Este protocolo describe la generación reproducible y el fenotipo de las células T reguladoras inducidas por el hombre (iTregs) a partir de células T CD4 + vírgenes in vitro. Diferentes protocolos de inducción FOXP3 permiten el estudio de los fenotipos iTreg específicos obtenidos con los protocolos respectivos.
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Artículo de método
Diferenciación in vitro de las células CD4 + humano FOXP3 + células T reguladoras (Induced iTregs) de T naive CD4 + células utilizando un protocolo de TGF-β que contienen
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Resumen
Resumen
Las células T reguladoras (Tregs) son una parte integral de la tolerancia periférica, suprimiendo las reacciones inmunitarias contra las autoestructuras y, por lo tanto, previniendo enfermedades autoinmunes. Se están llevando a cabo enfoques clínicos para transferir Tregs de forma adoptiva, o para agotar las Tregs en el cáncer, con primeros resultados prometedores.
Debido a que el número de Tregs naturales (nTregs) es muy limitado, puede ser ventajoso estudiar ciertas características de las Treg utilizando Tregs inducidas in vitro (iTregs). Hasta la fecha, el mejor marcador proteico para delinear Tregs es el factor de transcripción FOXP3. A pesar de la importancia de las Tregs, incluidas las funciones no redundantes de las Tregs inducidas periféricamente, los protocolos para generar iTregs son actualmente controvertidos, particularmente para las células humanas. Por lo tanto, este protocolo describe la diferenciación in vitro de iTregs CD4 + FOXP3+ humanos a partir de células T humanas vírgenes utilizando una variedad de factores inductores de Treg (TGF-β más IL-2 solamente, o su combinación con ácido retinoico, rapamicina o butirato) en paralelo. También se describe el fenotipado de estas células mediante citometría de flujo y qRT-PCR.
Estos protocolos dan como resultado la expresión reproducible de FOXP3 y otros genes característicos de Treg y permiten el estudio de los mecanismos generales de regulación de FOXP3, así como los efectos específicos del protocolo para delinear el impacto de ciertos factores. iTregs se puede utilizar para estudiar varios aspectos fenotípicos, así como los mecanismos moleculares de la inducción de Treg. Los estudios moleculares detallados se ven facilitados por el número relativamente grande de células que se pueden obtener.
Una limitación para la aplicación de iTregs es la relativa inestabilidad de la expresión de FOXP3 en estas células en comparación con nTregs. Las iTregs generadas por estos protocolos también se pueden utilizar para ensayos funcionales, como el estudio de su función supresora, en la que las iTregs inducidas por TGF-β más ácido retinoico y rapamicina muestran una actividad supresora superior. Sin embargo, la capacidad de supresión de iTregs puede diferir de la de nTregs y el uso de controles adecuados es crucial.
Introducción
Células T reguladoras CD4 + CD25 + FOXP3 + (Tregs) suprimen otras células inmunes y son mediadores críticos de la tolerancia periférica, la autoinmunidad y la prevención de la inflamación excesiva 1. La importancia de las células T reguladoras se ejemplifica por la enfermedad humana y el síndrome ligada al cromosoma X immunodysregulation poliendocrinopatía enteropatía (IPEX), en el que la pérdida de células T reguladoras debido a mutaciones en el `master' factor de transcripción caja forkhead P3 Treg (FOXP3) conduce a la enfermedad autoinmune sistémica grave, letal a una edad temprana. Sin embargo, las células T reguladoras actuar como una espada de do....
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Protocolo
Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) fueron recién aisladas de capas leucocitarias de donantes sanos anonimizados comprados en el Hospital Universitario Karolinska, Suecia. permiso ético para los experimentos se obtuvo de la Junta Regional de Revisión Ética en Estocolmo (reģionālā etikprövningsnämnden i Stockholm), Suecia (número de registro: 2013/1458/31/1).
1. T aislamiento de células de la sangre periférica
- Aislamiento de PBMC
- Pre-lay 15 ml de medio de centrifugación de densidad (como Ficoll) solución en tubos de 50 ml (5 tubos por capa leucocitaria). Pre-caliente a temperatura ambiente.
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Resultados
La Figura 1 muestra un esquema de la configuración experimental. La Figura 2 muestra una tinción de control de pureza representativo de las células T CD4 + vírgenes magnéticamente aisladas y nTregs.
FIGURA 3A muestra la citometría de flujo gating estrategia y la Figura 3B muestra representativa FOXP3 y CD25 citometría de flujo coloraciones en el día.......
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Discusión
El protocolo descrito permite la inducción robusto de CD4 humano + FOXP3 + iTregs de células T CD4 + vírgenes humanos. Incluye un nuevo protocolo que describimos hace poco, el uso de una combinación de TGF-β, ATRA y rapamicina, para la inducción de iTregs con superiores función supresora in vitro 22. En comparación con otros protocolos publicados, otra ventaja es la inducción de diferentes poblaciones iTreg en paralelo por diferentes protocolos, lo que permite la comparación directa de los.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nina Nagel es agradecida por su asistencia técnica durante el rodaje del vídeo y la preparación experimental. Agradecemos a Eva-Maria Weiss por su ayuda con el protocolo de tinción intracelular FOXP3 y a Elisabeth Suri-Payer y Nina Oberle por establecer el protocolo de aislamiento nTreg. Matilda Eriksson y Peri Noori son reconocidas por la gestión del laboratorio.
Financiación: A.S. fue apoyado por una beca intraeuropea Marie Curie dentro del 7º Programa Marco de la Comunidad Europea, la Fundación Dr. Åke Olsson y las fundaciones de investigación KI; A.S. y J.T. fueron apoyados por una beca CERIC (Centro de Excelencia para la Investigación....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ácido retinoico totalmente trans | Sigma Aldrich | R2625-50MG | |
| anit-humano clon de Foxp3-APC 236A/E7 | eBioscience | 17-4777-42 | |
| microperlas CD25 antihumanas | Miltenyi Biotec | 130-092-983 | |
| antihumano CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | |
| anticuerpo CD28 antihumano, LEAF Purificado | Biolegend | 302914 | |
| anticuerpo CD3 antihumano, purificado por LEAF | Biolegend | 317315 | |
| antihumano CD45RA, FITC | Miltenyi Biotec | 130-092-247 | |
| antihumano CD45RO clon de PE UCHL1 | BD Biosciences | 555493 | |
| clon antihumano CD4-PerCP SK3; mIgG1 | BD Biosciences | 345770 | |
| antihumano CD8-eFluor 450 (clon OKT8), mIgG2a | eBioscience | 48-0086-42 | |
| CTLA-4 (CD152), clon BNI3, mIgG2ak, violeta brillante 421 | BD Biosciences | 562743 | |
| clon 4S de IFN-g FITC antihumano. B3; mIgG1k | eBioscience | 11-7319-81 | |
| Solución que contiene Brefeldina A: GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | |
| kit de síntesis de ADNc: SuperScript VILO (transcriptasa inversa) Kit de síntesis de ADNc | Invitrogen | 11754-250 | |
| Medio de centrifugación de densidad: Ficoll-Paque | GE healthcare | 17-1440-03 | |
| DMSO 99.7% | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | |
| FBS, | Invitrogen | 10082-147 | |
| Tinte de viabilidad fijable inactivado por calor, eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 o 65-0865-18 | |
| Foxp3 Juego de tampones de tinción | eBioscience | 00-5523-00 | Atención: contiene paraformaldehído. También se puede comprar en kit combinado con anticuerpo; 77-5774-40 Set de tinción anti-humano Foxp3 Clon APC: 236A/E7 Set |
| GlutaMAX (200 mM L-alanil-L-glutamina) | Invitrogen | 35050-061 | |
| humano ingenuo kit de aislamiento de células T CD4 | Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| Albúmina sérica humana 50 g/L | Baxter | 1501057 | |
| Ionomicina de Streptomyces conglobatus >98% | Sigma Aldrich | I9657-1MG | |
| MACS LS-columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| ratón IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 | eBioscience | 17-4714-42 | |
| ratón IgG1 K Isotype Control FITC 50 μ g | eBioscience | 11-4714-81 | |
| ratón IgG2a control de isotipo, violeta brillante 421, clon MOPC-173 | BD Biosciences | 563464 | |
| Pasteur pipeta de plástico, empaquetado individualmente | Sarstedt | 86.1172.001 | |
| PMA Forbol 12-miristato 13-acetato | Sigma Aldrich | P1585-1MG | |
| Rapamicina | EMD (Merck) | 553210-100UG | |
| IL-2 humano recombinante, CF | R& D | 202-IL-050/CF | |
| TGF-beta 1 humano recombinante, CF | RnD | 240-B-010/CF | |
| Kit de aislamiento de ARN: RNAqueous-Micro Kit Ambion | AM1931 | ||
| RPMI 1640 Medio | Invitrogen | 72400-054 | |
| Butirato de sodio | Sigma Aldrich | B5887-250MG | |
| Medio de cultivo de células T: medio X-Vivo 15, con gentamicina + fenol | Lonza | 04-418Q | |
| Ensayo de expresión génica TaqMan, FOXP3 (mejor cobertura) | Applied Biosystems | 4331182; ID del ensayo: Hs01085834_m1 | Precaución: contiene paraformaldehído |
| TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Mejor Cobertura) | Applied Biosystems | 4351370; ID del ensayo: Hs04194366_g1 | Atención: contiene paraformaldehído |
| Mezcla maestra de expresión génica TaqMan | 4369514 | Biosystems aplicados |
Referencias
- Sakaguchi, S. Regulatory T cells: history and perspective. Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).
- DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the litera....
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Reimpresiones y permisos
