Problemen bij de verwerking van biologische monsters voor waarneming door middel van rasterelektronenmicroscopie omvatten celimplosie, behandeling van monsters uit natte micro-omgevingen en celvernietiging. Goedkope en relatief snelle protocollen die geschikt zijn voor het voorbereiden van uitdagende monsters zoals bloemtoppen, oömyceten cysten en schimmels (Agaricales) zijn hier samengesteld en gedetailleerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocollen voor Problematisch Plant, oömyceet en Fungal Samples
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Veel voorkomende problemen bij de verwerking van biologische monsters voor observaties met de scanning elektronenmicroscoop (SEM) waartoe cel instorten van de monsters uit natte micro-omgevingen en celvernietiging. Met behulp van jonge bloemen weefsels, oömyceet cysten, en schimmels sporen (Agaricales) als voorbeeld, specifieke protocollen om delicate monsters worden hier beschreven dat een aantal van de belangrijkste uitdagingen in de steekproef behandeling voor het vastleggen van beelden onder de SEM overwinnen verwerken.
Bloemen meristemen met FAA vaste (formaline Acetic-Alcohol) en verwerkt met het kritische punt Droger (CPD) niet weer te geven ingestort celwanden of vervormd organen. Deze resultaten zijn van cruciaal belang voor de wederopbouw van bloemen ontwikkeling. Een soortgelijke CPD gebaseerde behandeling van monsters van natte micro-omgevingen, zoals glutaaraldehyde gefixeerd oomycete cysten, optimaal van de differentiële groei van diagnostische kenmerken (bijvoorbeeld de cyste stekels) op verschillende soorten su testenbstrates. Vernietiging van de verpleegkundige cellen bevestigd aan schimmelsporen werd vermeden na rehydratatie, uitdroging, en de CPD behandeling, een belangrijke stap voor de verdere functionele studies van deze cellen.
De protocollen hier beschreven vertegenwoordigen goedkope en snelle alternatieven voor het verwerven van goede kwaliteit afbeeldingen om groeiprocessen te reconstrueren en diagnostische kenmerken te bestuderen.
Inleiding
In de biologie is het gebruik van scanning elektronenmicroscopie (SEM) uitgebreid studies van structurele ontwikkeling, vergelijkende morfologie orgaanontwikkeling en karakterisatie van populaties of soorten 1. Met zijn twee-dimensionale weergave van microscopische structuren, gebieden zoals micromorfologie en systematiek profiteerde van SEM techniek vooruitgang sinds de tweede helft van de 20e eeuw. Bijvoorbeeld, de introductie van de sputter coating methode in 1970 mogelijk gemaakt opmerkingen van delicate stoffen zoals uiteinden van scheuten en bloemen verbeteren van de beeldvorming van de niet-geleidende weefsel
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
NB: Dit protocol omvat zes hoofdrubrieken, drie gewijd aan specifieke organismen (secties 1-3), en drie beschrijven van de procedures voor alle (4-6). Sterretjes (*) geven stappen gewijzigd door de onderzoekers.
1. Onderzoek van de ontwikkelingslanden en volledig gevormd Plant Structures
- Inzameling en fixatie
- Als de plant materiaal wordt verzameld in een plaats met geen toegang tot een zuurkast, te introduceren en dompel het materiaal in 70% ethanol in centrifugebuizen. Idealiter, dompel het materiaal na 48 uur in de FAA (stappen 1.1.1-1.1.3) om overmatige uitdroging in de ethanol te vermijden. Als een....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Bloemen Ontwikkeling en Bevestiging van de ontwikkelingslanden en volledig gevormd Plant Structures
Met behulp van de FAA-CPD-protocol hier beschreven, zijn jong en volwassen plant weefsels optimaal vast en uitgedroogd voor SEM beeldvorming. Processen zoals bloemontwikkeling kan worden gereconstrueerd doordat de topografie en vorm van de knoppen niet wordt verstoord door cellen krimpen (figuur 1b, 1d, 4a-f). Str.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Met betrekking tot de standaard SEM protocollen, de hier gepresenteerde procedures omvatten relatief snel, gemakkelijk te volgen, en low-cost methodieken. Afhankelijk van de mate van gebruik en het gemak van de verwerking, het duurt 4-5 dagen beelden van goede kwaliteit te verkrijgen. Met inbegrip van adequate veiligheidsmaatregelen voor de CPD en SEM operatie, de procedures zijn gemakkelijk te hanteren. Bijzondere voorzichtigheid moet worden genomen met formaline en de glutaaraldehyde (zie stappen 1.1.1 tot 1.1.3 en 2........
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit project heeft financiering ontvangen van het Horizon 2020-programma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie in het kader subsidieovereenkomst No. 634429. Deze publicatie geeft de mening van de auteur, en de Europese Commissie kan niet verantwoordelijk voor het gebruik dat kan worden gemaakt van de informatie worden gesteld daarin opgenomen. We erkennen ook de financiële bijdrage van de Real Jardín Botánico, CSIC. SR is dankbaar voor de Europese Unie [ITN-SAPRO-238550] ter ondersteuning van haar onderzoek in Saprolegnia. We willen ook Francisco Calonge bedanken voor zo vriendelijk de Phellorinia herculanea beelden en B. Pueyo voor het ve....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Azijnzuur | Geen specifieke leverancier | Huidirritatie, oogirritatie | |
| Aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| Centrifugebuizen | Geen specifieke leverancier | ||
| Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D-(+)-Glucose | Merck | 1.083.421.000 | |
| Dubbelzijdige plakband | Geen specifieke leverancier | ||
| Ethanol absoluut | Geen specifieke leverancier | Ontvlambaar | |
| Europese bacteriologische agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| Filterpapier | Geen specifieke leverancier | ||
| Pincetten | Geen specifieke leverancier | ||
| Formaline 4% | Geen specifieke leverancier | Schadelijk, acute toxiciteit, huidgevoeligheid, kankerverwekkendheid. Ontvlambaar | |
| Glazen deksels | Geen specifieke leverancier | ||
| Glazen hermetische container | Geen specifieke leverancier | ||
| Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| Mycologisch pepton | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| Naalden | Geen specifieke leverancier | ||
| Petrischalen | Geen specifieke leverancier | ||
| Kunststof containers | Geen specifieke leverancier | ||
| Staalhouder met deksel voor de critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| Scalpels | Geen specifieke leverancier | ||
| Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
| Software voor SEM | |||
| Oplossing A: NaH2PO4 | |||
| Oplossing B: Na2HPO4 | |||
| Monsterhouders | Geen specifieke leverancier | ||
| Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
| Stereomicroscoop | Geen specifieke leverancier | ||
| Transmission Electron Microscope (TEM) roosters | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
| Pincet | Geen specifieke leverancier |
Referenties
- Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
- Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
- Damblon, F. Sputte....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
