In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll

Angelika Schmidt; Szabolcs Éliás; Rubin N. Joshi; Jesper Tegnér

doi:10.3791/55015

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Methodenartikel

In vitro Differenzierung von humanen CD4 ⁺ FOXP3 ⁺ Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 ⁺ T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll

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DOI:

10.3791/55015

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30. Dezember 2016

Angelika Schmidt¹ , Szabolcs Éliás^*¹ , Rubin N. Joshi^*¹ , Jesper Tegnér¹

¹Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die reproduzierbare Erzeugung und Phänotypisierung von humanen regulatorischen T - Zellen induziert (iTregs) von naiven CD4 ⁺ T - Zellen in vitro. Verschiedene Protokolle für FOXP3 Induktions ermöglichen die Untersuchung spezifischer iTreg Phänotypen mit jeweiligen Protokollen erhalten.

Zusammenfassung

Regulatorische T-Zellen (Tregs) sind ein integraler Bestandteil der peripheren Toleranz, unterdrücken Immunreaktionen gegen Selbststrukturen und beugen so Autoimmunerkrankungen vor. Klinische Ansätze zum adoptiven Transfer von Tregs oder zur Depletion von Tregs bei Krebs sind im Gange und zeigen vielversprechende erste Ergebnisse.

Da die Anzahl der natürlich vorkommenden Tregs (nTregs) sehr begrenzt ist, kann die Untersuchung bestimmter Treg-Merkmale mit in vitro induzierten Tregs (iTregs) vorteilhaft sein. Bisher ist der beste, wenn auch nicht absolut spezifische Proteinmarker zur Abgrenzung von Tregs der Transkriptionsfaktor FOXP3. Trotz der Bedeutung von Tregs, einschließlich der nicht-redundanten Rolle von peripher induzierten Tregs, sind die Protokolle zur Erzeugung von iTregs derzeit umstritten, insbesondere für menschliche Zellen. Dieses Protokoll beschreibt daher die in vitro Differenzierung von humanen CD4+FOXP3+ iTregs aus humanen naiven T-Zellen unter Verwendung einer Reihe von Treg-induzierenden Faktoren (TGF-β plus IL-2 nur oder deren Kombination mit Retinsäure, Rapamycin oder Butyrat) parallel. Es wird auch die Phänotypisierung dieser Zellen mittels Durchflusszytometrie und qRT-PCR beschrieben.

Diese Protokolle führen zu einer reproduzierbaren Expression von FOXP3 und anderen Treg-Signaturgenen und ermöglichen die Untersuchung allgemeiner FOXP3-Regulationsmechanismen sowie protokollspezifischer Effekte, um den Einfluss bestimmter Faktoren abzugrenzen. iTregs können verwendet werden, um verschiedene phänotypische Aspekte sowie molekulare Mechanismen der Treg-Induktion zu untersuchen. Detaillierte molekulare Studien werden durch relativ große Zellzahlen, die gewonnen werden können, erleichtert.

Eine Einschränkung für die Anwendung von iTregs ist die relative Instabilität der FOXP3-Expression in diesen Zellen im Vergleich zu nTregs. iTregs, die durch diese Protokolle erzeugt werden, können auch für funktionelle Assays verwendet werden, wie z.B. die Untersuchung ihrer suppressiven Funktion, bei denen iTregs, die durch TGF-β plus Retinsäure und Rapamycin induziert werden, eine überlegene suppressive Aktivität zeigen. Die Suppressionsfähigkeit von iTregs kann sich jedoch von der von nTregs unterscheiden, und die Verwendung geeigneter Kontrollen ist entscheidend.

Einleitung

CD4 + CD25 + FOXP3 + regulatorischen T - Zellen (Tregs) unterdrücken andere Immunzellen und sind kritische Vermittler der peripheren Toleranz, die Verhütung von Autoimmun- und übermäßige Entzündung ^1. Die Bedeutung der Treg wird von der menschlichen Krankheit immunodysregulation Polyendokrinopathie Enteropathie X-chromosomal-Syndrom (IPEX), in dem Verlust von Treg aufgrund von Mutationen in der `Master' Treg Transkriptionsfaktor forkhead Feld P3 (FOXP3) führt zu schweren systemischen Autoimmunerkrankung exemplifiziert, tödlich in einem frühen Alter. Allerdings wirken Tregs als zweischneidiges Schwert in das Immunsystem , wie sie auch Antitumor - Immuni....