Abstract
In questo manoscritto, abbiamo prima descriviamo il protocollo fabbricazione di un chip microfluidico, con punti d'oro e regioni fibronectina rivestite sullo stesso substrato di vetro, che controlla appunto la generazione di bolle tandem e cellule individuali modellata nelle vicinanze con sedi e forme ben definite. Abbiamo poi dimostrare la generazione di bolle tandem utilizzando due laser pulsati illuminanti un paio di punti d'oro con un ritardo di tempo alcuni microsecondi. Visualizziamo l'interazione bolla-bolla e la formazione di jet da immagini ad alta velocità e caratterizzano il campo di moto risultante utilizzando l'immagine di particelle velocimetria (PIV). Infine, vi presentiamo alcune applicazioni di questa tecnica per l'analisi singola cellula, tra cui poration cella a membrana con l'assorbimento macromolecola, deformazioni della membrana localizzata determinato dagli spostamenti di perline integrine vincolante attaccati, e la risposta di calcio intracellulare dalle immagini raziometrico. I nostri risultati mostrano che un flusso di getto veloce e direzionale è proprodotta dall'interazione bolla tandem, che può imporre una sollecitazione di taglio altamente localizzata sulla superficie di una cellula coltivata in prossimità. Inoltre, diversi effetti biologici possono essere indotti alterando la forza del flusso di getto regolando la distanza standoff dalla cella alle bolle tandem.
Introduction
Vi è una crescente consapevolezza che eterogeneità cellulare, derivanti dall'espressione stocastico di geni, proteine e metaboliti, esiste all'interno di una vasta popolazione cellulare e serve come un principio fondamentale in biologia per consentire l'adattamento delle cellule ed evoluzione 1. Pertanto, è spesso imprecisi e inaffidabili utilizzare misurazioni di massa di popolazione comprendere la funzione delle singole cellule e le loro interazioni. Lo sviluppo di nuove tecnologie per l'analisi singola cellula è pertanto di grande interesse nella ricerca biologica e farmacologica, e può essere utilizzato, ad esempio, per meglio comprendere le vie di segnalazione e processi chiave in biologia delle cellule staminali e la terapia del cancro 2-4. Negli ultimi anni, l'emergere di piattaforme microfluidici ha notevolmente facilitato l'analisi singola cellula, in cui il posizionamento, il trattamento, e l'osservazione della risposta da singole cellule sono state eseguite con strategie analitiche innovative 5.
La cavitazione svolge un ruolo importante in una vasta gamma di applicazioni biomediche, compreso il trattamento di tumori di High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) 6, la frammentazione non invasivo di calcoli renali con onda d'urto litotripsia (SWL) 7, droga o gene consegna da sonoporazione 8, e la distruzione recentemente riportato di cellule o tessuti da idrodinamica 9,10 bolla di cavitazione. Nonostante ciò, i processi dinamici della bolla di cavitazione (s) interazioni con tessuti e le cellule biologiche non sono state ben comprese. Ciò è dovuto alla casualità in cavitazione iniziazione e bolle dinamiche prodotte dagli ultrasuoni, onde d'urto, e la pressione idraulica locale; Inoltre, vi è una mancanza di permettere tecniche per risolvere le risposte intrinsecamente complesse e veloci di cellule biologiche, in particolare a livello di singola cellula.
A causa di queste sfide, non è sorprendente che pochissimi studi hanno apen segnalato per indagare le interazioni bolla-cellula in condizioni sperimentali ben controllate. Ad esempio, poration membrana delle cellule individuali intrappolato in sospensione 11 e la grande deformazione impulsiva di globuli rossi umani 12 è stata dimostrata utilizzando laser generato singole bolle in canali microfluidica. Quest'ultima tecnica, tuttavia, può produrre solo molto piccola deformazione in cellule eucariotiche per la presenza del nucleo 13. Inoltre, è difficile controllare bioeffetti valle quando trattando le cellule in sospensione. In altri studi, gli ultrasuoni l'eccitazione di un (o mezzo di contrasto ecografico) microbolle cellule-bound per la produzione di membrane poration e / o risposte intracellulari di calcio in singole cellule aderenti stato segnalato 8. All'incorporazione membrana di singole cellule aderenti può essere prodotto utilizzando bolle tandem laser generato in un sottile strato liquido contenente Trypan blue soluzione che assorbe la luce 14, oda una bolla di gas oscillante generato da impulsi laser microsecondo che irradiano attraverso un substrato otticamente assorbente in microchambers 15. Rispetto, il substrato otticamente assorbente ha un vantaggio rispetto alla soluzione Trypan blu laser assorbente perché quest'ultimo è tossico per le cellule. Ancora più importante, le bolle laser generati sono più controllabili in termini di dimensioni e la posizione della bolla di bolle acusticamente eccitati. Tuttavia, in tutti questi studi precedenti, la forma delle cellule, l'orientamento e condizioni di aderenza non erano controllati, che possono influenzare sostanzialmente la risposta cellulare e effetti biologici prodotti dalle sollecitazioni meccaniche 16.
Per ovviare a questi inconvenienti in studi precedenti, abbiamo recentemente sviluppato un sistema sperimentale per la generazione di bolle, patterning cella, interazioni bubble-bubble-cellulari, e in tempo reale biosaggi di risposta delle cellule in un chip microfluidico costruita utilizzando una combinazione unica di microfabbricazione tecniques. Tre caratteristiche principali che contraddistinguono il nostro sistema sperimentale da altri nel campo sono: 1) il patterning di punti d'oro micron dimensioni sul substrato di vetro per consentire l'assorbimento laser localizzato per la generazione della bolla 17; 2) il patterning di isole micron di dimensioni di matrice extracellulare (ECM) per l'adesione cellulare sullo stesso substrato di controllare sia la posizione e geometria delle singole celle; e 3) la compressione della dimensione del dominio di interazione bubble-bubble-cellulare da 3D a uno spazio quasi-2D per facilitare la visualizzazione nel piano di interazioni bolla bolle, getto campi di flusso, deformazioni cella, e bioeffetti, tutti catturati in una sequenza di immagini snella (Figura 1d).
Figura 1: Il chip microfluidica e schemi di saggi differenti. a) Un chip microfluidica assemblato con canali riempito con inchiostro blu per la visualizzazione. b) Una regione all'interno del chip microfluidico con celle motivi geometrici e punti d'oro (la distanza tra i due punti d'oro in prossimità è 40 micron). Molte coppie di unità di lavoro possono essere disposti in un canale. c) Immagine del primo piano di una singola unità di lavoro costituito da una coppia di punti d'oro e una cellula HeLa aderito alla regione cellula-patterning. d) Schema del funzionamento del dispositivo. Una singola cellula aderisce e si diffonde sulla "H" isola a forma rivestito con fibronectina. Un paio di bolle di cavitazione (bolle tandem) con oscillazione anti-fase viene prodotta illuminando raggi laser pulsati sui punti d'oro (vedi figura 4a), che porta alla generazione di un getto veloce e localizzato muovendo verso la cellula bersaglio vicina. La cella può essere deformata, porata per l'assorbimento macromolecolare, e / o stimolato con una risposta di calcio, a seconda della distanza distanziatore (S d) della cella alla bolla tandem.f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Questa piattaforma può essere ulteriormente combinato con saggi di fluorescenza e perline funzionalizzati attaccati alla superficie cellulare per bioeffetti cavitazione indotta. In particolare, questa piattaforma apre la strada a test affidabili e quantificabili a livello di singola cellula. Fino ad ora, abbiamo utilizzato il dispositivo per l'analisi di tandem bolla indotta deformazione della membrana cellulare, poration cellulare e captazione intracellulare, la vitalità, apoptosi, e la risposta del calcio intracellulare. Nella seguente protocollo, si descrive il processo di fabbricazione di chip e la procedura per analizzare i vari effetti biologici sopra menzionati. Inoltre, sono anche descritti operazioni del chip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Microfabbricazione
NOTA: Tutte le procedure di microfabbricazione vengono eseguite in una camera sterile. Una maschera di cromo è progettato prima della microfabbricazione, vedi Figura 2.
Figura 2: Schema del disegno di canale nel chip microfluidica e le dimensioni delle unità di lavoro. a) progettazione maschera del PDMS microcanali allineati (verde) e i modelli sul substrato di vetro (blu e rosso). b) l'immagine ingrandita del disegno maschera in una sezione rappresentativa degli array di unità di lavoro. c) Schema di una unità di lavoro che mostra un modello di cellule (blu) e una coppia di punti d'oro (rosso). Tutte le scale di lunghezza sono mostrati in basso a destra. Clicca qui per visualizzare un larVersione ger di questa figura.
- Patterning dot oro
NOTA: L'area di ogni punto oro è progettato per essere entro 25-30 micron 2, in modo che sia sufficientemente grande da assorbire energia laser per la generazione di bolle, ma abbastanza piccolo per evitare singole cellule aderenti ad essa. Un diagramma schematico per il punto dell'oro fabbricazione è mostrato in figura 3a.- Vetrino pulizia (in una cappa chimica)
- Lavare il vetrino con acetone seguito da alcol isopropilico (IPA), e poi asciugare con il flusso di N 2.
- Bagnare il vetrino in soluzione Piranha (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1) per 10 min.
- Estrarre la slitta, sciacquarlo con acqua deionizzata, e poi asciugare con il flusso di N 2.
- Cuocere il vetrino su una piastra riscaldante a 120 ° C per 10 min.
- Trattare il vetrino in un Asher al plasma a 100 W per 90 s.
- Spin-rivestimento (Cappuccio spin-coating)
- Accendere una piastra riscaldante e attendere che la temperatura è stabile a 95 ° C.
- Seguire la procedura di rivestimento:
1.000 rpm per 5 s con a / s rampa di 500 giri al minuto;
poi 3.000 rpm per 30 s con / s rampa 1.000 rpm. - Fissare il vetrino pulito sul dispositivo a induzione rotazione mediante l'applicazione di un vuoto.
- Coprire la superficie di scorrimento con P-20 e inizia la ricetta rivestimento.
- Ripetere il processo di rivestimento per photoresist NFR-negativo.
- Cuocere la diapositiva a 95 ° C per 60 s e attendere che si raffreddi fino a temperatura ambiente.
- fotolitografia
- Montare la maschera cromata sul allineatore maschera e fare in modo che il lato modello sia rivolto verso lo scivolo.
- Impostare la ricetta fotolitografia al modo di esposizione disco con 9 s di esposizione UV e rapidamente allineare il substrato di vetro con la maschera.
- Dopo aver effettuato l'esposizione UV, cuocere la diapositiva a 956; C per 1 minuto, e poi lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.
- Sviluppo
- Sviluppare il modello sul vetrino in soluzione di sviluppo per 60 s.
- Rimuovere il vetrino da parte dello sviluppatore, lavare con acqua deionizzata e asciugarlo con il flusso di N 2.
- Controllare la geometria modello sotto un microscopio, e misurare e registrare la dimensione del tratto.
- Deposizione di oro (e-beam evaporazione) e decollo
- Cuocere la diapositiva a 120 ° C per 5 minuti, e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.
- Pulire il vetrino con il plasma nella macchina reattiva attacco con ioni (RIE) per 90 s a 500 Torr e 100 W.
- Deposito 5 nm di Ti e 15 nm di Au sul vetrino utilizzando un evaporatore a fascio 17.
- Immergere il vetrino notte in un bicchiere di vetro contenente rimozione fotoresist solvente per rimuovere l'appoggio oro sulla parte superiore della NFR resistere.
- Recuperare la slitta, i flusht con acetone seguito da IPA, e asciugare con il flusso di N 2.
- Asciugare il vetrino su una piastra calda a 115 ° C prima di pulirlo nel Asher plasma di ossigeno a 100 W per 90 s.
- Vetrino pulizia (in una cappa chimica)
- Molecular-assemblaggio patterning dal lift-off (MAPL)
Nota: L'area di ogni isola fibronectina rivestite è impostato per essere all'interno di 700-900 micron 2 per facilitare un adeguato cellule HeLa diffondendo in una regione quadrata, riducendo al minimo le probabilità di più celle aggregano sull'isola. Un diagramma schematico per la preparazione di isole cell-patterning è mostrato in Figura 3b.- spin coating
- Ripetere passaggio 1.1.2, ma utilizzare photoresist S1813-positivi e una temperatura di 115 ° C.
- fotolitografia allineato
- Montare la maschera cromata sul allineatore maschera e fare in modo che il lato con il modello sia rivolta verso lo scivolo con ilpunti d'oro.
- Impostare la ricetta fotolitografia per modalità di esposizione duro con 9 s di esposizione ai raggi UV.
- Allineare la maschera superiore con la slitta inferiore utilizzando segni di allineamento, situati intorno al bordo della maschera, come riferimento spaziale.
- Controllare la porzione centrale della maschera e verificare che le funzioni di ripetizione sono allineate.
- Completa l'esposizione ai raggi UV, senza un post-cottura.
- Sviluppo
- Ripetere il passaggio 1.1.3, ma con 45 s di sviluppo prima di asciugare su una piastra e la conservazione in N 2 di stoccaggio.
- spin coating
- trattamento chimico
- Preparare la soluzione passivante: 0,5 mg / mL PLL-g-PEG in 10 tampone HEPES mM.
- Recuperare il vetrino da N 2 stoccaggio e pulirlo con RIE con l'impostazione del parametro: 500 Torr pressione, potenza 100-W, e 90-s durata.
- Pipettare una goccia di passivazione soluzione su una porzione di pellicola di paraffina. </ Li>
- Sandwich la soluzione con il film e la slitta, assicurandosi che il lato con il modello caratteristiche sia rivolta verso il film; evitare la formazione di bolle.
- Attendere 45 minuti prima di rimuovere il vetrino dal film.
- Immergere il vetrino consecutivamente in rimozione fotoresist, rimozione fotoresist e acqua deionizzata (1: 1), e acqua deionizzata, e agitarsi in un bagno a ultrasuoni per 90 s per ogni ammollo.
- Essiccare il vetrino su una piastra per rimuovere l'umidità prima di sigillare in un essiccatore e riporlo in frigorifero.
- assemblaggio di chip
- Ripetere i passaggi 1.1.1-1.1.4, ma con photoresist SU8-2025-negativo e l'impostazione dei parametri di cui ha chiamato il protocollo Microchem 18, per preparare uno stampo in silicone con un fotomaschere.
- Realizzare un microchannel PDMS (40 mm x 25 mm x 5 mm L x P x A) e una lastra PDMS piccola (800 micron a livello di struttura di scanalatura) utilizzando la litografia soffice.
- Punch il microchannel per porte di accesso fluido e pulirlo con del nastro adesivo e poi con IPA.
- Schermare la zona modellata del substrato di vetro con la lastra PDMS, e applicare RIE (100 W, 500 mTorr, 60 s) per rimuovere PLL-g-PEG dalla zona periferica.
- Trattare il microcanali con una dose ridotta di RIE (25 W, 500 mTorr, 25 s) e quindi allinearla al substrato di vetro modellata (con la piccola lastra PDMS rimossa); portare il microcanali e il substrato di vetro modellato a contatto conformazionale sotto uno stereoscopio.
Figura 3: Schemi di microfabbricazione e chip di assemblaggio. a) Modello di punti d'oro sul substrato di vetro. b) Preparazione del substrato di vetro per patterning cellulare tramite MAPL. c) Montaggio del canale microfluidica con incollaggio al plasma. Vedere l'elenco dei materiali per le definizioni of le abbreviazioni. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- adesione cellulare
NOTA: cellule HeLa sono normalmente mantenute in DMEM supplementato con 10% FBS e 1% di antibiotici soluzione / antimitotici in un incubatore di coltura cellulare. Un diagramma schematico per il fissaggio assemblaggio di chip e la cella è mostrato in figura 3c.- Prime il chip con PBS per 30 minuti a 1 ml / min, e quindi infusione soluzione fibronectina (50 mg / ml in PBS, 1 ml / min) per 45 min.
- Durante l'attesa, trypsinize coltura cellulare con 0,25% tripsina-EDTA, lavarli in terreno di coltura, le cellule individuali centrifuga, e ricostituire la sospensione cellulare in pre-riscaldato (37 ° C) al mezzo di coltura 5x10 6 cellule / ml.
- Sostituire la soluzione fibronectina con PBS e lavare il chip a 10 microlitri / min per 5 min.
- Iniettarela sospensione cellulare preparata nel chip, fermare il flusso, morsetto presa, e mantenere il chip in un incubatore di coltura cellulare per 30 min.
- Rilasciare la presa e lavare il chip con mezzo di coltura cellulare a 10 microlitri / min per 5 min. Ridurre la portata perfusione del mezzo di coltura a 0,75 ml / min e mantenere la coltura cellulare per 2 ore in incubatore.
2. Generazione Bubble e visualizzazione del flusso
NOTA: Uno schema del setup sperimentale è mostrato in figura 4a per la generazione di bolle tandem e l'interazione flusso risultante con una singola cellula coltivata vicino in un canale microfluidico.
- Generazione di tandem bolle con due laser e di controllo di temporizzazione
- Posizionare il chip microfluidica sul palcoscenico di un microscopio invertito e allineare il foci di due Nd pulsati: YAG (λ = 532 nm, 5 ns durata impulso) su un paio di punti d'oro fantasia separati By 40 micron.
- Utilizzare un generatore di ritardo digitale per far scattare i due laser con un ritardo di circa 2,5 ms per la produzione di due bolle avviate presso i punti d'oro.
- Regolare l'energia di uscita del laser (~ 10 μJ) per produrre un diametro massimo delle bolle a meno di 50 ± 2 micron.
- Sincronizzare una macchina fotografica ad alta velocità (esposizione di 200 ns e 2 milioni di fotogrammi al secondo (fps)) per i laser e catturare le dinamiche di espansione della bolla, il collasso, l'interazione bolla-bolla, e la formazione del getto.
- La quantificazione della velocità del getto
- Registrare la posizione della punta jet (J 1) all'estremità prossimale della prima bolla (B 1) e l'estremità distale di B 1, a partire dalla generazione della bolla secondo (B 2) e termina con l'atterraggio di J 1 verso l'estremità distale del B 1; vedi lo schema in figura 5a.
- Linearmente adattare il periodo di tempo della posizione per Both prossimale (jet punta) e le estremità distali. Calcolare la pendenza della posizione della punta rispetto alla curva tempo per l'estremità prossimale per determinare la velocità del getto. L'intersezione delle due linee indica il tempo jet atterraggio. Maggiori dettagli possono essere trovati in riferimento 19.
- Visualizzazione del campo di moto bolla indotta tandem
- Preparare 1 micron di polistirolo (PS) la sospensione delle sferette in acqua deionizzata (2,6% w / v) e iniettare le perline nel chip microfluidica.
- Genera bolle tandem come descritto al punto 2.1.1-2.1.3.
- Registrare le dinamiche bolle in tandem con una videocamera ad alta velocità ad una velocità di 5 fps M con un tempo di esposizione di 100 ns.
- Carica la sequenza di immagini acquisite in un software PIV commerciale.
- Dividere ogni immagine in piccole finestre di interrogatorio di 16 x 16 pixel (px) con una sovrapposizione del 75%.
- Applicare iterazione multi-pass e filtri regionali di ridurre gli errori in campo di velocità di calcolo, euscita i risultati in una mappa vettore velocità.
Figura 4: Schema del setup sperimentale e registrazione delle immagini. a) messa a punto sperimentale per la generazione di bolle in tandem. b) Sequenza temporale utilizzata per diversi tipi di acquisizioni di imaging. FL: microscopia a fluorescenza, BF: campo chiaro, IFT: tempo di interframe. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
3. Single-cella di analisi e di effetti biologici
NOTA: La bolla tandem è prodotto vicino alle cellule bersaglio, e gli effetti biologici risultanti sono studiati in maniera distanza dipendente dalla situazione di stallo. La sequenza temporale per i diversi tipi di acquisizioni d'immagine è mostrata in Figura 4b.
- Poration membrana e l'assorbimento macromolecolare
NOTA: L'assorbimento di macromolecole extracellulari nella cellula bersaglio è caratterizzata dalla progressiva diffusione di membrana impermeant ioduro di propidio (PI) attraverso il sito tion sulla membrana cellulare.- Seguendo passo 1.5, sostituire il terreno di coltura regolare (cioè, DMEM) con la soluzione PI (100 mg / ml in DMEM) con almeno una portata di perfusione di 0,5 microlitri / min per tutto l'esperimento.
- Programmare il software di controllo del microscopio per selezionare automaticamente il cubo fluorescente PI sulla torretta girevole e sincronizzare la temporizzazione della camera CCD con l'eccitazione di fluorescenza PI per catturare immagini di fluorescenza con un tempo di esposizione di 200 ms.
- Dopo i due fuochi laser sono allineati ad una coppia di punti d'oro accanto a una cellula bersaglio, registrare sia in campo chiaro (BF) e le immagini di fluorescenza (FL) prima del trattamento bolla tandem.
- Utilizzare un software di controllo del microscopio a subitoavviare un time-lapse registrazione delle immagini di fluorescenza della cellula bersaglio subito dopo la fase 2.1 per catturare la storia del PI assorbimento.
- deformazione Membrane
- Preparare 1-micron perline (1% w / v, attivati con carbodiimide solubile in acqua) e funzionalizzare con Peptide-2000 (100 mg / ml in PBS).
- Seguendo passo 1.5, incubare le cellule attaccate con le perline funzionalizzati ad una densità di 1x10 9 perline / ml a 37 ° C per 30 min.
- Ripetere il passaggio da 2.1 a produrre le bolle tandem accanto alla cella di destinazione e registrare la deformazione cellulare con una fotocamera ultra-alta velocità in esecuzione a una velocità di 5 milioni di fps.
- Identificare una triade di 3 perline che rimangono sul piano di imaging tutto l'esperimento e compilare le loro posizioni come (x 1, y 1) (x 2, y 2) e (3 x, y 3) nell'esperimento coordinate.
- Calcolare l'area della triade prima e afIl TER trattamento bolla tandem con la formula:
- Calcolare il ceppo zona come:
- Sulla base delle coordinate dei tre vertici prima e dopo il trattamento bolla tandem, calcolare il principale sforzo e deformazione locale zona seguendo protocolli stabiliti 20,21.
- Viabilità e apoptosi
NOTA: FITC annessina V etichette cellule, comprese quelle apoptotico, attraverso l'esternalizzazione della fosfatidilserina (fluorescenza verde). PI etichette nuclei delle cellule necrotiche (fluorescenza rossa). immagini campo luminoso è usato per documentare la morfologia cellulare e per aiutare con l'identificazione di vitalità cellulare e apoptosi.- Registrare la posizione di ciascuna cella trattata nel canale microfluidica (facilitata dalle etichette di indirizzo del canale, vedere figura 2b
- Incubare le cellule trattate nel mezzo di coltura cellulare per altre 2 h prima di perfusione del chip con soluzione FITC annessina V per 15 min. cellule positive mostrano fluorescenza verde.
- Ripetere il punto 3.3.2 24 ore dopo il trattamento bolla tandem per studiare le bioeffetti a lungo termine delle cellule bersaglio.
- risposta di calcio
- Mescolare 3 ml di Fura-2 Am stock soluzione (1 mg / ml in DMSO) con 3 ml di 10% w / v Pluronic F-127 in 500 ml di mezzo di siero ridotta per preparare la soluzione di etichettatura finale (6 mM).
- Seguendo passo 1.5, sostituire il mezzo di coltura cellulare con la soluzione di etichettatura e incubare a temperatura ambiente al buio per 40 minuti (1 ml / min di perfusione).
- Riempire il canale con il mezzo di siero ridotto (0,75 ml / min di perfusione) prima di iniziare l'esperimento cella.
- Inizia l'imaging raziometrico (lunghezza d'onda: 340/380 nm, l'esposizione di 50 ms)della cellula bersaglio utilizzando il sistema PTI commerciale.
- Dopo 10 s dell'imaging raziometrica della cella a livello di riposo, produrre le bolle tandem come al punto 2.1; primo record con un tempo interframe (IFT) di 0,1 s per 1 minuto, quindi aumentare l'IFT di 1 s per un altro minuto, e l'ulteriore incremento di 5 s dopo 2 min.
- Utilizzare il software PTI per calcolare il rapporto R = F340 / F380 nella regione di interesse (ROI), che è proporzionale alla concentrazione di calcio intracellulare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La piattaforma microfluidica descritto in questo lavoro può essere usato per studiare le interazioni bolla-bolla e per analizzare una varietà di effetti biologici cavitazione indotta a livello di singola cellula. Qui, presentiamo alcuni esempi per dimostrare una varietà di studi sperimentali e saggi biologici che possono essere eseguite nel nostro sistema sperimentale. Per prima illustrare le interazioni transienti di bolle tandem con la formazione del getto, la visualizzazione del campo di moto risultante, e il calcolo della velocità del getto (figura 5a). Ci sarà poi esempi attuali di tandem bolla indotta localizzato deformazione della membrana cellulare (figura 5b), poration membrana individuato con PI assorbimento (figura 5c), e la risposta del calcio intracellulare (Figura 5d). Altri esempi, come saggi di vitalità cellulare e apoptosi, possono essere trovati in riferimento 22.
Figura 5a mostra un esempio di interazione bolla tandem con la formazione del getto, catturato da immagini ad alta velocità, e il campo di moto risultante rivelato da PIV. In particolare, dopo la sua massima espansione, il collasso della prima bolla B 1 (prodotto a 0 ms) è distorto asimmetricamente dalla rapida espansione della bolla secondo B 2 (prodotto a 2,5 ms), che porta alla formazione di un "rialzo" jet (J 1) a 3.4 ms e il successivo flusso di getto, mostrato a 5.4 ms. La velocità media del getto è determinata dalla pendenza di una linea adattata per la posizione dell'estremità prossimale (o poli) di B 1 prima touchdown (cioè, contatto con l'estremità distale di B 1) in funzione del tempo. La velocità media del getto è risultato aumentare da 20 a 58 m / s quando il diametro massimo di B 2 aumenta da 40 a 60 micron. Sulla base dei risultati di analisi PIV, il flusso di getto orientabile intorno tandbolla em è dell'ordine di 10 m / s ed è confinato all'interno di una larghezza dell'ordine di 10 micron. È quindi in grado di produrre una sollecitazione di taglio impulsivo e localizzato e gradiente di sollecitazione su una cellula bersaglio cresciuto vicinanze.
Un altro esempio mostrato nella figura 5b illustra la deformazione della membrana cellulare indotta dal flusso di getto direzionale e localizzata prodotto dal tandem bolle a standoff distanza S d = 40 micron. La deformazione della membrana e il recupero sono evidenziati dallo spostamento di un cordone funzionalizzato (indicata dalla linea tratteggiata gialla) attaccata al bordo anteriore della membrana cellulare. Il ceppo locale può essere calcolata dalle coordinate di una terna di perline adiacenti. Uno schema della variazione massima area calcolata in diverse posizioni sulla superficie cellulare viene mostrata al centro. Il bordo è prevalentemente allungata (vedere i cerchi verdi), mentre il bordo di uscita o latlati rale della cella sono compressi (come indicato dai cerchi rossi), indicando eterogeneità deformazione cellula prodotta dal flusso di getto di bolla tandem indotta. La variazione temporale del ceppo zona all'avanguardia cella viene illustrato a destra. Esso è composto da poche oscillazioni rapidi all'inizio, seguita da un ampio e sostenuto allungamento per circa 100 ms (FWHM) e un successivo ripristino graduale su una scala temporale di diversi ms.
Inoltre, la grande deformazione area e deformazione solidale alla cella bordo anteriore possono essere responsabili all'incorporazione membrana cellulare osservata a piccole S d, come mostrato in Figura 5c. Alla piccola S D (cioè 10 micron, o in alcuni casi, 20 micron) e S d intermedio (cioè, la maggioranza di 20 e 30 micron), una perturbazione membrana localizzata è indotta, portando ad un assorbimento puntino di PI extracellulare incitoplasma. Se l'intensità PI all'interno della cella continua ad aumentare senza saturazione, necrosi si verifica. In confronto, se l'intensità PI è un ordine di grandezza inferiore e raggiunge un plateau entro 10 s seguenti trattamento bolla tandem, si verificherà poration riparabile con probabile sopravvivenza cellulare, che è ulteriormente supportata dal minime modificazioni della morfologia cellulare. Al grande S D (ad esempio, 40 micron), trascurabile PI assorbimento viene trovato seguendo il trattamento bolla tandem, indicando trascurabile o non-tion. La cella può sopravvivere con una crescita regolare e la proliferazione 22. Nel complesso, i risultati mostrano una chiara transizione in risposta cellulare da necrosi, attraverso la membrana poration riparabili, per non tion nella gamma di S D ≈ 20-40 micron.
Infine, si riportano i risultati dell'imaging raziometrica della risposta di calcio intracellulare indotta da bolle tandem in singole cellule a diversa Sd, specialmente nella gamma subletale di S d = 30-50 micron (figura 5d). Il rapporto di intensità è proporzionale alla quantità di calcio intracellulare. Alla piccola S D (cioè 30 micron o, in alcuni casi, 40 micron), un'onda di calcio viaggia dal bordo anteriore al bordo posteriore è chiaramente osservato entro pochi secondi dopo il trattamento bolla tandem. Dopo il calcio intracellulare raggiunge un picco di concentrazione, decade lentamente verso il livello di riposo in pochi minuti. Al contrario, in generale S D (cioè, una maggioranza di 50 micron, o in alcuni casi, 40 micron), l'aumento del calcio intracellulare è molto più mite e non chiaramente visibile onda calcio viaggiando può essere identificato. Queste due differenti risposte di calcio possono anche essere distinti dai loro profili di rapporto rispetto al tempo intensità, con differenze significative nel picco di ampiezza del rapporto di intensità e il tempo di salita dal livello di riposo al piccovalore. Ad un ancora più grande S D (cioè superiore a 60 micron), nessuna risposta di calcio può essere osservato. La percentuale di cellule HeLa visualizzazione risposte di calcio a vari S d è riassunto in Figura 5d (destra).
Nel complesso, i nostri risultati hanno dimostrato che, modificando la forza del flusso di getto (o cambiando S d), una varietà di effetti biologici può essere prodotto in cellule singole HeLa in condizioni di coltura simili, che è probabilmente correlato con l'ampiezza e la durata della deformazione meccanica imposta sulla membrana cellulare 22.
Figura 5: I risultati di interazione bolla tandem, la deformazione della membrana cellulare, poration membrana, e test di risposta di calcio. a) il movimento fluido e il gettoindotta da interazione bolla tandem. A sinistra: fotogrammi selezionati che mostra le interazioni bolla tandem con la formazione del getto e il campo rivelato da PIV fluire. I diametri massimi dei due bolle sono circa 50 ± 2 micron. Medio: Schema delle bolle getto tandem, illustrando l'asse centrale, origine delle coordinate (o), e prossimale e distale (o poli) della prima bolla B 1. Destra: Misurata pole position (con l'errore = ± 1 micron) alla prossimale e distale di B 1. b) deformazione membrana cellulare. Sinistra: La linea tratteggiata gialla etichette lo spostamento di un cordone PS attaccato al bordo anteriore della membrana cellulare, che indica la deformazione della membrana locale e recupero. Medio: uno schema che mostra l'area del picco ceppi in diverse posizioni sulla superficie cellulare indicate a sinistra. A destra: I corsi temporali dei ceppi zona, nel cuore del bordo d'attacco delle cellule. Δ ε è la bas ceppo zona calcolateed sul ceppi principali e Δ Δ è il ceppo area calcolata sulla base della variazione della geometria triade. Maggiori dettagli sul calcolo del ceppo zona e analisi degli errori sono documentati in riferimento 22. poration c) membrana cellulare. A sinistra: le immagini in campo chiaro, prima e dopo il trattamento tandem bolla e time-lapse immagini di fluorescenza di PI assorbimento (0 e 120 s). Le frecce bianche indicano la direzione del flusso di getto. Al centro: il tipico cambiamento di intensità PI media in funzione del tempo all'interno delle cellule. A destra: i risultati statistici della percentuale di cellule in fase di necrosi (rosso), poration riparabili (blu), e non poration (verde) a diverso S d. Numero di cellule trattate: N = 9, 14, 14, e 8 per S d = 10, 20, 30, e 40, rispettivamente. L'errore statistico è ± 1 / √ N. d) la risposta di calcio intracellulare. A sinistra: sequenze di immagini che mostrano le risposte raziometriche intracellulari di calcio di singola cellas in S D di 30 micron e 50 micron. Le frecce rosse indicano la direzione del getto. Medio: profili di risposta tipici (curve rapporto a tempo) a diversi S d. A destra: la probabilità di una risposta di calcio a differenti S d. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Distanza situazione di stallo (S D) (micron) | numero di Reynolds (Re) | una media di sforzo di taglio (Pa) nel piano yz |
| 20 | 206.96 | 618,64 |
| 30 | 354,8 | 709,69 |
| 40 | 378,78 | 657,22 |
| 50 | 163,85 | 323,61 |
| 60 | 105.08 | 42.21 |
Tabella 1: un elenco di parametri per la fisica di flusso dai risultati PIV. Stima del numero di Reynolds e media tensione di taglio rispetto a diverse distanze Standoff (S d). Il piano YZ riferisce al piano x altezza larghezza del canale. Lo sforzo di taglio mediata viene stimato da un'altezza da 0 a 7.7 micron dal fondo del canale perché l'altezza della cella nel canale è di circa 6-7 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analisi cella singola, in combinazione con il live-cell imaging, ha notevolmente migliorato la nostra comprensione dei processi dinamici e spesso variabile in singole cellule, come lo sviluppo del fenotipo e la risposta immunitaria 23. In contrasto con la coltura cellulare convenzionale piatti o flaconi, sistemi microfluidici permettono un controllo preciso del microambiente, fino al livello di singola cellula, in tempo reale. Di conseguenza, i progressi nella tecnologia microfluidica e tecniche sono in gran parte migliorato la produttività e la riproducibilità delle analisi cella singola. Integrando morbido litografia e la superficie patterning, sistemi microfluidici possono essere ulteriormente studiati per facilitare l'analisi approfondita di risposta una singola cellula di modelli complessi di stimoli spatiotemporally variabili. Ad esempio, segnali chimici, meccanici transitori o sono state consegnate con successo a singole cellule, mentre le risposte biologiche o meccaniche sono stati registrati automaticamente e analizzato 24. Nonostante questa tendenza generale, l'applicazione di microfluidica per analizzare bioeffetti cavitazione indotta a livello cellulare è stata molto limitata. In particolare, è stato applicato solo all'incorporazione membrana bolla indotta delle singole cellule in sospensione intrappolati dal micropillars 11. Nella maggior parte degli studi sulle cellule aderenti, il vantaggio di controllare la morfologia delle cellule per mantenere la coerenza nelle interazioni bolla-cellula dinamica non è disponibile o in gran parte trascurata.
Abbiamo sviluppato un sistema di microfluidica per controllare con precisione l'inizio, la successiva espansione, e la dinamica di collasso di bolle di cavitazione; interazioni bolla-bolla con formazione jet; e forma delle cellule, l'orientamento, modello adesione, e standoff distanza dalle bolle, permettendo così il flusso di getto riproducibile da applicare alle singole celle in condizioni sperimentali ben controllate. Questo nuovo sistema microfluidica è l'ideale per lo svolgimento st fondamentaleudies sulla bolla di cavitazione (s) -cell interazioni che sono rilevanti per una vasta gamma di applicazioni di ultrasuoni terapeutici, come SWL, HIFU, e sonoporazione. Abbiamo dimostrato che il nostro sistema microfluidico può essere usato per studiare varie bioeffetti cavitazione indotta, tra deformazione della membrana cellulare, poration membrana, vitalità e risposta di calcio, in modo più controllabile e riproducibile. Più in particolare, il flusso di getto direzionale prodotto da bolle tandem ci permette di sondare la risposta di proprietà e di calcio meccanico in celle singole, alle alte deformazioni tassi che non sono stati ben caratterizzati. Il localizzata, impulsivo sollecitazione meccanica prodotta da un tale flusso di getto non può essere realizzato mediante metodi convenzionali di stretching, come micropipetta aspirazione 25 e l'uso di ottica 26 e pinzette magnetiche 27. Inoltre, a differenza di studi precedenti che utilizzano mezzi di contrasto ecografici 8,28-30 o indotta da laser singola BUbbles 31,32, il nostro sistema di microfluidica offre un miglior controllo delle condizioni di geometria cellulare e di adesione, riducendo in tal modo il loro effetto sostanziale sulla risposta cellulare e effetti biologici 16.
Mentre la nostra tecnica è affidabile e riproducibile, si deve seguire il protocollo con cautela per garantire che il sistema sperimentale è fedelmente riprodotta. La qualità di patterning superficie nella microcanali è il principale responsabile per la riproducibilità delle interazioni bolla-bolla-cellula e la cascata di effetti biologici a valle. Ad esempio, per le cellule HeLa, l'area di ogni punto oro deve essere intorno a 25-30 micron 2 per garantire generazione bolla stabile impedendo alle cellule di aderire. D'altra parte, l'area di ciascuna isola fibronectina rivestite deve essere circa 700-900 micron 2 per facilitare l'adeguata diffusione di una singola cella in un quadrato, riducendo la probabilità di più celle che formano aggregati sull'isola. Allineamentotra i punti d'oro e le isole fibronectina rivestite devono essere precisamente effettuato con l'ausilio della maschera allineatore per mantenere l'errore angolare entro 1 ° e l'errore assiale entro 0,5 micron. Inoltre, questo sistema sperimentale fornisce versatilità nel controllo di una serie di eventi, con il loro scala temporale variava da ordini di grandezza (ad esempio, dinamiche bolla: ms, deformazione cellulare: ms, poration membrana: s, apoptosi: h). Pertanto, è importante controllare accuratamente i tempi di acquisizione delle immagini e la registrazione di ogni sequenza affinando segnali trigger (controllati da un generatore di ritardo digitale). La cultura singola cella deve essere ben mantenuto in microcanali per minimizzare la variazione cellula-cellula fenotipo (principalmente indicato come morfologia). Pertanto, a 2 h di incubazione minimo è richiesto per l'adesione delle cellule e la diffusione nelle isole prima di procedere con il trattamento delle cellule downstream. Si consiglia di tenere sempre la portata nel microchannel sotto 3 ml / min, in modo che la sollecitazione di taglio del flusso prodotto dal mezzo di coltura che circola sulla cella è all'interno del range fisiologico.
Una corrente di limitazione della nostra tecnica è che l'interazione bolla tandem e il flusso di getto risultante può essere applicato solo a una cellula bersaglio volta, perché i punti d'oro vengono asportate dalla irradiazione laser. Questo inconveniente limita la capacità del nostro sistema sperimentale per imitare i bioeffetti prodotti da ultrasuoni terapeutici, dove le cellule sono spesso esposti ad eventi di cavitazione. Tuttavia, questa limitazione temporale può essere alleviata applicando un altro strato sottile di biossido di silicio per proteggere i punti d'oro dall'esposizione diretta nel liquido 15. Nel complesso, il nostro sistema di microfluidica offre condizioni sperimentali ben controllati per indagare le bioeffetti prodotte da bolle di cavitazione (s) interazioni -cell e ha diverse caratteristiche uniche. In primo luogo, le dimensioni e la posizione della cavitazione bolle nel nostro eSistema Xperimental può essere controllata con precisione regolando l'energia laser incidente assorbita dai punti d'oro. In secondo luogo, la geometria e l'adesione delle singole celle sono standardizzate per patterning cella per minimizzare gli effetti sulle risposte cellulari e bioeffetti, portando a risultati più riproducibili. In terzo luogo, le unità di lavoro parallele nella progettazione di chip microfluidica rendono possibile studiare bioeffetti a valle, come la crescita cellulare, la proliferazione, e potenzialmente l'espressione genica, dopo l'esposizione di cavitazione, dal momento che ogni cella può essere affrontata e monitorata singolarmente. In sintesi, il nostro sistema di microfluidica e la metodologia creano affidabili interazioni bolla-bolla per studiare gli effetti biologici delle singole cellule con una migliore precisione.
La nostra attuale chip è progettato per l'analisi delle singole cellule HeLa. Tuttavia, una modifica delle isole del modello per altre linee cellulari di mammiferi sono anche possibili. Diversi miglioramenti possono essere fatti per allargare ulteriormente il applications del chip. Ad esempio, sostituti delle molecole PLL-g-PEG potrebbero essere esplorati per fermare le singole cellule fantasia dalla migrazione, anche dopo 24 ore. Inoltre, i nuovi modelli di chip con valvole microfluidica possono essere esplorati per controllare il microambiente locale delle cellule, in modo che saranno applicate solo sostanze chimiche come marcatori fluorescenti o reagenti tossici in una posizione specifica, senza intaccare le cellule in altre regioni del chip . Con questi miglioramenti, il sistema di microfluidica qui presentata può fornire opportunità per studiare le bioeffetti a lungo termine di cellule singole, come il metabolismo, la segregazione, la differenziazione e l'espressione genica, in seguito all'esposizione cavitazione o stimoli meccanici prodotti da un flusso impulsivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Materials | |||
| 75 mm x 38 mm Plain Microscope Slides | Corning | 2947-75X38 | |
| Acetone | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥99.7%, FCC, FG |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | ACS reagent, 95.0-98.0% |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 wt.% in H2O |
| Primer P-20 | Microchem | MCC Primer 80/20 | |
| NFR photoresist | JSR | NFR016D2 | |
| Photomask | Photoplotstore | N/A | 4x4 Direct write mask |
| MF-319 Developer | Shipley (Rohm and Haas) | Microposit MF-319 | |
| 1165 Photoresist Remover | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | 1-methyl-2-pyrrolidinone based |
| S1813 photoresist | Shipley (Rohm and Haas) | S1813 | |
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Paraffin film | HACH | 251764 | |
| SU-2025 photoresist | Microchem | SU-2025 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Microbore Tubing | Saint-Gobain PPL Corp. | S-54-HL | |
| Metal pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long |
| HeLa cells | Duke Cell Culture Facility | (307-CCL-2) HeLa, p.148 | |
| DPBS (1x) buffer | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| DMEM culture medium | ThermoFisher Scientific | 11995065 | |
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P21493 | |
| Carboxylate Microspheres 1.00 μm | Polysciences, Inc | 08226-15 | |
| Carboxylate Microspheres 2.00 μm | Polysciences, Inc | 18327-10 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | ThermoFisher Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | 24510 | |
| Peptite-2000 | Advanced BioMatrix | 5020-5MG | |
| FITC Annexin V | ThermoFisher Scientific | A13199 | |
| Fura-2, AM | ThermoFisher Scientific | F1221 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Co. | D2650 | |
| F-127 | invitrogen | P6866 | 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) |
| Reduced serum media | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Plasma asher | Emitech | K-1050X | O2 / Ar plasma ashing of photoresist and other organic materials |
| Mask aligner | SUSS MicroTec | Karl Suss MA6/BA6 | |
| E-beam evaporator | CHA Industries | CHA Industries Solution E-Beam | |
| RIE | Trion Technology | Trion Technology Phantom II | (oxide/ nitride/ polymer) etching |
| Stereoscope | AmScope | American Scope SM-4TZ-FRL | Stereo Microscope |
| Syringe pump | Chemyx Inc | NanoJet | |
| Cell culture incubator | NuAire | AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator | |
| Biological Safety Cabinets | NuAire | NU-425-400 | |
| Water bath | VWR | 1122s | |
| Centrifuge | IEC | Centra CL2 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | |
| Nd:YAG laser (laser 1) | New Wave Research | Tempest | |
| Nd:YAG laser (laser 2) | New Wave Research | Orion | |
| Delay generator | Berkeley Nucleonics | BNC 565-8c | |
| Flash lamp | Dyna-Lite | ML1000 fiber-coupled flashtube | |
| high speed camera | DRS Hadland | Imacon 200 | |
| high speed camera | Shimadzu | HPV-X | |
| high speed camera | Vision Research | Phantom V7.3 | |
| PIV software | LaVision | DaVis 7.2 | |
| camera | Zeiss | AxioCam MRc 5 | |
| software | Zeiss | AxioVision | |
| PTI system | Horiba | S/N: 1705 RAM-X | |
| EasyRatio software | Horiba | Easy Ratio Pro 2 | version 2.3.125.86 |
| 63× objective | Zeiss | LD Plan Neofluar |
References
- Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
- Weaver, W. M., et al. Advances in high-throughput single-cell microtechnologies. Curr Opin Biotechnol. 25, 114-123 (2014).
- Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (20), 7630-7635 (2012).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. H. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465 (7299), 736-745 (2010).
- Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr Opin Chem Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
- Kennedy, J. E. High-intensity focused ultrasound in the treatment of solid tumours. Nat Rev Cancer. 5 (4), 321-327 (2005).
- Zhu, S., Cocks, F. H., Preminger, G. M., Zhong, P. The role of stress waves and cavitation in stone comminution in shock wave lithotripsy. Ultrasound Med Biol. 28 (5), 661-671 (2002).
- Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16486-16491 (2012).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med. 238 (11), 1242-1250 (2013).
- Kosar, A., Sesen, M., Oral, O., Itah, Z., Gozuacik, D. Bubbly cavitating flow generation and investigation of its erosional nature for biomedical applications. IEEE Trans Biomed Eng. 58 (5), 1337-1346 (2011).
- Li, Z. G., Liu, A. Q., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
- Li, F. F., Chan, C. U., Ohl, C. D. Yield Strength of Human Erythrocyte Membranes to Impulsive Stretching. Biophys J. 105 (4), 872-879 (2013).
- Li, F., M, M., Ohl, C. .D. . Shear stress induced stretching of red blood cells by oscillating bubbles within a narrow gap. Bull Am Phys Soc. 58, (2013).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Phys. Rev. Lett. 105 (7), 078101 (2010).
- Fan, Q., Hu, W., Ohta, A. T. Laser-induced microbubble poration of localized single cells. Lab Chip. 14 (9), 1572-1578 (2014).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Yuan, F., Sankin, G., Zhong, P. Dynamics of tandem bubble interaction in a microfluidic channel. J Acoust Soc Am. 130 (5), 3339-3346 (2011).
- Microchem, SU-8 2000 Processing Guidelines. , Available from: http://www.microchem.com/pdf/SU-82000DataSheet2000_5thru2015Ver4.pdf (2000).
- Yang, C. Analysis of Tandem Bubble Interaction and Jet Formation in a Microfluidic Channel. , Duke University. (2013).
- Simon, S. I., Schmid-Schonbein, G. W. Cytoplasmic strains and strain rates in motile polymorphonuclear leukocytes. Biophys J. 58 (2), 319-332 (1990).
- Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation. Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).
- Yuan, F., Yang, C., Zhong, P. Cell membrane deformation and bioeffects produced by tandem bubble-induced jetting flow. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (51), E7039-E7047 (2015).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 110-119 (2012).
- Tay, S., et al. Single-cell NF-kappa B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical Properties of the Red Cell Membrane: I. Membrane Stiffness and Intracellular Pressure. Biophys J. 4 (2), 115-135 (1964).
- Lim, C. T., Dao, M., Suresh, S., Sow, C. H., Chew, K. T. Large deformation of living cells using laser traps. Acta Mater. 52 (7), 1837-1845 (2004).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (2), C597-C605 (2007).
- Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells. Biophys J. 96 (12), 4866-4876 (2009).
- van Wamel, A., et al. Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation. J Control Release. 112 (2), 149-155 (2006).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound Med Biol. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Dijkink, R., et al. Controlled cavitation-cell interaction: trans-membrane transport and viability studies. Phys Med Biol. 53 (2), 375-390 (2008).
- Rau, K. R., Quinto-Su, P. A., Hellman, A. N., Venugopalan, V. Pulsed laser microbeam-induced cell lysis: Time-resolved imaging and analysis of hydrodynamic effects. Biophys J. 91 (1), 317-329 (2006).
