头颈部鳞状细胞癌中神经周围浸润的模型

摘要

神经周围侵袭（PNI）是头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的常见特征，与较低的生存率相关。其发生机制尚不明确。通过利用在半固体基质中培养的小鼠背根神经节所生成的神经突，可研究HNSCC细胞系中参与PNI的相关通路。

摘要

神经周围浸润（PNI）在约40%的头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中被发现。尽管采用手术、放疗和化疗的多模式治疗，与无PNI的HNSCC相比，此类患者局部区域复发和远处转移的发生率更高，总体生存率降低40%。 体外 头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中神经周围浸润（PNI）相关通路的研究历来面临挑战，主要由于缺乏一种一致且可重复的检测方法。本文所述为背根神经节（DRG）检测法的改良应用，用于HNSCC中PNI的研究。在该模型中，DRG取自安乐死后的裸鼠脊柱，并置于半固体基质中。随后数天内，DRG细胞体向外呈放射状生长出神经突。将HNSCC细胞系接种于基质周围区域，这些细胞会优先沿神经突向DRG方向侵袭。该方法可快速评估多种处理条件，具有极高的实验成功率和可重复性。 关键词：头颈部鳞状细胞癌，HNSCC，神经周围浸润，PNI，背根神经节，DRG，侵袭，体外模型

引言

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是美国第六大常见癌症，每年全国死亡人数达10,000人，全球每年死亡人数达300,000人¹。过去几十年来，HNSCC的总体预后一直维持在50%左右，未见改善。神经周围浸润（PNI）是预测HNSCC患者预后不良的最重要病理特征之一。遗憾的是，PNI在HNSCC中发生率较高，可在高达40%的HNSCC患者中观察到^2,3。

神经周围浸润（PNI）是指恶性细胞沿神经追踪至邻近组织的过程，从而导致局部和远处扩散的发生率升高。因此，PNI阳性的头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）肿瘤具有更高的局部区域复发率和远处转移率，与无PNI的HNSCC患者相比，总体生存率更低^4-8。

尽管通过手术、放疗和化疗联合治疗伴有神经周围浸润（PNI）的患者，其疗效已达到最大化，但与无PNI的患者相比，这些患者的总体生存率仍降低高达40%^9-11。因此，显然目前针对头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的治疗手段在改善与PNI相关的不良预后方面效果有限。开发针对HNSCC中PNI的靶向治疗策略，受到对该过程调控因素认知不足的限制。部分原因在于目前尚缺乏一种稳定可靠的体外（in vitro）模型用于研究HNSCC中的PNI。

近年来，已有多个研究团队开始采用一种 体外<....

方案

1. 培养基与培养皿的准备（10 分钟）

1. 向96孔V型底培养板的孔中加入100 µL含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
2. 从-20 °C冰箱中取出一管预先分装的约100 µL半固体基质，直接置于冰上。
   注意：应在背根神经节（DRG）分离前完成此步骤，因为半固体基质在冰上约需30分钟才能完全融化为液态，这是后续步骤所必需的。若未始终将半固体基质保持在冰上，将导致基质液滴质量不佳。
3. 使用永久性墨水在玻璃底培养皿的四个角下方标记唯一编号。将培养皿正面向上放置于冰上，以冷却皿表面。
   注意：每只小鼠可获得32–40个DRG，因此编号应从1至40。无需预先冷却移液器吸头，因为预冷的吸头在点加基质液滴过程中会逐渐升温，可能导致基质一致性出现差异。

2. 小鼠背根神经节的解剖（45 分钟）

1. 根据特定实验室规程处死一只裸鼠，例如使用 CO₂ 室和胸腔切开术。
2. 准备解剖区域和显微镜。使用 15 或 50 mL 锥形管用的聚苯乙烯容器的洁净、灭菌且平坦的底面。
   注：此外，该底面适合作为解剖平台，因其价格低廉、可一次性使用，并允许使用大头针或针头固定脊柱。仅使用已灭菌的器械和针头。
3. 在自然视野下，用直剪或弯剪沿脊柱从尾根部至小鼠头部做纵向切口。
4. 用同一....

结果

背根神经节解剖完成后，将其置于基质液滴中，此时实验的外观应如图1所示。请注意，背根神经节并非完全圆形，但应位于基质液滴的中央位置。这可支持神经突在360度方向上生长，部分生长情况如图2所示。需注意的是，背根神经节的某些区域比其他区域更快且更多地发出神经突，通常对应于传出和传入神经纤维分别进入和离开背根神经节的位置。为消除背根神经节之间在大小和神经突生长模式上的差异，我们以每组4个的方式随机铺板，并将各培养板随机分配至不同的细胞处理条件中。

如上所述，当神经突延伸至基质边缘距离的至少3/4时（通常在第3天），我们开始接种HNSCC细胞系。所添加的细胞在基质周围形成一个环状结构（图3a）。随后我们在第4天（图3b）和第5天（图3c）对实验进行拍照。此处展示的细胞系（FaDu）表现出高于平均.......

讨论

方案中的关键步骤

本方案中最关键的步骤是背根神经节的精确解剖与提取。正确横断脊柱，并沿中线纵向分离为两半脊柱，对于获得大量背根神经节（DRG）至关重要。在分离单个DRG时，切勿直接接触神经节本身，而应使用显微镊夹持其周围的筋膜组织。若未遵循此操作，将可能导致DRG受压损伤，这很可能是神经突向外生长失败的主要原因。在解剖过程中，宁可保留较多的周围神经组织，也不应过度操作DRG，以免导致实验中完全无法观察到神经突生长。

修改与故障排除

上述实验方案反映了多年来经过大量程序调整所建立的最佳方法。在方案部分相应步骤的正下方，列出了作者在使用该方法过程中所积累的一些注意事项和常见问题。鉴于本方案涉及的步骤较多，今后的研究人员确实可以对此方案进行多种修改。随着对这些修改经验的积累，预计各研究团队将根据自身偏好发展出更多的故障排除方法。

技术的局限.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F-12 50/50 培养基（含 L-谷氨酰胺） & 15 mM HEPES	Corning Cellgro	10-090-CV	弗吉尼亚州马纳萨斯
胎牛血清	亚特兰大生物制品公司	S11150	美国佐治亚州弗劳里布兰奇
0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1×）	Life Technologies Corporation	25200056	纽约州格兰德岛
1×磷酸盐缓冲液	康宁	21-040-CM	弗吉尼亚州马纳萨斯
Matrigel hESC-Qualif 小鼠	康宁公司	354277	马萨诸塞州贝德福德
经γ射线辐照的35 mm玻璃底培养皿	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	马萨诸塞州阿什兰
SteREO Discovery.V8 手术显微镜	卡尔·蔡司显微成像	495015-0021-000	纽约州索恩伍德
Schott ACE I 光源	Schott	A20500	德国
CellTracker	Life Technologies Corporation	C2925	加利福尼亚州卡尔斯巴德
BD PrecisionGlide 针头 18 G 和 21 G	BD	305195	新泽西州富兰克林湖
高级显微解剖镊	哈佛仪器	60-3851	马萨诸塞州霍利斯顿
高级精细手术剪	哈佛仪器公司	52-2789	马萨诸塞州霍利斯顿
高级弹簧剪	哈佛仪器	60-3923	马萨诸塞州霍利斯顿
持针钳	哈佛仪器公司	72-8949	马萨诸塞州霍利斯顿
裸鼠（002019）	杰克逊实验室	002019	缅因州巴港