Les problèmes de traitement des échantillons biologiques pour l’observation en microscopie électronique à balayage comprennent l’effondrement cellulaire, le traitement d’échantillons provenant de microenvironnements humides et la destruction cellulaire. Des protocoles peu coûteux et relativement rapides adaptés à la préparation d’échantillons difficiles tels que les méristèmes floraux, les kystes d’oomycètes et les champignons (Agaricales) sont compilés et détaillés ici.
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Article de méthode
Microscopie électronique à balayage (MEB) Protocoles pour Problematic plantes, Oomycètes et échantillons Fungal
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les problèmes courants dans le traitement d'échantillons biologiques pour des observations au microscope électronique à balayage (MEB) comprennent l'effondrement des cellules, le traitement des échantillons de micro-environnements humides et la destruction des cellules. Utilisation de jeunes tissus floraux, des kystes oomycètes, et les spores de champignons (Agaricales) à titre d'exemples, des protocoles spécifiques pour traiter les échantillons délicats sont décrits ici qui surmontent certains des principaux défis dans le traitement de l'échantillon pour la capture d'image sous la SEM.
méristèmes floraux fixes avec la FAA (Formol-Acetic-alcool) et traitées avec le Point Sèche critique (DPC) n'affichait effondrés parois cellulaires ou des organes déformés. Ces résultats sont essentiels pour la reconstruction du développement floral. Un traitement à base de CPD-même des échantillons de micro - environnements humides, tels que les kystes de oomycètes glutaraldéhyde fixe, est optimal pour tester la croissance différentielle des caractéristiques de diagnostic (par exemple, les épines de kyste) sur différents types de substrates. Destruction des infirmières cellules attachées aux spores de champignons a été évitée après la réhydratation, la déshydratation et le traitement de DPC, une étape importante pour d'autres études fonctionnelles de ces cellules.
Les protocoles détaillés ici représentent à faible coût et des alternatives rapides pour l'acquisition d'images de bonne qualité pour reconstituer les processus de croissance et d'étudier les caractéristiques de diagnostic.
Introduction
En biologie, l'utilisation de la microscopie électronique à balayage (MEB) a été étendue à l' étude de l' évolution structurelle, la morphologie comparée, le développement des organes, et la caractérisation des populations ou des espèces 1. Avec sa vue en deux dimensions des structures microscopiques, des domaines tels que la micromorphologie et Systématique profité de SEM avance technique depuis la seconde moitié du 20 e siècle. Par exemple, l'introduction de la méthode de revêtement par pulvérisation cathodique dans les années 1970 a fait des observations possibles de matériaux fragiles tels que les sommets et les ....
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Protocole
NOTE: Ce protocole comprend six sections principales, dont trois consacrées à des organismes spécifiques (sections 1-3), et trois décrivant les procédures communes à tous (4-6). Les astérisques (*) indiquent les étapes modifiées par les expérimentateurs.
1. Études de développement et des structures végétales entièrement constituées
- Collecte et fixation
- Si le matériel végétal est recueilli dans un endroit sans accès à une hotte, introduire et immerger le matériel dans 70% d'éthanol dans des tubes de centrifugation. Idéalement, immerger le matériau après 48 h dans la FAA (étapes 1.1.1-1.1.3) pour évi....
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Résultats
Développement Floral et fixation du développement et de structures végétales entièrement constituées
En utilisant le protocole FAA-CPD décrit ici, les tissus jeunes et matures plantes sont parfaitement fixes et déshydratés destinés à l'imagerie SEM. Des procédés tels que le développement floral peuvent être reconstruites en raison de la topographie et de la forme des bourgeons ne sont pas faussés par le rétrécissement cellul.......
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Discussion
En ce qui concerne les protocoles SEM standard, les procédures présentées ici sont relativement rapide, facile à suivre, et les méthodes à faible coût. En fonction de la quantité d'échantillons et de la facilité de traitement, il faut compter de quatre à cinq jours pour obtenir des images de bonne qualité. Y compris les mesures de sécurité adéquates pour la CPD et le fonctionnement SEM, les procédures sont faciles à manipuler. Une attention particulière doit être prise avec de la formaline et le glutaraldéhyde (voir.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce projet a été financé par Horizon 2020 du programme de recherche et d'innovation de l'Union européenne en vertu de la convention de subvention n ° 634429. Cette publication reflète uniquement les opinions de l'auteur, et la Commission européenne ne peut pas être tenu pour responsable de l'usage qui pourrait être fait des informations qui s'y trouvent. Nous reconnaissons également la contribution financière faite par le Real Jardín Botánico, CSIC. SR est reconnaissant à l'Union européenne [ITN-SAPRO-238550] pour le soutien de ses recherches dans le Saprolegnia. Nous tenons également à remercier Francisco Calonge pour bien vouloir fou....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Acide acétique | Aucun fournisseur | Irritation cutanée, irritation oculaire | |
| embouts d’aluminium | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| Tubes à centrifuger | Aucun fournisseur | ||
| Sécheur à point critique | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D-(+)-Glucose | Merck | 1 083 421 000 | |
| Ruban adhésif double face | Aucun fournisseur | ||
| Éthanol absolu | Aucun fournisseur spécifique | Gélose | |
| bactériologique européenne | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| Papier filtre | Pas de fournisseur | ||
| Forceps | Aucun fournisseur | ||
| Formol 4 % | Pas de fournisseur | Nocif, toxicité aiguë, sensibilisation cutanée, cancérogénicité. Couvercle en verre inflammable | |
| Aucun fournisseur | |||
| Conteneur hermétique en verre ; | Aucun fournisseur | ||
| Glutaraldéhyde 25 % DC 253857.1611 ; (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| Peptone mycologique | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| aiguilles Aucun fournisseur | |||
| Pétri | Aucun fournisseur | ||
| Récipients en plastique | Aucun fournisseur | ||
| Porte-échantillon avec couvercle pour le séchoir à point critique. | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| scalpels | Aucun fournisseur | ||
| Microscope électronique à balayage | Hitachi | S3000N | |
| Logiciel pour MEB | |||
| Solution A : NaH2PO4 | |||
| Solution B : Na2HPO4 | |||
| Porte-échantillons | Aucun fournisseur | ||
| Revêtement par pulvérisation cathodique | Balzers | SCD 004 | |
| Stéréomicroscope | Aucun fournisseur | ||
| Grilles de microscope électronique à transmission (MET) | Microscopie électronique Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
| Pince à épiler | Aucun fournisseur spécifique |
Références
- Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
- Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
- Damblon, F. Sputte....
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Réimpressions et autorisations
