. , University of Washington. Seattle, Seattle, WA. (1993).
Kaul, D. K., Fabry, M. E., Windisch, P., Baez, S., Nagel, R. L. Erythrocytes in sickle cell anemia are heterogeneous in their rheological and hemodynamic characteristics. J Clin Invest. 72 (1), 22-31 (1983).
Joiner, C. H. Gardos pathway to sickle cell therapies? Blood. 111 (8), 3918-3919 (2008).
Finch, J. T., Perutz, M. F., Bertles, J. F., Döbler, J. Structure of Sickled Erythrocytes and of Sickle-Cell Hemoglobin Fibers. Proc Natl Acad Sci. 70 (3), 718-722 (1973).
Lew, V. L., Etzion, Z., Bookchin, R. M. Dehydration response of sickle cells to sickling-induced Ca(++) permeabilization. Blood. 99 (7), 2578-2585 (2002).
Ernst, D. J. NCCLS Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture: Approved Standard-Sixth Addition. 27 (26), (2007).