Bir TGF-β-içeren Protokolü kullanılarak naif CD4 + T hücrelerinden insan CD4 + FoxP3 + Bağlı regülatör T hücreleri (iTregs) in vitro ayrımında

Angelika Schmidt; Szabolcs Éliás; Rubin N. Joshi; Jesper Tegnér

doi:10.3791/55015

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir TGF-β-içeren Protokolü kullanılarak naif CD4 ⁺ T hücrelerinden insan CD4 ⁺ FoxP3 ⁺ Bağlı regülatör T hücreleri (iTregs) in vitro ayrımında

20.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/55015

⸱

30 Aralık 2016

Angelika Schmidt¹ , Szabolcs Éliás^*¹ , Rubin N. Joshi^*¹ , Jesper Tegnér¹

¹Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory

^* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, in vitro olarak naif CD4 ⁺ T hücrelerinden üretilebilir üretimi ve insan kaynaklı düzenleyici T hücrelerinin (iTregs) fenotipleme tarif eder. FoxP3 indüksiyonu için farklı protokoller ilgili protokolleri ile elde edilen spesifik iTreg fenotipleri çalışması için izin verir.

Özet

Düzenleyici T hücreleri (Treg'ler) periferik toleransın ayrılmaz bir parçasıdır, öz yapılara karşı bağışıklık reaksiyonlarını baskılar ve böylece otoimmün hastalıkları önler. Treg'leri evlat edinerek transfer etmek veya kanserde Treg'leri tüketmek için klinik yaklaşımlar umut verici ilk sonuçlarla devam etmektedir.

Doğal olarak oluşan Treg'lerin (nTreg'ler) sayısı çok sınırlı olduğundan, in vitro indüklenmiş Treg'leri (iTreg'ler) kullanarak belirli Treg özelliklerini incelemek avantajlı olabilir. Bugüne kadar, Treg'leri tanımlamak için kesinlikle spesifik olmasa da en iyi protein belirteci, transkripsiyon faktörü FOXP3'tür. Periferik olarak indüklenen Treg'lerin yedekli olmayan rolleri de dahil olmak üzere Treg'lerin önemine rağmen, iTreg'leri üretme protokolleri, özellikle insan hücreleri için şu anda tartışmalıdır. Bu nedenle bu protokol, paralel olarak bir dizi Treg indükleyici faktör (TGF-β artı sadece IL-2 veya bunların retinoik asit, rapamisin veya bütirat ile kombinasyonları) kullanılarak insan CD4 + FOXP3 + iTreg'lerinin insan naif T hücrelerinden in vitro farklılaşmasını tanımlar. Ayrıca bu hücrelerin akış sitometrisi ve qRT-PCR ile fenotiplemesini de tanımlar.

Bu protokoller, FOXP3 ve diğer Treg imza genlerinin tekrarlanabilir ekspresyonu ile sonuçlanır ve genel FOXP3 düzenleyici mekanizmaların yanı sıra belirli faktörlerin etkisini tanımlamak için protokole özgü etkilerin incelenmesini sağlar. iTreg'ler, Treg indüksiyonunun moleküler mekanizmalarının yanı sıra çeşitli fenotipik yönleri incelemek için kullanılabilir. Ayrıntılı moleküler çalışmalar, elde edilebilecek nispeten büyük hücre sayıları ile kolaylaştırılmaktadır.

iTregs uygulaması için bir sınırlama, bu hücrelerde FOXP3 ekspresyonunun nTregs'e kıyasla göreceli kararsızlığıdır. Bu protokoller tarafından üretilen iTreg'ler, TGF-β artı retinoik asit ve rapamisin tarafından indüklenen iTreg'lerin üstün baskılayıcı aktivite gösterdiği baskılayıcı fonksiyonlarının incelenmesi gibi fonksiyonel testler için de kullanılabilir. Bununla birlikte, iTreg'lerin baskılayıcı kapasitesi nTreg'lerden farklı olabilir ve uygun kontrollerin kullanılması çok önemlidir.

Giriş

CD4 + CD25 + FoxP3 + düzenleyici T hücreleri (Tregs) diğer bağışıklık hücrelerini bastırmak ve periferik tolerans kritik arabulucular, önlenmesi otoimmünite ve aşırı enflamasyon ¹ bulunmaktadır. Tregs önemi, ciddi sistemik otoimmün hastalık yol açar Tregs kaybı nedeniyle `master' Treg transkripsiyon faktör forkhead kutusu P3 mutasyonlar insan hastalık immunodysregulation poliendokrinopati enteropatisi X'e bağlı sendromu (IPEX), (FoxP3) tarafından örneklenmiştir erken yaşta ölümcül. Ancak, Treg'ler onlar da bazı ayarlarda ² anti-tümör bağışıklığını engel gibi bağışıklık sisteminde bir iki ucu keskin kılıç olarak hareket ederler. Treg ....