שבץ איסכמי הוא אירוע מורכב שבו התרומה ספציפי של האסטרוציטים לאזור במוח המושפעים נחשפים גלוקוז חוסר חמצן (OGD) הוא קשה ללמוד. מאמר זה מציג מתודולוגיה להשיג האסטרוציטים מבודד וללמוד שלהם תגובתיות והתפשטות בתנאים OGD.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניטור אסטרוציט תגובתיות התפשטות במבחנה בתנאים כמו איסכמי
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
שבץ איסכמי הוא פגיעה מוחית מורכבת הנגרמת על ידי כגון או תסחיף חוסם את זרימת הדם אל חלקים במוח. זה מוביל לקיפוח של חמצן, גלוקוז, אשר גורם אנרגיה ולמוות עצביים. לאחר עלבון שבץ איסכמי, האסטרוציטים הפך תגובתי, להתרבות סביב האתר פציעה כפי שהוא מתפתח. בתסריט הזה, קשה ללמוד את התרומה ספציפי של האסטרוציטים לאזור המוח חשוף איסכמיה. לכן, מאמר זה מציג מתודולוגיה ללמוד אסטרוציט העיקרי תגובתיות והתפשטות תחת מודל במבחנה של סביבה, כמו איסכמיה, שנקרא גלוקוז חוסר חמצן (OGD). האסטרוציטים הם בודדו אותנו מהמתרחש 1-4 ימים-חולדות neonatal הישן, מספר התאים astrocytic שאינם ספציפיים הוערכה באמצעות סמן סלקטיבי אסטרוציט גליה Fibrillary חומצי חלבון (GFAP) וצביעת גרעינית. התקופה שבה האסטרוציטים נחשפים לתנאי OGD יכול להיות מותאם אישית, כמו גם אחוז החמצן שהם נחשפים. גמישות זו מאפשרת למדענים לאפיין את משך התנאי איסכמי כמו בקבוצות שונות של תאים בתוך חוץ גופית. מאמר זה מתאר את מסגרת זמן של OGD זה לגרום אסטרוציט תגובתיות מורפולוגיה היפרטרופית, התפשטות כפי שהיא נמדדת immunofluorescence באמצעות מתרבים תאים גרעיניים אנטיגן (PCNA). מלבד התפשטות, האסטרוציטים עוברים אנרגיה סטרס חמצוני, להגיב OGD על ידי שחרור גורמים מסיסים לתוך התא האמצעי. בינוני יכול להיות ונשתמש בהם כדי לנתח את ההשפעות של מולקולות שפורסמו על ידי האסטרוציטים בתרבויות עצביים ראשי ללא אינטראקציה עם מתא לתא. לסיכום, המודל התרבות התא הראשי ניתן להשתמש ביעילות כדי להבין את התפקיד של האסטרוציטים מבודד על פגיעה.
מבוא
קו מוגדר כ- "חריפה נוירולוגיות בתפקוד כלי דם המקור עם התפתחות מהירה או פתאומית של תסמינים וסימנים, התואם מעורבותם של תחומי פעילות במוח"1,2. ישנם שני סוגים של שבץ: hemorrhagic, איסכמי. כאשר תפקוד כלי הדם נגרמת על-ידי מפרצת או תקלה עורקית, מלווה בהיחלשות עם קרע אחורי של עורק, זה נקרא שבץ מדמם3 אשר, ברוב המקרים, מובילה למוות. כאשר כגון או תסחיף מונעת זרימת הדם, גורם זמני מניעת חמצן, גלוקוז לאזור במוח, זה נקרא שבץ איסכמי4. כשל לטפח תאים סביב האזור הנגוע או מוביל איסכמי הליבה איזון homeostatic וחילוף, תפקוד אנרגטי, מוות עצביים ו דלקת5, אשר יכול....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כמחנכת חולדות (ספראג Dawley) 1-4 ימים הישנים משמשים כדי לבודד cortices. השיטה של המתת חסד היא עריפה, כפי שאושר על ידי הנחיות NIH.
1. הכנה של מכשירים וחומרים לניתוח
- Sterilize מכשירים ב החיטוי (טמפרטורה: 121 ºC, לחץ: 15 psi, זמן: כשעתיים וחצי) באמצעות קופסת מתכת או רגע איטום נרתיק עיקור. ראה חומרים טבלה של חומרים.
2. להשלים את הכנת DMEM
- ב גביע ליטר אחד המכיל 700 מ"ל מים בלוק, להוסיף Dulbecco ' s נשר שונה ' s אבקת בינוני בטמפרטורת החדר.
- להוסיף 3.7 g/L סודיום ביקרבונט, בעוד הפתרון הוא מעורבב עם פגים.
- התאם ה-pH ל 7.4, עם מים בלוק להביא נפח עד 1....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אחד החששות העיקריים של התרבות astrocytic העיקרי הוא הנוכחות של תאים אחרים כגון נוירונים, oligodendrocytes להפוך, fibroblasts מיקרוגלייה. איור 1, תאים מבודדים מן החולדה cortices היו שינויים מדיה כל 3 ימים והיו גם אינו מטופל או שטופלו עם הוספת LME עבור 1 ה 24 שעות מאוחר יותר, התאים היו immunostained עבור GFAP, counterstained עם דאפי. תאים לא מטופלת הראה ממוצע של 39% הלא-GFAP תאים חיובי, ואילו תאים שטופלו LME הראה 8%. תוצאות אלו מראות איך הטיפול LME ומדיה לשנות .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר את ניתוקה של האסטרוציטים מן החולדה cortices. בשיטה זו, חיוני כדי להקטין זיהום עם סוגי הסלולר אחרים כגון מיקרוגלייה, oligodendrocytes להפוך fibroblasts. כדי לצמצם את מספר מיקרוגלייה, ניתן לנקוט בכמה צעדים: לשנות את המדיה מסלולית רועדת, טיפולים כימיים. ברגע טוהר התרבות הוא אישר immunofluorescence באמצעות סמנים הסלולר סלקטיבית או מזהמים הבולטים של התא, ניתן לבצע ניסויים. למשל, נוגדן נגד סידן מיונן מחייבת מתאם מולקולה 1 (רשות השידור-1) יכול לשמש כדי לזהות מיקרוגלייה. המוות עצביים מתחיל בשלב מוקדם של התרבות ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים רוצה להודות Paola לופס Pieraldi לסיוע טכני. A.H.M. הוא אסיר תודה עבור מענקים 8G12MD007600 ו- U54-NS083924 נתמך בפרסום זה. אנו מודים NIH-NIMHD-G12-MD007583 גרנט על התמיכה מתקן. D.E.R.A. הוא אסיר תודה על האחווה שסופקו על-ידי-NIHNIGMS-R25GM110513. אנחנו אסירי תודה על השימוש באזור מכשור המשותף ולהעניק הסיוע של ד ר Priscila Sanabria עבור השימוש במתקן הדמיה אופטית של התוכנית RCMI על ידי G12MD007583. בנוסף, אנו רוצים להודות חוסה פאדילה על תפקידו מצטיינים צילום ועריכה פרוטוקול חזותי.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <מכשירים חזקים>לניתוח - שלב 1 | |||
| מספריים ניתוחים 5.5 אינץ' | חברת רובוז | RS-6812 | כלים המשמשים לעריפת ראשי החולדות. |
| מלקחיים מעוקלים 7 אינץ' | חברת Roboz | RS-5271 | מחזיק את עור החולדה בזמן הסרת הגולגולת. |
| מספריים מיקרו חיתוך 4 אינץ' | חברת Roboz | RS-5882 | חותכת גם את העור וגם את הגולגולת של החולדה. |
| מלקחיים מיקרו-מלקחיים בזווית 4 אינץ', חדה עדינה | חברת Roboz | RS-5095 | מחזיק את עור החולדה בזמן הסרת הגולגולת. |
| מיקרו מלקחיים 4 אינץ' מעוקל מעט 0.8 | Roboz Company | RS-5135 | כלי המשמש להפרדת קליפות. |
| פינצטה מיקרו-מנתחת | Roboz RS-4972 | מקלפת את קרומי המוח במוח. | |
| מיקרוסקופ דיסקציה | אולימפוס | SZX16 | חשוב להסרת קרומי המוח מקליפת המוח. |
| הכנת DMEM - שלב 2 | |||
| Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני (DMEM) | GibCo. חברה | 11995-065 | תומכת בצמיחת תאים. |
| תוסף נתרן ביקרבונט | Sigma-Aldrich Company | S7277 | למדיית תרבית התאים. |
| סרום בקר עוברי (FBS) | GibCo. חברה | 10437-010 | תוסף סרום לתרבית התאים. |
| פניצילין-סטרפטומיצין | ג'יבקו. חברה | 15140-148 | מעכבת צמיחה של חיידקים בתרבית התאים. |
| מערכת סינון 1 ליטר עם נקבוביות 0.22um | קורנינג | 431098 | |
| <חזק>תרבית אסטרוציטים - שלב 3 | |||
| צנרת סרולוגית 5 מ"ל | VWR | 89130-896 | לפיפטה DMEM למיכלים עם תאים. |
| פיפטות סרולוגיות 10 מ"ל | VWR | 89130-898 | לפיפטה DMEM למיכלים עם תאים. |
| צנרת סרולוגית 25 מ"ל | VWR | 89130-900 | לפיפטה DMEM למיכלים עם תאים. |
| צינור חרוטי צנטריפוגה 15 מ"ל | סנטה קרוז ביוטכנולוגיה | sc-200250 | |
| צינור נעילה בטוחה 1.5 מ"ל | 022363204 | אפנדורף | |
| 200 uL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201725 | |
| טיפים למחסום 1 מ"ל | סנטה קרוז ביוטכנולוגיה | sc-201727 | |
| תיק כתום Biohazard 14 x 19 אינץ' | VWR | 14220-048 | |
| צלחות פטרי 60 מ"מ | פלקון | 351007 | |
| רפידות גזה סטריליות | Honeywell Safety | 89133-086 | |
| Stomacher 80 Biomaster | Sewar Lab System | 030010019 | טריטורציה של רקמת המוח. |
| Stomacher 80 בלנדר שקיות סטריליות | Sewar Lab System | BA6040 | שקית סטרילית להומוגניזטור תאי הקיבה. |
| 400 מ"ל | פיירקס | 1000 | |
| מסננת דיסוציאציה של תאים סטריליים, רשת #60 | חברת סיגמא-אולדריץ' | S1020 | להשגת מתלה אחיד של תא יחיד. |
| מסננת דיסוציאציה של תאים סטריליים, רשת #100 | חברת סיגמא-אולדריץ' | S3895 | להשגת מתלה אחיד של תא יחיד. |
| מיקרוסקופ פאזה הפוך | Nikon | Eclypse Ti-S | אמת תאים לזיהום או צמיחת תאים חריגה. |
| 75 ס"מ צלוחיות סטריליות | Falcon | 353136 | |
| Multi-well Plate | Falcon | 353046 | |
| משקפי כיסוי מיקרו (כיסויים), 18 מ"מ, עגול | VWR | 48380-046 | |
| Bright-Line hemacytometer | Company Sigma-Aldrich Company | Z359629 | |
| פיפטות פסטר | פישר סיינטיפיק | 13-678-20D | |
| אלכוהול אתילי | חברת Sigma-Aldrich | E7023 | |
| L-לאוצין מתיל אסטר הידרוכלוריד 98% (LME) | חברת Sigma-Aldrich | L1002 | מקדמת חיסול של תאי מיקרוגליה בתרבות האסטרוציטים הראשונית בקליפת המוח. |
| ציטוזין ובטא;-D-arabinofuranoside (Ara-C) | חברת סיגמא-אולדריץ' | C1768 | |
| פולי-D-ליזין הידרוברומיד, מול משקל 70,000-150,000 | חברת סיגמא-אולדריץ' | P0899 | |
| טריפסין/EDTA | GibCo. חברה | 15400-054 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich Company | T8154 | |
| טבליות מלח פוספט (PBS) | Calbiochem | 524650 | |
| מים סטריליים | Sigma-Aldrich Company | W3500 | |
| OGD הכנה בינונית - שלב 5 חרוטי חזק> | |||
| צנטריפוגה 50 מ"ל | VWR | 89039-658 | |
| Dulbecco' s שונה Eagle' s גלוקוז חופשי בינוני | Sigma-Aldrich Company | D5030 | תומך בצמיחת תאים. |
| תוסף נתרן ביקרבונט | Sigma-Aldrich Company | S7277 | למדיית תרבית התאים. |
| פניצילין-סטרפטומיצין | ג'יבקו. חברה | 15140-148 | מעכבת צמיחה של חיידקים בתרבית התאים. |
| 200 מ'M ל-גלוטמין | ג'יבקו. חברה | 25030-081 | חומצת אמינו המשלימה את צמיחת התאים. |
| טבליות מלח מאגר פוספהט (PBS) | Calbiochem | 524650 | |
| מערכת סינון 50 מ"ל עם נקבוביות 0.22um | קורנינג | 430320 | |
| צינור חרוטי צנטריפוגה 50 מ"ל | VWR | 89039-658 | |
| מד זרימה יחיד | בילופס-רוטנברג | SMF3001 | מדידת זרימת הגז בטיהור חמצן. |
| תא חממת היפוקסיה | StemCell | 27310 | מייצר סביבה היפוקסית לתרבית התאים. |
| מד חמצן מומס ניתן למעקב | VWR | 21800-022 | |
| 95% N2 / 5% תערובת גז CO2 | Linde | מטהר את הסביבה מחמצן. | |
| <אימונופלואורסצנציה אסטרוציטים חזקה>ראשונית - שלב 6 | |||
| טבליות מלח פוספט (PBS) | Calbiochem | 524650 | |
| Formaline Solution Neutral Buffer 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Solution המשמשת לקיבוע תאים. |
| מתנול | פתרון פישר | A4544 | המשמש לתיקון תאים. |
| חומר פעילי שטח לא יוני (Triton X-100) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | GibCo. חברה | 10437-010 | תוסף סרום לתרבית התאים. |
| Anti-NeuN | Cell Signaling | 24307 | מזהה נוירונים בוגרים, משמש לאימות התרבות האסטרוציטית. |
| איתות תאים נגד PCNA | 2586 | מזהה תאים מתרבים. | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich Company | P4170 | צביעת אפופטוזיס. |
| Anti-Olig1 | Abcam | AB68105 | מגלה אוליגודנדרוציטים בוגרים. |
| Anti-IBA1+ | Wako | 016-20001 | מזהה תאי מיקרוגליה. |
| אנטי-GFAP מצומד עם Cy3 | חברת Sigma-Aldrich | C9205 | מזהה אסטרוציטים תגובתיים בתאים המטופלים. |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probe Life Technology | A1101 | נוגדן משני נגד עכברים. |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probe Life Technology | A21428 | נוגדן משני נגד ארנב. |
| 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich Company | D9542 | צביעה גרעינית. |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | אולימפוס |
מקורות
- Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. Interrater reliability of the NIH stroke scale. Arch Neurol. 46 (6), 660-662 (1989).
- Hinkle, J. L., Guanci, M. M. Acute ischemic stroke review. J Neurosci Nurs. 39 (5), 285-293 (2007).
- Kassner, A., Merali, Z.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
