可调谐的肺部细胞外基质水凝胶用于三维细胞培养

摘要

这是一种利用肺部细胞外基质制备三维细胞培养支架的方法。将完整的肺组织加工成水凝胶，该水凝胶可支持细胞在三维环境中生长。

摘要

在此，我们介绍一种用于建立多组分细胞培养水凝胶的方法 体外 肺细胞培养。从健康的 整块 猪、大鼠或小鼠的肺组织经灌注后浸入一系列化学去垢剂中以去除细胞碎片。组织处理前后的组织学比较显示，双链DNA去除率超过95%，α-半乳糖苷酶染色表明大部分细胞碎片已被清除。脱细胞后，组织经冷冻干燥并 cryomilled 研磨成粉末。基质粉末在酸性胃蛋白酶消化液中消化48小时，随后中和形成预凝胶溶液。预凝胶溶液在37 °C孵育可诱导凝胶化，中和后可立即使用，或于4 °C保存最多两周。可将预凝胶溶液涂布于未经处理的培养板表面，用于细胞贴附。细胞可在自组装前悬浮于预凝胶中以实现三维培养，或接种于已形成的凝胶表面使其迁移穿过支架，亦可接种于涂层表面。对上述策略的任何调整均可能影响凝胶化温度、凝胶强度或蛋白片段大小。除水凝胶形成外，还可使用genipin提高水凝胶的刚度。

引言

翻译 体外 将研究成果应用于临床是生物医学研究人员面临的最具挑战性的问题之一。 体外 关于组织培养塑料的研究更简便、更便捷，且能保持较高的细胞活性。¹ 这种方法是一个合理的起点，但其结果在临床转化方面存在局限性。目前，越来越多的实验室正在采用三维结构来替代传统的二维方法。针对多种三维环境（从生物支架到聚合物支架）的综述文献已有广泛报道。^2,3

生物框架可以模拟特征 体内 环境，因为它们含有大量天然基质中的蛋白质和糖胺聚糖成分，可为细胞提供熟悉的附着与识别结合位点。来源于细胞外基质（ECM）的材料已被证实可作为支持细胞附着和增殖的有效支架。⁴ 限制细胞外基质（ECM）水凝胶平台应用的一个挑战源于其凝胶化后固有的较弱力学性能。天然组织的力学性能通常远高于水凝胶。使用无毒交联剂可提高水凝胶的力学性能，从而更有效地模拟天然组织的微环境。京尼平（genipin）是一种源自栀子植物的无毒天然交联剂，可通过调节其浓度精确调控ECM水凝胶的力学性能。^5,6.

体内几乎所有细胞都存在于由其自身产生或维持的细胞外基质（ECM）中，并在该基质上进行组织。近年来，人们对ECM在各个器官或系统中的结构、状态和功能所具有的普遍重要性日益关注，这推动了基于基质的实验平台的开发与应用。 体外 ....

方案

溶液	无菌过滤	操作说明
DiH2O	是	DiH2O；经无菌过滤
0.1% Triton X-100 溶液	是	在通风橱中，将 100 µl Triton-X 100 溶液加入 100 ml DiH2O 中，搅拌至溶解； 经无菌过滤
2% 脱氧胆酸钠溶液	是	在通风橱中，每 100 ml DiH2O 中加入 2 g 脱氧胆酸钠溶液， 搅拌至溶解；经无菌过滤
1 M NaCl	是	将 58.44 g NaCl 加入 1 L DiH2O 中；搅拌至溶解； ....

结果

利用该方法，我们已从正常的猪、大鼠和小鼠肺组织中制备出水凝胶（图1）。经处理的肺组织分别可提供约5 mg、40 mg和10 g的ECM粉末。该过程的总体流程如图2所示。过程中的关键可视化特征包括：脱氧胆酸钠冲洗后肺组织呈白色；预凝胶形成后，溶液应呈不透明状，并在4 °C保存时数月内保持均匀。我们提供了一个基本的故障排查表，以帮助识别整个过程中可能出现的错误来源（表2）。水凝胶形成后可立即使用，也可储存以备后续使用。流变学检测证实，在达到37 °C后的最初几分钟内，超过90%的凝胶化过程已完成（图3）。形成的水凝胶在PBS中可长期保持稳定，但细胞的黏附和增殖能力可能发生变化（图4）。

尽管本方案是针对猪肺编写的，但由于空间限制，我们在脱细胞化猪肺时只能使用一个肺。我们已采用相同的方法并稍.......

讨论

生物学的一个核心特征是分子自组织形成具有特定功能的层级结构。¹³ 在实验室中，自组装过程依赖于多种因素，如盐浓度、pH值和消化时间。如图所示，当溶解的蛋白质恢复至生理温度时，会形成一种自组织水凝胶。该水凝胶能够促进细胞黏附与增殖 体外.

使用聚合物无法研究细胞对细胞外基质（ECM）生物物理信号的响应。利用其他组织无法研究组织特异性细胞对生物物理信号的响应。器官再生研究者和临床医生认为，使用脱细胞支架可促进组织再生和伤口愈合。慢性肺病患者需要改进治疗方法，以增加器官可获得性并降低免疫原性。必须研究器官特异性的细胞-细胞外基质相互作用，以进一步推动器官生物学的发展。

使用细胞外基质（ECM）作为肺细胞的细胞支架已显示出稳定的结果。^14,15 利用来自疾病模型的肺组织切片可促进疾病再生¹⁶，远端肺中发现的干细胞或祖细胞^17,18 需要特殊的微环境以防止畸胎瘤的形成。使用组织特异性ECM作为递送载体，可增强祖细胞的再生效应。ECM.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
曲拉通 X-100	费舍尔科技	BP151-100	在通风橱中使用，并佩戴护目镜和手套。
脱氧胆酸钠	西格玛-奥德里奇	D6750-100g	在通风橱中使用，并佩戴护目镜和手套。
硫酸镁	西格玛-奥德里奇	M7506-500g	无
氯化钙	西格玛-奥德里奇	C1016-500g	无
脱氧核糖核酸酶（DNase）	西格玛-奥德里奇	D5025-150KU	无
盐酸（HCl）	西格玛-奥德里奇	258148-500ML	使用时需佩戴护目镜和手套。
胃蛋白酶	西格玛-奥德里奇	P6887-5G	在通风橱中使用，并佩戴护目镜和手套。
氢氧化钠	费舍尔科技	BP359-500	使用时需佩戴护目镜和手套。
京尼平	和光化学品	078-03021	在通风橱中使用，并佩戴护目镜和手套。
10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS 10x）	Quality Biological	119-069-151	无
磷酸盐缓冲液（PBS）	VWR	45000-448	无
滤纸	沃特曼	8519	不适用
手动泵	费舍尔科技	10-239-1	不适用
量筒烧杯	VitLab	445941	不适用
冷冻研磨仪	SPEX	6700	使用冷冻手套和护目镜。
冷冻干燥机	FTS FlexiDry		使用手套。
流变仪	Discovery	HR-2	使用手套和护目镜。