Generazione di integrazione-liberi cellule staminali pluripotenti indotte dalle cellule mononucleari di sangue periferico umano Utilizzando episomiale Vettori

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la generazione efficiente di iPSC prive di integrazione da cellule del sangue periferico adulto umano. Con l'uso di quattro vettori episomiali basati su oriP/EBNA per esprimere i fattori di riprogrammazione, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 e SOX2, è possibile ottenere migliaia di colonie di iPSC da 1 mL di sangue periferico.

Abstract

Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) molto promettenti per la modellazione della malattia e terapie rigenerative. Abbiamo precedentemente riportato l'uso di episomiale Vettori (EV) per generare iPSCs senza integrazione da cellule mononucleate del sangue periferico (PB MNC). I vettori episomiale utilizzati sono plasmidi di DNA incorporati con oriP e EBNA1 elementi dal virus di Epstein-Barr (EB), che permettono per la replica e lungo termine retainment di plasmidi in cellule di mammifero, rispettivamente. Con ulteriore ottimizzazione, migliaia di colonie IPSC possono essere ottenuti da 1 mL di sangue periferico. Due fattori critici per ottenere l'efficienza alta riprogrammazione sono: 1) l'uso di una 2A "auto-scissione" peptide per collegare OCT4 e SOX2, ottenendo così espressione equimolare dei due fattori; 2) l'uso di due vettori per esprimere MYC e Klf4 singolarmente. Qui si descrive un protocollo step-by-step per la generazione di IP libero-integrazioneSC da adulti campioni di sangue periferico. I iPSCs generati sono privi di integrazione come plasmidi episomiale residui sono rilevabili dopo cinque passaggi. Sebbene l'efficienza riprogrammazione è paragonabile a quella di Sendai Virus (SV) vettori, plasmidi EV sono notevolmente più economico rispetto ai vettori disponibili in commercio SV. Questo sistema EV riprogrammazione accessibile rappresenta un potenziale per le applicazioni cliniche in medicina rigenerativa e fornisce un approccio per la riprogrammazione diretta delle multinazionali PB alle cellule senza integrazione mesenchimali staminali, cellule staminali neurali, ecc.

Introduzione

Dopo forzata espressione di diversi fattori di trascrizione (Cioè OCT4, SOX2, MYC e Klf4), cellule somatiche possono essere riprogrammate a cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), che detengono una grande promessa per applicazioni in medicina rigenerativa e terapia di sostituzione cellulare ^1-3. Fino ad oggi, diversi metodi sono stati sviluppati per aumentare il tasso di successo della riprogrammazione ^4-7. Vettori virali indotta riprogrammazione è ampiamente utilizzato per la generazione efficiente di iPSCs, perché l'integrazione virale porta ad un alto livello, espressione stabile dei fattori di riprogrammazione....

Protocollo

Tutti i campioni PB umani sono stati ottenuti da donatori adulti anonimi senza informazioni di identificazione disponibili da Tianjin Blood Center con l'approvazione del comitato etico di ricerca locale.

1. Endo-libera plasmidi Preparazione

1. Utilizzare un kit commerciale plasmidi Purificazione Maxi per estrarre i vettori episomiale da E. coli secondo il protocollo del produttore. Per il passo finale, sostituire tampone TE con acqua sterile priva di endotossine per sciogliere il pellet di DNA.
2. Misurare la concentrazione di DNA utilizzando un commerciale UV / Vis spettrofotometro. La concentrazione è di soli....

Risultati

Usando questo protocollo, si possono ottenere centinaia di colonie da 1 x 10 ⁵ nucleofected PB multinazionali (Figure 1A e 1B). L'efficienza riprogrammazione è circa 0,2 - 0,5% e le colonie esprimono marcatori pluripotenza (Figure 1C e 1D). iPSCs generati utilizzando il protocollo descritto sono privi di integrazione e hanno la capacità di formare teratoma comporre i 3 strati germinali (figure 1E

Discussione

L'acquisizione di campioni di sangue da donatori sani o pazienti è conveniente e non invasivo, che lo rende una fonte di cellule interessante per la ricerca di base e clinica di terapia cellulare. Qui abbiamo descritto un protocollo per altamente efficiente generazione di iPSCs privo di integrazione da campioni di sangue periferico. Questo approccio riproducibile e accessibile dovrebbe beneficiare il campo IPSC.

Abbiamo riportato che ci sono due fattori critici responsabili altamente eff.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Terreno di espansione delle cellule staminali ematopoietiche	Sigma	S0192	Negozio a 4 ° C
Fattore di cellule staminali umane (SCF)	Peprotech	300-07	Conservare a -20 o -80 ° C
Interleuchina-3 (IL-3)	Peprotech	AF-200-03	Conservare a -20 o -80 ° C
Eritropoietina (EPO)	Peprotech	100-64	Conservare a -20 o -80 ° C
Fattore di crescita dell'insulina-1 (IGF-1)	Peprotech	100-11	Conservare a -20 o -80 ° C
Desametasone	Sigma	D4902	Conservare a -20 o -80 ° C
1-tioglicerolo (MTG)	Sigma	M6145	Conservare a -20 o -80 C
DMEM/F12 medio	Gibco	112660-012	Negozio a 4 gradi C
L-glutammina (100x)	Gibco	25030-081	Conservare a -20 ° C
Penicillina/Streptomicina (100x)	Gibco	15140-122	Conservare a -20 C
Soluzione di aminoacidi non essenziali (100x)	Gibco	11140-050	Conservare a 4 gradi C
Fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2)	Peprotech	100-18B	Conservare a -20 o -80 ° C
Insulina-Transferrina-Selenio (ITS, 100x)	Gibco	41400-045	Conservare a 4 gradi; C
Acido ascorbico	Sigma	49752	Conservare a -20 C
DMEM (glucosio alto) medio	Thermo	SH30243.01B	Conservare a 4 gradi C
Siero Fetale Bovino (FBS)	Hyclone	SV30087.01	Conservare a -20 ° C
Ficoll	GE Healthcare, SIGMA	17-5442-02	Negozio presso RT
Trealosio	Sigma	T9531	Negozio presso 4 ° C
Dimetilsolfossido (DMSO)	Sigma	D2650	Negozio presso RT, proteggere dalla luce
Endofree Plasmid Maxi Kit (10)	Qiagen	12362	Negozio presso RT
IMDM	Gibco	21056-023	Negozio a 4 ° C
Kit di nucleofecazione cellulare CD34+ umano	Lonza	VPA-1003	Conservare a RT, il tampone di nucleofecazione e l'integratore devono essere conservati a 4 ° C
Butirrato di sodio	Sigma	B5887	Conservare a -20 o -80 ° C
ROCK inibitore - Y27632	STEMGENT	04-0012-10	Conservare a -20 ° C
Essential 8 medio basale (E8)	Gibco	A15169-01	Negozio a 4 ° C, l'integratore deve essere conservato a -20 o -80 ° C
Matrigel	BD	354277	Negozio a -20 o -80 ° C
2x EasyTaq PCR SuperMix (+colorante)	TransGen Biotech	AS111	Conservare a -20 ° C
Soluzione per il distacco delle cellule	STEMGENT	01-0006	Conservare a -20 ° C, Accutase come soluzione di distacco cellulare per ottenere una sospensione a cellula singola
DAPI	Sigma	D9542-1MG	Conservare a 4 o -20 ° C
Anti-Nanog AF488	BD	560791	Negozio a 4 gradi C, anticorpo primario utilizzato per l'immunofluorescenza, diluire 1/100 quando utilizzato
Anti-OCT4	abcam	ab19857	Conservare a 4 gradi C, anticorpo primario utilizzato per l'immunofluorescenza, diluire 1/100 quando utilizzato
AF488 asino anti-topo	IgG Invitrogen	A21202	Conservare a 4 gradi; C, anticorpo secondario utilizzato per l'immunofluorescenza,  diluire 1/500 quando usato
PE anticorpo umano TRA-1-60-R	Biolegend	330610	Conservare a 4 gradi C, anticorpo utilizzato per la citometria a flusso
eFluor 570-coniugato anti-SSEA4	eBioscience	41-8843	Conservare a 4 gradi; C, anticorpo utilizzato per la citometria a flusso
Anticorpo isotipo	eBioscience	11-4011	Conservare a 4 ° C, anticorpo utilizzato per la citometria a flusso
Kit di rilevamento della fosfatasi alcalina	SiDanSai	1102-100	Conservare a 4 gradi; C
Kit di estrazione del DNA genomico	TIANGEN	DP304-02	Conservare presso RT
Soluzione di Trypan Blue	Sigma	T8154	Conservare presso RT
Citometria a flusso Analizzatore cellulare	BD	LSRII
Microscopio confocale a disco rotante (SDC)	PerkinElmer	UltraVIEW VOX	per imaging confocale
Dispositivo di nucleofeczione	Lonza	Nucleofector 2b	per la nucleofeczione di PB MNC
ImageQuant LAS-4010	GE		per scattare foto della colorazione AP in blocco