Summary
Konsekutive cryo-sektioner er samlet for at muliggøre histologiske applikationer og berigelse af RNA til genekspression målinger med tilstødende regioner fra en enkelt mus skeletmuskel. Høj kvalitet RNA fås fra 20 - 30 mg puljede kryosnit og målinger direkte sammenlignes på tværs af applikationer.
Abstract
Med denne metode bliver efterfølgende kryosektioner opsamlet for at give begge mikroskopi ansøgninger om væv histologi og berigelse af RNA til genekspression bruger tilstødende regioner fra en enkelt mus skeletmuskel. Typisk er det udfordrende at opnå tilstrækkelig homogenisering af små skeletmuskulaturen prøver, fordi buffer mængder kan være for lav til effektiv slibning applikationer, dog uden tilstrækkelig mekanisk afbrydelse, den tætte væv arkitektur muskel grænser penetration af buffer reagenser, i sidste ende forårsager lavt RNA udbytte. Ved at følge den protokol rapporteret her, er 30 um snit opsamlet og samlet tillade cryosectioning og efterfølgende nål homogenisering til mekanisk forstyrre musklen, forøgelse af overfladearealet eksponeret i buffer penetration. De primære begrænsninger af teknikken er, at den kræver en kryostat, og det er forholdsvis lille produktion. Imidlertid kan høj kvalitet RNA opnås fra små prøver af puljet muscle kryosektioner, hvilket gør denne metode i mange forskellige skeletmuskulatur og andre væv. Desuden muliggør denne teknik matchede analyser (fx væv histopatologi og genekspression) fra tilstødende områder af en enkelt skeletmuskulatur, så målingerne kan sammenlignes direkte på tværs af programmer for at reducere eksperimentel usikkerhed og for at reducere nødvendige replikative dyreforsøg at købe en lille væv til flere programmer.
Introduction
Målet med denne teknik er at foretage flere eksperimentelle analyser af forskellige modaliteter, såsom histologi og genekspression, tilgængelige fra en enkelt lille skeletmuskulatur kilde væv. Mikroskopi applikationer er de mest følsomme til at prøve konserveringsmetoder, som skal styres omhyggeligt for at begrænse dannelsen af iskrystal artefakter under kryopræservering. Således er metodeudvikling baseret på tibialis anterior (TA) muskel frosne delvis dækket med indlejring harpiks i en -140 ° C flydende nitrogen-afkølet 2-methylbutan bad som udgangsmateriale til både immunfluorescensmikroskopi og genekspression analyser.
Behovet for at bruge den samme kilde materiale til diverse tekniske tilgange er især vigtigt for intramuskulær injektion-baserede eksperimenter, hvor venstre og højre muskler repræsenterer forskellige betingelser, en eksperimentel og en kontrol. For eksempel i muskelregenerationen undersøgelser, en muscle injiceres med et toksin til at forårsage omfattende vævsskade, mens den kontralaterale muskel tjener som et vehikel-injiceret kontrol 1. Tilsvarende genterapi undersøgelser for muskelsygdomme begynder typisk med validering af genterapivektoren ved intramuskulær injektion for at blive sammenlignet med tom vektor, ubeslægtet vektor eller vehikelkontrol på den kontralaterale side 2. Derfor er det ikke muligt at kilde hver TA muscle til et andet program.
Fælles strategier til at håndtere dette problem er: i) at bruge en anden muskel gruppe for hver ansøgning, ii) at bruge ekstra mus, eller iii) at afskære et stykke af musklen for hvert program. Men væsentlige forskelle mellem muskelgrupper gør det vanskeligt at sammenligne data fra forskellige applikationer, og yderligere dyr øger regning og er dårligt berettiget, hvis der findes andre alternativer. Opdeling musklen efter dissektion til kilde forskellige applikationer er den bedste løsning in mange tilfælde. Imidlertid musklen stykker er ofte for lille til at bruge pulverisering under flydende nitrogen eller mekaniske formaling teknikker til homogenisering 2-5. Som muskel er en yderst strukturel væv pakket med ekstracellulære matrix og kontraktile proteiner, utilstrækkelig mekanisk homogenisering fører til et lavt udbytte af efterfølgende DNA, RNA eller protein. Metoden beskrevet her tillader små mængder af væv fra én kilde muskel til brug i flere programmer, og inddragelsen af cryosectioning og nål findeling forbedrer mekanisk homogenisering for bedre RNA udbytte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af University of Georgia Institutional Animal Care og brug Udvalg under anvendelse dyr protokol A2013 07-016 (Beedle).
1. Kryopræservering af ikke-fikserede Skeletal Muscle
- Forberedelse
- Skær kork i små firkanter (ca. 1 cm x 1 cm) med et barberblad, skrive på proppen med en fin spids markør, der er resistent over for 2-methylbutan at identificere kilden mus og muskler, og gøre en meget overfladisk snit (ca. 1 mm) over den øverste overflade. Indsæt en plastik dækglas i snittet til at bruge til at orientere vævet. Gentag, indtil en kork er klar til alle væv, der skal kryopræserveres.
- Opnå flydende nitrogen, 2-methylbutan, indlejring harpiks, lav temperatur termometer, propper, dissektion værktøjer, og studere mus.
ADVARSEL: Flydende kvælstof er en komprimeret gas, der kan eksplodere ved opvarmning. Bær en kittel, lav temperatur handsker og ansigtsværn ved håndtering flydende niTrogen; kontakt med hud eller øjne kan forårsage forbrændinger eller forfrysninger. 2-methylbutan er en brandfarlig, giftig, sundhed og miljøfare. Bær personlige værnemidler (kittel, handsker, sikkerhedsbriller), åbne bestanden beholder i et stinkskab, overføre den lille mængde nødvendig til frysning (typisk 200 til 400 ml) til en separat beholder, der kan lukkes tæt, og undgå indånding . - Afliv mus med en godkendt metode til eutanasi under anæstesi. Kort fortalt indsætte musen ind i et indånding kammer med 2,5% isofluran i oxygen fra en isofluran fordamper, vente til 20 sek efter musen stopper flytte for at kontrollere for en pedal refleks. Når pedalen refleks er negativ, aflive undersøgelsen mus ved cervikal dislokation 6.
BEMÆRK: Ved eutanasi metoder kræver godkendelse institutionelle etiske komité. - Fjern huden overliggende den distale bagben og skære de distale forreste sener lige over anklen med fine-point theseIndsatsen saks. Tag fat i distale sener med fine pincet og træk forsigtigt op og mod knæet, mens der skæres lateral fascia at frigive musklen. Træk musklen ud vinkelret fra knæet og gøre en endelige cut at udskære TA musklen 7.
BEMÆRK: TA musklen anvendes her som et eksempel, men enhver mus skeletmuskel eller hjertet kan erstattes TA i denne protokol, hvis hensigtsmæssigt at brugerens eksperimentelle mål. Den eneste begrænsning er, at et væv skal være små nok til at opnå hurtig kryopræservering hele dets dybde; anbefales en maksimal væv størrelse på 1 cm x 1 cm. - Gentag på den modsatte ben, og dissekere enhver anden væv, der skal indsamles. Udfør dissektion så hurtigt som muligt at begrænse vævsnedbrydning før nedfrysning.
- Orient hver muskel til tværgående sektioner på sin præ-mærkede kork. Stand musklen vinkelret på proppen med den distale senen rører kork og toppen af musklen extslutter væk, holdt oprejst af dækglasset.
- Cryopreservering alle væv til histologisk analyse snarest muligt efter dissektion, fortrinsvis inden for 5 min, men bestemt ikke mere end 15 min tid forløbet siden euthanization af kilden dyr.
- kryopræservering
- Begynd afkøling af kryopræservering badet fem minutter før afslutningen af dissektion. Hæld 2-methylbutan i en åben metal bægerglas til en dybde på cirka 3 cm. Hæld flydende nitrogen til en isoleret beholder til en dybde på 2 til 4 cm. Sæt bægerglasset af 2-methylbutan i flydende nitrogen; nitrogenet vil begynde at koge. Undgå kvælstof sprøjt ind i 2-methylbutan bæger.
ADVARSEL: Forbered frysning bad i et stinkskab eller et godt ventileret område. - Sæt en lav temperatur termometer i 2-methylbutan til at overvåge temperatur og rør ofte med en gaffel for at sikre selv køling. Fortsæt med at røre og køligt indtil 2-migthylbutane når -140 ° C, tilføjer ny flydende nitrogen til den ydre bad efter behov.
BEMÆRK: -140 ° C er den optimale temperatur for at minimere iskrystal artefakter i tværstribede muskler; andre væv kan Cryopreservering bedst ved forskellige temperaturer (fx hjerne, -90 ° C). - Påfør indlejring harpiks kun til den nedre 35 - 50% af musklen, hvor den møder kork og straks falde proppen ind i 2-methylbutan ved -140 ° C. Hurtigt gentag for op til 8 væv pr fryse parti. Omrør i 30 sek og skrabe bunden af bægerglasset at sikre, at væv ikke fryser i den størknende 2-methylbutan.
- Brug en gaffel, hulske eller store pincet til at trække hver væv kork fra 2-methylbutan. Hurtigt fjerne dækglasset, ising overskydende 2-methylbutan i bægeret, og derefter slippe vævet kork ind i den ydre kvælstof bad. Gentag for alle resterende propper i bægeret.
- Overfør prøver i flydende nitrogen eller på tøris tilen -80 ° C fryser for lagring.
- Hvis der væv forblive kryopræservering Gentag trin 1.2.3 til 1.2.4. Tilsæt yderligere 2-methylbutan til bægeret eller flydende nitrogen til det ydre bad som nødvendig og re-cool til -140 ° C. Bortskaf brugte 2-methylbutan som farligt affald.
- Begynd afkøling af kryopræservering badet fem minutter før afslutningen af dissektion. Hæld 2-methylbutan i en åben metal bægerglas til en dybde på cirka 3 cm. Hæld flydende nitrogen til en isoleret beholder til en dybde på 2 til 4 cm. Sæt bægerglasset af 2-methylbutan i flydende nitrogen; nitrogenet vil begynde at koge. Undgå kvælstof sprøjt ind i 2-methylbutan bæger.
2. Opsaml kryosektioner til histologi og RNA Applications
- Forberedelse.
- Pre-vejer en DNase / RNase-frit autoklaveres rør på en analysevægt. Derefter flytte den ind i kryostatkammeret til forkøling. Gentag indtil rør er klar til alle puljede kryosektion prøver, der skal indsamles.
- For skeletmuskulatur sektionering, bekræfter, at kryostatkammeret temperaturen er -21 til -22 ° C ved sin interne termostat. Overføre beholdere med væv, der skal skæres i kammeret og tillade beholderen (r) at ækvilibrere til kryostat temperatur i mindst 15 minutter før åbning.
- Indsæt en ny engangs kryostat klinge. Alternativt fjerne den eksisterende blad, spray med RNase dekontaminering løsning, skyl med Hedeselskabet 2 O, og sæt ind i kryostat til afkøling. Spray en ren væv med 70% ethanol og omhyggeligt tørre kniven og kniven fastspænding platform.
- Spray en ren væv med en RNase dekontaminering løsning og tør kryostat pensler. Spray et væv med Hedeselskabet 2 O Tør børsterne igen og sæt dem i kryostatkammeret på en ren overflade.
FORSIGTIG: kryostat kniv bør være omfattet af kniven vagt, når den ikke er i brug. Også, RNase dekontaminering løsning er giftigt og vil fryse til dannelse af et bundfald i det kolde kryostatkammeret. Derfor håndteres med omhu og undgå dens anvendelse i kryostatkammeret.
- Spray en ren væv med en RNase dekontaminering løsning og tør kryostat pensler. Spray et væv med Hedeselskabet 2 O Tør børsterne igen og sæt dem i kryostatkammeret på en ren overflade.
- Inden kryostatkammeret, placere en skilling mellemstore dråbe (ca. 300 ul) af indlejring harpiks på en varm eksemplar chuck, sætte et væv kork på toppen af harpiksen, tryk ned, og derefter indstille chuck i freezing jernbane eller på en hurtig fryse element, hvis tilgængelig.
- Efter indlejring harpiks størkner (hvide), der tilsættes yderligere indlejring harpiks oven på proppen, rundt om den nedre 35% af vævet og tryk varmeafledningsblokken ind i indlejring harpiks til en hurtig fryse til bedre stabilisere vævet. Vente 5 min før sektionering at tillade harpiksen at hærde fuldt ud.
- Sikre, at objektklemmen er i sin mest tilbagetrukne position, længst borte fra klingen. Sæt vævsprøven Chuck ind objektklemmen.
- Kryosektion præparat.
- Løsn carrier holder bladet, indstille frivinkel af bladet til 10 ° (eller en vinkel passende for bladet carrier benyttes), og stram. Slip bremsen og drej håndhjulet for at sænke musklen mod klingen. Vurdere det tætteste afstand mellem vævet og bladet, derefter flytte vævet væk fra kniven og engagere håndhjulet bremse.
- Løsn højdejustering leveR og flytte klingebæreren frem eller tilbage, henholdsvis hvis slutningen af vævet er mere end ca. 2 mm fra klingen eller hvis klingen rammer vævet. Spænd og sænke vævet igen for at kontrollere afstand fra bladet. Gentag justeringer, indtil kniven er 1 til 2 mm fra enden af vævet ved visuel vurdering.
- Sænk væv mod klingen og vurdere væv vinkel for tværgående sektioner. Lås håndhjulet og slip objektklemmen håndtaget. Skub objektklemmen venstre eller højre, indtil den vandrette orientering af vævet er vinkelret på bladet.
- Skubbe prøve Spænd op eller ned for at justere "y" orientering, således at vævssnit vil være vinkelret på den lange akse af musklen. Spænd objektklemmen håndtaget.
- Brug forløbet og fine fremføring at fremme prøven, indtil den lige berører bladet. Hvis søge sektioner fra et bestemt væv dybde, nulstille summen af afsnittet tykkelser til nul (toppen af væv).
- Indstil kryostat til trim funktion med afsnit tykkelse på 30 um. Skær og kassér sektioner indtil den forud valgte dybde for vævs- samling er nået (f.eks 400 um fra toppen).
- Saml kryosektioner til RNA-ekstraktion.
- Åben tuben for indsamling sektioner og placere den i nærheden af bladet luftfartsselskab. Brug en forafkølet, ren børste at afhente hver sektion efter opskæring fra bladet og overføre kryosektionen ind i røret. Gentag, indtil de poolede sektioner vejer 30 mg eller det ønskede væv dybde er nået.
BEMÆRK: For en voksen mus tibialis anterior, indsamling fra væv dybde på ca. 400 til 4000 um giver typisk 25 - 40 mg. Brug metal pincet til at overføre dele til samlingen rør anbefales ikke, da afsnittene tendens til at klæbe og klumpe på metaloverfladen. - Hvis indlejring harpiks omgiver muskel kryosektion, låse håndbremsen og bruge en barberblad tilbarbere små stykker harpiks indtil der kun er et tyndt lag rundt om toppen af musklen. Skær altid harpiks med klingen vinklet væk fra musklen.
BEMÆRK: Et tyndt lag af indlejring harpiks ikke væsentligt forringe nedstrøms RNA forberedelse. Hvis tykkere indlejring harpiks er til stede, skal du bruge pensler til at drille den væk fra musklen før du flytter kryosektionen ind opsamlingsrøret. - Alternativt pool sektioner på vingen transportøren og overførsel i løs vægt til samlingen rør.
BEMÆRK: Denne metode har tendens til at være langsommere, og sektioner er mere tilbøjelige til at holde og klumpe sammen, hvilket kan reducere effektiviteten af nålen homogenisering i senere trin. - Hurtigt placere poolede kryosektionen røret i en analytisk balance og optage rør vægt. Straks returnere røret til den kolde kryostatkammeret for at opretholde sektion temperatur nær -20 ° C. Beregn vægten af de puljede sektioner.
BEMÆRK: Hvis vil forekomme RNA isolation på annonceifferent dag, lagre den poolede kryosektionen rør ved -80 ° C indtil anvendelse.
- Åben tuben for indsamling sektioner og placere den i nærheden af bladet luftfartsselskab. Brug en forafkølet, ren børste at afhente hver sektion efter opskæring fra bladet og overføre kryosektionen ind i røret. Gentag, indtil de poolede sektioner vejer 30 mg eller det ønskede væv dybde er nået.
- Saml kryosektioner til histologi.
- Tryk på knappen sektion tykkelse til fine sektionsopdelingen og brug pilene til at indstille kryostat sektion tykkelse til 7 pm (eller andre relevante afsnit tykkelse, typisk 6 til 10 um).
BEMÆRK: Fortynder sektioner (6 til 10 um) bør anvendes til histologiske applikationer at sikre, at farvningsreagenser kan trænge dybden af vævssnittet. Tynde snit kan tages fra en hvilken som helst dybde under cryosectioning, men dybere sektioner foretrækkes, fordi indlejring harpiks, hvilket øger vævets dybde, ikke skader histologisk farvning. - Klip og kassér 4 til 7 sektioner for at opnå en ensartet, selv vævet overflade. Notér vævet dybde.
- Skær en sektion og orientere det på overfladen af bladet bærer. Saml sektionen ved hurtigt og forsigtigt at røre en varm (stuetemperatur) objektglastil afsnittet om bladet luftfartsselskab. Retur dias til stuetemperatur. Fortsæt indtil antallet af ønskede dias er opnået. Notér det endelige væv dybde.
BEMÆRK: Indsamling en anden (dublet) afsnit for hver væv anbefales. - Med sektionering færdig, engagere håndhjulet bremse, prøven vende tilbage til den bageste position, og fjern vævet chuck. Brug kryostat varme element til at smelte indlejring harpiks holder vævet kork på prøven borepatron. Fjern væv kork, tør med væv, og vende tilbage til opbevaring.
- Gentag fra trin 2.1.2 for hver resterende væv. Tillad objektglassene tørre i 20 minutter efter den sidste væv er monteret. Brug derefter dias for histologisk eller immunfluorescensfarvning eller fryse ved -80 ° C i et dias boks indtil de skal bruges.
- Tryk på knappen sektion tykkelse til fine sektionsopdelingen og brug pilene til at indstille kryostat sektion tykkelse til 7 pm (eller andre relevante afsnit tykkelse, typisk 6 til 10 um).
3. RNA Isolation fra samlet kryosektioner
- RNA-ekstraktion
- Flyt rør (r) af poolede kryosektioner til is. tilføje Umiddelbart enorganisk RNA-ekstraktion reagens i et forhold på ca. 1 ml reagens pr 50 mg kryosektion vægt, typisk 600 pi pr rør.
ADVARSEL: RNA isolation reagenser er giftige, ætsende, og irriterende. Følg producentens anvisninger for sikker håndtering. - Anvendelse af en 1 ml sprøjte med en 18 gauge nål, trækker RNA ekstraktionsvæske op og skyl væggene i røret, indtil alt væv suspenderes i opløsningen. Prøv at minimere luftbobler under nål homogenisering.
- Brug spidsen af nålen at mash og dispergere eventuelle sammenklumpede kryosnit og stykker klæber til rørvæggen. Findeles at homogenisere ved at lede prøven op og ned gennem nålen for fem slag, og derefter returnere prøven til is. Gentag begge trin tre til fem gange, eller så mange gange, det er nødvendigt at afbryde alle klumper og videregive prøven let gennem nålen.
- Fjern 18 gauge nål og erstatte det med en 22 gauge nål. omhyggeligt triturate prøven til fem slag, og derefter returnere prøven til is. Gentag triturering tre til fire gange for at opnå en meget fint dispergeret vævshomogenat.
BEMÆRK: Hvis væv partikler begynder at blokere nålen ved udarbejdelsen prøven, bortvise alle prøve fra sprøjten og skifte tilbage til den 18 gauge kanyle til yderligere homogenisering. kan tilføjes et ekstra findeling trin med en 25 eller 26 gauge nål for at opnå maksimal udbytte. Imidlertid kan nålen blive tilstoppet, så der er en risiko for prøve spilde. - Flyt prøven fra isen til stuetemperatur. Der inkuberes i 5 min for at forstyrre molekylkomplekser.
- I et stinkskab, tilsættes 0,1 ml af anvendt 1-brom-3-chlorpentan (BCP) pr 1 ml RNA-isolering reagens (trin 3.1.1), typisk 60 pi pr rør. Ryst glasset kraftigt i hånden i 15 sekunder (ikke vortex). Prøven inkuberes ved stuetemperatur i 2 til 3 min. Derefter centrifugeres i 15 minutter ved 12.000 xg og 4 ° C.
FORSIGTIGHED: - indsamle forsigtigt den øverste vandige fase (farveløs), der indeholder RNA og overføre det til en ren rør. Tilføj et tilsvarende volumen 70% ethanol (i DEPC vand) og vortex at blande. Der inkuberes ved stuetemperatur i op til 10 min.
BEMÆRK: den midterste interfase og lavere phenol-BCP faser kan behandles til genomisk DNA og protein, henholdsvis ifølge producentens anvisninger eller opsamles i en phenol-BCP beholder farligt affald til korrekt bortskaffelse.
- Flyt rør (r) af poolede kryosektioner til is. tilføje Umiddelbart enorganisk RNA-ekstraktion reagens i et forhold på ca. 1 ml reagens pr 50 mg kryosektion vægt, typisk 600 pi pr rør.
- RNA oprensning.
- Følg producentens anvisninger for prøve binding, vask og eluering med mindre variationer 8. For eksempel:
- Placer en portion af DNase / RNase-frit vand i et 37 ° C bad eller inkubator til at pre-varme til trin 3.2.4.
- Tilsæt RNA-prøve fra 3.1.8 ovenfor til en oprensningssøjle og centrifugeres prøven i 15 sekunderved 12.000 xg ved stuetemperatur. Hæld gennemstrømningen tilbage i den samme kolonne og re-centrifuge. Gentag en ekstra gang for at maksimere RNA-bindende, og derefter kassere den endelige gennemstrømningen.
- Udfør vask trin i henhold til producentens anvisninger 8. Påfør 700 pi vaskebuffer (ingen ethanol) til søjlen, spin i 15 sekunder ved 12.000 xg, og kassér gennemstrømningen.
- Tilføj 500 pi vaskebuffer (med ethanol) til søjlen, spin i 15 sekunder ved 12.000 xg, og kassér gennemstrømningen. Gentag dette trin én gang.
- Spin den tomme kolonne i 1 min ved 12.000 xg for at tørre membranen.
- Overfør spin kolonne til en ren RNase-, DNase-fri rør. Tilsæt 40 pi forvarmet DNase / RNase-frit vand (blandt 3.2.1) til centrum af kolonnen membran. Ved stuetemperatur inkuberes i 2 min og centrifugeres i 2 minutter ved 12.000 x g.
BEMÆRK: 40 pi elueringsvolumen er cirka 1,3 pi per mg originalvæv til 30 mg puljede kryosektioner. Juster elueringsvolumenet som passende til forskellige udgangspunkt væv vægte, men reducerer ikke under 32 pi. En anden eluering under anvendelse af ca. 0,7 pi per mg oprindeligt væv, kan tilsættes til forøgelse af totalt RNA udbytte. - Analyser RNA (kolonne eluering) for koncentration og renhed ved et spektrofotometer, elektroforese, og / eller en Bioanalyzer. Opbevar RNA ved -80 ° C indtil brug for downstream applikationer, såsom revers transkription for kvantitativ PCR 4.
BEMÆRK: En DNase behandling anbefales, før du bruger RNA i efterfølgende anvendelser. Denne behandling kan udføres på nogle RNA oprensningssøjler før vasketrinnet, på dette specifikke tidspunkt efter søjleeluering, eller på en alikvot af RNA som det første trin i enhver nedstrøms anvendelse. RNA bør være stabil i flere år.
4. Histologisk analyse af Immunfluorescerende Staining Muskel kryosektioner
- Simpel immunofluorescens protokol.
- Brug en hydrofob pen til cirkel gruppen af afsnittene på hvert dias. Forsigtigt drop PBS i den cirkel område (ca. 80 pi for et mindre areal på op til 500 pi for et stort overfladeareal), sørg for ikke at røre ved vævene. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Hvis du bruger frosne dias, fjerne dias fra -80 ° C fryser og inkuberes ved stuetemperatur i 20 til 30 minutter til at tø og tør, gør som ovenfor. Der er behov for mindst to dias: en eksperimentel dias til inkuberes i primær og sekundær antistof; og én kontrol slide for hvilke primære antistof er udelukket, den "sekundære kun" kontrol. - Vip dias til hæld PBS. Tilsæt 5% donkey serum i PBS (blokerende opløsning) til cirkel område; være omhyggelig med at sikre, at muskelstykkerne ikke tørrer ud. Der inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter (eller op til flere timer i et fugtighedskammer).
- Forbered primære antistofopløsning at analysere muskelregenerationen. Bland blokerende opløsning, med et eMHC antistof (1:40) og et ColVI antistof (1: 1.000). Forbered ca. 150 pi, 300 pi eller 500 pi for små, mellemstore eller store slide områder, hhv. Vortex i 5 sek, og centrifugeres i 2 minutter ved 15.000 xg til pelletering eventuelt bundfald.
- For eksperimentelle dias, tip dias til hæld blokerende opløsning og derefter tilføje primært antistof løsning fra 4.1.3. For den sekundære kontrol dias, tip dias til hæld blokerende opløsning og derefter tilføje frisk blokerende opløsning (ingen antistof). Inkuber objektglassene i et fugtigt kammer ved 4 ° C natten over.
BEMÆRK: Når pipettering antistofopløsninger på objektglas, altid trække væske fra toppen af det primære antistofopløsning rør, ikke forstyrrer nogen bundfald i bunden af røret. - Tip glider til hæld opløsning. Tilføj PBS dråbevis til den cirkel region hver dias til at vaske, at tip hældeoff, hvorefter der tilsættes mere PBS og inkuberes i 3 til 5 min. Gentag for i alt tre vaske.
BEMÆRK: vasketid er ganske fleksibel og kan forlænges op til 20 min, hvis det ønskes. Generelt er antallet af opløsning ændres er vigtigere end tiden. - Forbered sekundært antistof løsning for alle objektglas (herunder fornyet kontrol slæden) anvendelse af en 1: 500 fortynding af røde og grønne fluorofor-koblede sekundære antistoffer til påvisning muse IgG1 (eMHC) og kanin IgG (ColVI) og 1: 10.000 fortynding af DAPI nukleare plet.
- For eksempel blande 1 ml af DAPI med 9 pi Hedeselskabet 2 O at gøre en 1:10 fortynding af DAPI. Så for en 500 pi slutvolumen, tilsættes 1,0 gi anti-muse lgG1-rød + 1.0 pi anti-kanin IgG-grøn + 0,5 pi 1:10 DAPI til 447,5 pi blokeringsopløsning. Vortex for at blande og centrifugeres i 2 minutter ved 15.000 xg for at pelletere eventuelt bundfald.
BEMÆRK: Ideelt set bør alle sekundære antistoffer være fra samme værtsart.
- For eksempel blande 1 ml af DAPI med 9 pi Hedeselskabet 2 O at gøre en 1:10 fortynding af DAPI. Så for en 500 pi slutvolumen, tilsættes 1,0 gi anti-muse lgG1-rød + 1.0 pi anti-kanin IgG-grøn + 0,5 pi 1:10 DAPI til 447,5 pi blokeringsopløsning. Vortex for at blande og centrifugeres i 2 minutter ved 15.000 xg for at pelletere eventuelt bundfald.
- Tip dias til at hælde ud for den sidste PBS vask. Tilføj sekundært antistof løsning til at dække alle væv. Dæk objektglassene for at beskytte dem mod lys og inkuber ved stuetemperatur i 30 min.
BEMÆRK: Alle sekundære antistoffer skal valideres for at have minimal krydsreaktivitet med andre arter i dobbelte eksperimenter mærkning. - Vask dias som beskrevet i 4.1.5. Efter den sidste vask, tip slide at hælde fra PBS og sætte dias på en væv. Tilføj 3 til 4 dråber af en vandig montering medie langs den ene side.
- Sæt kanten af et dækglas lige til den ydre kant af den monterings medier. Ved hjælp af pincet, langsomt sænke dækglasset mod væv, så slipper dækglasset og forsigtigt trykke det på plads. Endelig tryk forsigtigt hvert hjørne af dækglasset for at stabilisere den.
- Beskyt dias fra lys og opbevares ved 4 ° C indtil brug.
BEMÆRK: langtidsopbevaring, anvende et tyndt lag af neglelak langs kanten af the dækglasset for at hjælpe med at forhindre dias fra tørring.
- Brug en hydrofob pen til cirkel gruppen af afsnittene på hvert dias. Forsigtigt drop PBS i den cirkel område (ca. 80 pi for et mindre areal på op til 500 pi for et stort overfladeareal), sørg for ikke at røre ved vævene. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Histologisk evaluering.
- Billede dias ved hjælp af et epifluorescens eller konfokal mikroskop med passende filtre til at opdage eMHC (rød); ColVI (grøn); og DAPI-farvede kerner (blå), typisk under anvendelse af et 20X objektiv 1,5.
- Bekræft, at det fluorescerende signal fra eksperimentelle dias er forskellig fra den sekundære kontrol slide for at demonstrere specificitet eMHC og ColVI afsløring 4.
BEMÆRK: eMHC positive regenererende fibre skal være synlig fra ca. 2 til 7 dage efter en muskel skade og variabelt i mus med muskelsvind. Collagen VI er til stede i den ekstracellulære matrix omkring muskelfibre, blodkar og nerver og i de større bindevæv bundter af peri- og epimysium. DAPI nuklear pletten er nyttigt at identificere muskelfibre med centrale kerner versus perifere kerner angiver fiber regeneration, og tilstedeværelsen af infiltrating celler. Nekrotiske eller tilskadekomne fibre kan plette svagt med muse-IgG sekundært antistof skyldes påvisning af endogent IgG, der trænger ind i fibrene gennem beskadigede muskel membraner. - For at kvantificere regenerering, tage overlappende mikroskop billeder med hver fluorescerende filter hen over hele billedet. Flet de eMHC, ColVI og DAPI billeder til hvert sted, og derefter justere billeder til at rekonstruere et kort over hele afsnittet 1,5.
- Brug af analyse software, tælle antallet af eMHC positive fibre og antallet af totale fibre til beregning nylige regenerering (100 * (# eMHC + fibre / # Total fibre)). Også tælle antallet af centralt kerne fibre ud af de samlede fibre til at måle regenerering over en længere periode (100 * (# KN + fibre / # samlede fibre)) 1,5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Muskel kryosektion RNA er høj kvalitet og giver tilstrækkelig udbytte til de fleste applikationer
Analyser af seksten skeletmuskulatur RNA præparater er vist i tabel 1 under anvendelse af 19,4 til 41 mg af poolede tibialis anterior (TA) muscle fra 8 kontrolmus. Både venstre (L) og højre (R) TA muskler er udarbejdet i regenerering eksperimenter med muskler indsamlet 3 dage efter langsgående intramuskulær injektion af 25 pi saltvand eller 10 pM cardiotoxin at forårsage muskel skade ved brug af metoder tidligere rapporteret en. Som vist i tabel 1, A260 / 280-forhold for muskel kryosektion RNA er typisk tæt på 2 eller højere i disse repræsentative prøver. Som "ren" RNA anses for at have A260 / 280 på 2,0 og A260 / 280 på 1,8 til 2,2, renheden af kryosektion RNA-prøver er fremragende 9. Total RNA opsving var typisk oveR10 ug per prøve med udbytter på 0,18 til over 1 ug totalt RNA pr mg udgangsvæv, tilvejebringer tilstrækkelig materiale til de fleste efterfølgende anvendelser. Især RNA, total RNA ekstraheret, og RNA udbytte pr mg udgangsvæv fra TA muskler 3 dage efter toksin skade var signifikant højere end fra saltvandsinjicerede TA'er. Dette antyder, at der er forbedret homogenisering når muskel struktur forstyrres af omfattende skader og / eller at der er en stigning i gentransskription og / eller RNA stabilitet i 3 dage regenererende muskel. Den vedvarende RNA kvalitet blev vurderet ved simpel 1x TAE / 1,5% agarosegelelektroforese af 1 pi muskel kryosektion RNA efter prøver blev opbevaret ved -20 ° C i 18 måneder. Fremtrædende 18S og 28S rRNA-båndene er stadig tydelige i prøver demonstrerer høj RNA kvalitet, selv under suboptimale opbevaringsbetingelser (figur 1A).
Muskel kryosektion RNAunderstøtter downstream-applikationer
Et mikrogram af RNA pr puljet kryosektion prøve blev behandlet med DNase og revers transkriberet fra oligo dT-primere. Efter RNase behandling, det samlede volumen af revers transkriberet cDNA var 30 pi. En simpel, ikke-kvantitativ PCR med overskud af amplifikation blev kørt for at bekræfte levedygtigheden af cDNA. Myogene regulatoriske faktor 4 (Mrf4), en transskriptionsfaktor opreguleret med muskel differentiering, blev amplificeret under anvendelse af tidligere beskrevne muse-primere, sense 5'-CTACATTGAGCGTCTACAGGACC og antisense 5'-CTGAAGACTGCTGGAGGCTG 10, fra 2 pi skabelon ved hjælp standard PCR. Der var robust, specifik amplifikation af 234 bp Mrf4 fragment fra både venstre og højre TA cDNA prøver, men ikke RT- (RNA inkluderet, men ingen revers transkriptase), RT Hedeselskabet 2 O (revers transkription med ingen RNA-template), eller ddH 2 O PCR kontroller (Figur 1B).De samme prøver blev kørt tredobbelt for Mrf4 og mOaz1 henvisning kontrol 4 kvantificering under anvendelse relative forstærkning og passiv fluorescens henvisning en real-time PCR-system. Mrf4 blev udtrykt på 0,097 gange i toksinet-injicerede højre TA sammenlignet med saltvandsinjicerede venstre TA, beregnet af ΔΔCt metode 4. Dette svarer til tidligere rapporter med lav Mrf4 udtryk 3 dage efter toksin skade på grund af et tab af modne muskelfibre 11. At sammenligne sammenhængen i kryosektionen RNA til kvantitativ PCR blev Ct-værdier sammenlignet for mOaz1 henvisningen genet. Fra seks prøver blev mOaz1 afskrift detekteret med en gennemsnitlig Ct af 17,242 ± 1,483 sd, mens gennemsnittet Ct var 36,332 ± 3,61 sd i RT kontrolprøver (n = 4). Den stramme gruppering af mOaz1 Ct-signaler på tværs af prøver viser, at RNA isoleret fra TA muskel kryosektioner opfører sig som forventet i downstream RNA udtryk analyser.
Eksempler på indirekte immunfluorescensfarvning af 7 um tibialis anterior muskel sektioner fra samme kuld kontrolmus 3 dage efter toksin injektion er vist til at detektere regenererende fibre (figur 2). Begge sektioner blev opsamlet fra muskler under 150 um fra området, der skal anvendes til RNA-analyse ved en dybde på 4,5 til 4,6 mm fra den proximale muskel overflade. Embryonale myosin tung kæde (eMHC, rød) registrerer regenererende fibre, kollagen VI (ColVI, grøn) skitserer de muskelfibre, og DAPI pletter kerner blå, ifølge protokol 4. Regioner med koncentreret nukleare infiltrat (blå signal) angiver steder af toksin skade , som tydeligt ved aktivering af eMHC positive nyligt regenererende muskelceller. Hele afsnit kort som dette eksempel anvendes til kvantificering af regenerering ved at beregne andelen af embryonic myosin tung kæde-udtrykkende fibre (rød, nyligt regenereret) eller centralt nukleerede fibre som rapporteret tidligere 1. Navnlig er der overraskende lidt skade i TA musklen i figur 2A. Mens der er variation mellem injektionerne typiske toxin injektioner påvirker en meget større andel af musklen rummet 1, som vist i figur 2B. Denne histologiske analyse tyder derfor, at toksin skade i figur 2A var minimal, og et vigtigt redskab til at fortolke genekspression data fra den tilstødende muskel kryosektionen RNA prøve. Hvis hele musklen var blevet anvendt til RNA-fremstilling ved standardmetoder formaling metoder, ville den uventet lille skade område af denne prøve gør det en outlier, der ville skew downstream analyser. I stedet parring histologisk kvantificering fra samme muskler tillader direkte måling af omfanget af skaden fra tilstødende sektioner. Dette muliggør brugen af inclusion / eksklusion kriterier for at sikre, at alle prøver indgår i downstream-RNA analyser opfylde en minimumsgrænse skade eller normalisering af RNA analyser efter skade størrelse.
Figur 1: Kvalitet Vurdering af RNA fra samlet Muscle kryosektioner. A) 18S og 28S ribosomale RNA bands er fremtrædende i RNA fra poolede muskel kryosektioner 18 måneder efter RNA forberedelse. B) Ikke-kvantitativ PCR for Mrf4 efter revers transkription. 200 og 300 bp bånd af et DNA-stige er vist. RT-, revers transkription reaktion med RNA-template, men ingen revers transkriptase. RT-H2O, revers transkription med Hedeselskabet 2 O, ingen RNA-template. H2O, ingen skabelon PCR-kontrol med Hedeselskabet 2 O. I disse eksperimenter toksin blev injiceret i den højre tibialis anterior (RTA) og saltvand was injiceret i venstre (LTA). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Prøve Maps Histologiske for muskelregenerationen Studies. A, B) Udarbejdet kort af enkelt tibialis anterior muskel §§ 3 dage efter toksin injektion viser eksempler på dårlig (A) og normal (B) toksin-induceret skade. Hvide indrammede områder af hver sektion kort er vist som indeniliggende billeder til højere forstørrelse visning, Rød, embryonale myosin tung kæde; grøn, collagen VI ekstracellulære matrix-protein; blå, DAPI nuklear farvning. Scale bar, 100 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Repræsentant RNA udbytte og renhed Målinger fra samlet Muskel kryosektioner. Seksten tibialis anterior (TA) muskler blev snittet og puljede kryosektion prøver blev behandlet for RNA. Oprenset RNA (1 pi) blev analyseret med et nanospectrophotometer. Kolonne statistik blev udført i et regneark, blev gruppe sammenligninger udført ved hjælp af statistisk software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at opnå de bedste resultater med denne metode, holde indlejring harpiks begrænset til den nederste tredjedel eller halvdelen af musklen under vævet kryopræservering fordi overskydende harpiks vil bremse indsamlingen af de samlede kryosnit og kan øge indlejring harpiks forurening i RNA isolation. Også, omhyggelig opmærksomhed under nålen homogenisering er vigtigt at maksimere udbyttet og minimere sandsynligheden for tilstopning af nålen. Protokollen kan ændres ved hjælp af en Luer-Lok sprøjte til at beskytte mod prøve tab, hvis nålen bliver blokeret og kræver højt tryk for at fjerne træsko. Et yderligere nål homogeniseringstrin med en 25 eller 26 gauge nål kan også tilsættes for at fremstille en finere vævssuspension til yderligere forbedret RNA udbytte. Mens chloroform kunne anvendes i stedet for BCP, er dette ikke anbefales som BCP er mindre toksisk og resulterer i lavere niveauer af genomisk DNA-kontaminering i den vandige fase under organisk ekstraktion af RNA 12. Stigendeafsnittet tykkelse for puljede kryosektioner over 30 um er heller ikke anbefales som homogenisering vil være mindre effektive.
Hvis RNA udbytte er under ønskede niveauer kan forskellige strategier anvendes til at forøge genvinding såsom: i) øge milligram mængde udgangsmateriale for at øge mulig udbytte; ii) reducere snittykkelse under 30 um til forbedring mekanisk homogenisering af vævet; iii) øge varigheden af prøven inkubation og nål homogenisering i den organiske udvinding reagens for at forbedre mekaniske og kemiske væv forstyrrelser; og iv) hvis væv klumper tilbage, udføre en anden ekstraktion takt med strengere nål homogenisering. Alternativt kan der være vævsspecifikke overvejelser, såsom yderligere trin faseadskillelse og nedbør for prøver med højt proteoglycanindhold 13. Under RNA søjlerensning, kan et større elueringsvolumen anvendes, og udføre en anden eluering kan maximize total RNA opsving, men på bekostning af RNA koncentration. En post column alkoholpræcipitation kan anvendes til at koncentrere RNA hvis lav koncentration er en bekymring med denne modifikation. Hvis RNA-nedbrydning er et problem, hvilket reducerer tid til kryopræservering under dissektion, at strengere rengøring af kryostat-overflader og værktøjer minimere RNase eksponering, udfører nålen homogeniseringstrinnet i et koldt rum, tilsætning af en RNase-inhibitor reagens til kryosektionerne 14, og hyppige udskiftning af RNase-frit opløsninger kan hver bidrage til at forhindre eller minimere eksponering af RNaser og reducere spaltning aktivitet. Det er muligt, at kortvarigt badning vævet i en RNase-inhibitor reagens efter dissektion, men før kryokonservering, kan yderligere reducere nedbrydning af prøven. Dog bør udføres indledende forsøg for at sikre, at en sådan behandling ikke øger iskrystaller eller andre artefakter under nedfrysning.
Mens embryonalemyosin tung kæde / kollagen VI indirekte immunofluorescens anvendes her som et eksempel for muskel analyse af skade, tynde kryosnit monteret på objektglas fra disse eksperimenter kan bruges til alle relevante histologiske plet, der kan udføres på frosne sektioner, herunder immunfluorescerende teknikker med posten -fixation og hematoxylin / eosin-farvning. Faktisk kan tilpasninger til den enkle immunfluorescent protokollen tilvejebragt her være nødvendig. For eksempel anti-muse sekundære antistoffer anvendes til at detektere en mus primært antistof (fx eMHC) kan også detektere endogene muse immunglobuliner i målvævet. Sådanne endogene antistoffer typisk akkumuleres i beskadigede eller nekrotiske muskelfibre i såret eller dystrofisk muskel forårsager baggrund immunfluorescensfarvning. En sekundær kontrol slide (med primært antistof udeladt) bør altid undersøges for at vurdere specificiteten af farvning. Hvis endogen antistofproduktion baggrund er problematisk, bør præ-blok trin væreføjet til protokollen for at forebygge eller minimere detektering af endogene muse immunglobuliner 15.
De vigtigste begrænsninger for fremgangsmåden er, at den kræver en kryostat, og det er tidskrævende, hvilket gør det relativt lille produktion. For eksempel, en ekspert i teknikken var i stand til at behandle op til 16 muskler til poolede kryosnit og objektglas (8 slides med duplikerede sektioner af alle 16 væv) i ca. 9 til 10 timer. For nybegyndere at cryosectioning, indsamling af samlede kryosektioner fra 2 til 4 prøver med rimelighed kunne beherskes efter kryostat træning og en eller to træningssessioner i stedet opnå kvalitet kryosektioner til histologi tog mere erfaring. Derfor kan udstyr, tid eller uddannelse faktorer gør denne metode mindre nyttigt for blødere væv, der kan være godt homogeniseret med en manuel støder homogenisator.
I sammenligning med ikke-kryostat homogeniseringsmetoder, tværstribede muskler RNA-fremstillings er rapporteret fra muskelbiopsier med RNA udbytter af 0,05 til 0,7 ug RNA pre mg muskel 16 og senest 0,27-1,08 ug RNA per mg muskel 17. Derfor er den her beskrevne teknik giver RNA udbytter så gode som eller bedre end ikke-kryostat-metoder med den ekstra fordel, at parret histologisk analyser fra en sammenhængende region af den samme prøve. Især en tidligere undersøgelse anvendes også cryosectioning for homogenisering i vertebral væv og tilsvarende konstateret, at cryosectioning væv forbedret homogenisering effektivitet for RNA-isolering 13. Da denne teknik blev testet i kvæg skeletmuskulaturen prøver, det gennemsnitlige RNA udbytte pr prøveforberedelse var 4,09 ± 0,36 ug, i den lave ende af normalområdet rapporteret her 13. Laser capture microdissection er et andet alternativ til opsamling af væv til RNA-ekstraktion fra en kryosektion. Laser capture er overlegen i forhold til denne poolede kryosektion metode iat det tillader specificiteten at indsamle kun en ønsket undergruppe af celler fra sektionen og den kan udføres på en enkelt vævssnit op til 50 um tyk 18. samling af en mikro-dissekeret prøve, kan imidlertid være svært og egnet udstyr er ikke almindeligt tilgængelig, hvilket gør pooled kryosektion homogenisering mere tilgængelig for forskere. Når begge metoder er tilgængelige, til en præference analysere et væv sub-region for et program behøver kun små RNA mængder ville favorisere laser capture mikrodissektion mens pooled kryosektion homogenisering er bedst, når sub-region analyse er mindre vigtig, og der er behov for større mængder af RNA.
Mens histologiske og RNA isolation metoder er i fokus her, er den poolede kryosektionen metoden let tilpasses til at forberede proteinlysater for Western blot analyser eller enzym aktivitet målinger. For eksempel blev puljede kryosektioner fra hjertet solubiliseret til Western blot-analyser 4 and poolede kryosektioner fra TA blev homogeniseret for succinatdehydrogenase aktivitetsassays af mitokondriefunktionen 5. Alternativt kan genomiske DNA og proteinfraktioner separeres fra andre faser i den organiske ekstraktion efter RNA-isolering, der tilbyder muligheden for at udlede genomisk DNA, protein, RNA og histologiske målinger fra en enkelt væv efter en enkelt kryostat session.
Samlet set den største fordel ved denne metode er at øge eksperimentel fleksibilitet ved at give flere analytiske tilgange, der kræver forskellig prøveforberedelse fra et enkelt væv. Metoden er mest hensigtsmæssigt for muskler og andre væv med omfattende intra- eller ekstracellulære struktur, der reducerer effektiviteten af pistil-baserede væv homogenisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cork | VWR Scientific | 23420-708 | Cut into small squares with a sharp blade. |
| Plastic coverslip | Fisher Scientific | 12-547 | Used to orient the muscle during freezing. |
| Low temperature thermometer | VWR Scientific | 89370-158 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631-4L | Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet. |
| Embedding resin: "cryomatrix" | Thermo Fisher Scientific | 6769006 | Other embedding resins can be substituted for cryomatrix. |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific | microm HM550 with disposable blade carrier | Any working cryostat should be sufficient for the protocol. |
| Disposable cryostat blade | Thermo Fisher Scientific | 3052835 | Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used. |
| RNAse decontamination solution: "RNase Zap" | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS64 | |
| Paint brush | Daler Rowney | 214900920 | Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies. |
| Razor blade | VWR Scientific | 55411-050 | |
| Microscope slide | VWR Scientific | 48311600 | |
| RNA organic extraction reagent: TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle. |
| 18 gauge needle | VWR Scientific | BD305185 | |
| 22 gauge needle | VWR Scientific | BD305155 | |
| 26 gauge needle | VWR Scientific | BD305115 | Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol. |
| 1 ml syringe | VWR Scientific | BD309659 | For very high value samples, a Luer-Lok syringe is recommended (e.g., VWR BD309628). |
| 1-bromo-3-chloropentane (BCP) | Sigma | B9673 | |
| For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol | Decon Laboratories, Inc. | +M18027161M | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water. |
| For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9922 | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water. |
| RNA purification kit: PureLink RNA minikit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | Final steps of RNA preparation. |
| DNase/Rnase-free water | Gibco | 10977 | DEPC-treated water can also be used. |
| Spectrophotometer: Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | AM2222 | Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications. |
| Hydrophobic pen | Thermo Fisher Scientific | 8899 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco | 14190 | PBS for immunofluorescence protocol. |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc | 017-000-121 | Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence. Normal goat serum can also be used. |
| eMHC antibody | University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank | F1.652 | |
| Collagen VI antibody | Fitzgerald Industries | #70R-CR009x | |
| Donkey anti-rabbit AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546 | Thermo Fisher Scientific | A21123 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Aqueous mounting media: Permafluor | Thermo Fisher Scientific | TA-030-FM | Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties. |
| Glass coverslip | VWR Scientific | 16004-314 | Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl |
| Image analysis software: ImageProExpress | Media Cybernetics, Inc. | Image-Pro Express, or more advanced products | Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process; e.g., ImageProPremier. |
| Merge and map section images: Photoshop | Adobe | Photoshop | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9659 | Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated. |
| reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used. |
| Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system | Promega | M8298 | Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead. |
| SYBR green | Thermo Fisher Scientific | S7585 | For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers. |
| ROX: SuperROX, 15 mM | BioResearch Technologies, Inc. Novato CA | SR-1000-10 | SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments |
| Real-time PCR | Applied Biosystems | 7900HT |
References
- Foltz, S. J., et al. Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice. PLoS One. 11 (1), 0147049 (2016).
- Bartoli, M., et al. Noninvasive monitoring of therapeutic gene transfer in animal models of muscular dystrophies. Gene Ther. 13, 20-28 (2006).
- Ip, W. T., Huggins, C. E., Pepe, S., Delbridge, L. M. Evaluating RNA preparation options for archived myocardial biopsies. Heart Lung Circ. 20 (5), 329-331 (2011).
- Beedle, A. M., et al. Mouse fukutin deletion impairs dystroglycan processing and recapitulates muscular dystrophy. J. Clin. Invest. 122 (9), 3330-3342 (2012).
- Foltz, S. J., et al. Four-week rapamycin treatment improves muscular dystrophy in a fukutin-deficient mouse model of dystroglycanopathy. Skeletal Muscle. 6, 20 (2016).
- AVMA Guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). Available from: www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx 1-102 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat. Protoc. 10, 1612-1624 (2015).
- Rump, L. V., Asamoah, B., Gonzalez-Escalona, N. Comparison of commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA from Salmonella cells. BMC Res. Notes. 3, 211 (2010).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).
- Valdez, M. R., Richardson, J. A., Klein, W. H., Olson, E. N. Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin, MyoD, and MRF4. Dev Biol. 219 (2), 287-298 (2000).
- Pavlath, G. K., Dominov, J. A., Kegley, K. M., Miller, J. B. Regeneration of transgenic skeletal muscles with altered timing of expression of the basic helix-loop-helix muscle regulatory factor MRF4. Am. J. Pathol. 162 (5), 1685-1691 (2003).
- Chomczynski, P., Mackey, K. Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation. Anal. Biochem. 225 (1), 163-164 (1995).
- Lee, J. T. Y., Cheung, K. M. C., Leung, V. Y. L. Extraction of RNA from tough tissues with high proteoglycan content by cryosection, second phase separation and high salt precipitation. J. Biol. Methods. 2 (2), 20 (2015).
- Guo, D., Catchpoole, D. R. Isolation of intact RNA following cryosections of archived frozen tissue. BioTechniques. 34, 48-50 (2003).
- Goodpaster, T., Randolph-Habecker, J. A flexible mouse-on-mouse immunohistochemical staining technique adaptable to biotin-free reagents, immunofluorescence, and multiple antibody staining. J. Histochem. Cytochem. 62 (3), 197-204 (2014).
- Ikezawa, M., Minami, N., Takahashi, M., Goto, Y., Miike, T., Nonaka, I. Dystrophin gene analysis of 130 patients with Duchenne muscular dystrophy with a special reference to muscle mRNA analysis. Brain Dev. 20 (3), 165-168 (1998).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Anal. Biochem. 474, 25-27 (2015).
- Espina, V., Heiby, M., Pieroban, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Rev Mol Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
