Summary
Vi beskriver en metod som använder riktad perifer bestrålning för att inducera trötthet-liknande beteende hos möss. Den valda icke-dödlig strålningsdos leder till en veckolång minskning av frivilliga hjul kör aktivitet.
Abstract
Cancerrelaterad trötthet (CRF) är en besvärande och kostsamt tillstånd som ofta drabbar patienter som får cancerbehandling, inklusive strålbehandling. Här beskriver vi en metod som använder riktad perifer bestrålning för att inducera trötthet-liknande beteende hos möss. Med lämplig avskärmning riktar bestrålningen nedre delen av buken / bäckenregionen av mus och skonar hjärnan, i ett försök att modellera strålbehandling emot av personer med bäckencancer. Vi levererar en strålningsdos som är tillräcklig för att inducera trötthet-liknande beteende hos möss, mätt genom frivillig hjul kör aktivitet (VWRA), utan att orsaka uppenbar sjuklighet. Eftersom hjulet kör är en normal, frivilligt beteende hos möss, bör dess användning har liten confounding effekt på andra beteendetester eller biologiska åtgärder. Därför kan hjul kör användas som ett möjligt utfall åtgärd förstå beteendemässiga och biologiska korrelat av trötthet. CRF är en komplex sjukdom med täta samarbetemorbidities, och sannolikt har orsaker som rör både cancer och dess olika behandlingar. De metoder som beskrivs i detta dokument är användbara för att undersöka strålningsinducerade förändringar som bidrar till utvecklingen av CRF och mer allmänt, för att utforska de biologiska nätverk som kan förklara utvecklingen och ihållande en perifert utlöst men centralt driven beteende som trötthet .
Introduction
Cancerrelaterad trötthet (CRF) är en besvärande och kostsamt tillstånd som ofta drabbar patienter som får cancerbehandling 1. Utmattnings är varken i proportion till den senaste aktiviteten eller lindras genom vila, och det är förenat med ett brett utbud av störningar i samband med humör, motivation, uppmärksamhet och kognition 2. De biologiska orsakerna till CRF är okända, även om det har visat sig i många fall för att korrelera med inflammation och cytokinnivåer, även i vissa fall med hemoglobinnivåer och funktionen hos olika hormonsystem (se et al. Saligan 3 för en genomgång av den biologiska studier av CRF).
Kontrollerade studier med användning av djurmodeller är nödvändiga för att förstå beteendet och biologi är associerad med detta komplex tillstånd. Medan tumörrelaterade fyra eller kemoterapi-relaterade 5, 6 fettigue har studerats i gnagarmodeller, kan etiologin av CRF vara behandlingsspecifika. För att undersöka CRF i samband med strålbehandling, har vår grupp nyligen utvecklat en musmodell av strålning-inducerad trötthet 7. Till skillnad från befintliga CRF modeller som involverar hjärnan eller helkroppsbestrålning 8, 9, utforskar denna modell hur en förändring i centralt driven beteende, som trötthet, kan utlösas av ett perifert riktade bestrålning förfarande.
Det förfarande som beskrivs här är utformad för att modellera strålbehandling ges till patienter med bäckencancer, använder blyavskärmning att rikta nedre delen av buken / bäckenregionen med bestrålning. Emellertid genom att modifiera blyavskärmning eller dess placering i förhållande till försöksdjur, detta förfarande skulle kunna anpassas för att modellera bestrålning av andra delar av kroppen. Frivillig hjul kör aktivitet (VWRA) används för att mäta trötthet liknande behavior; eftersom det är en frivillig och normalt beteende 10, bör den tillåta samtidig användning av andra beteende och biologiska tester. Vi har funnit att perifer bestrålning är tillräcklig för att minska VWRA i möss utan att förorsaka uppenbar morbiditet 7. Framtida experiment med denna modell kan hjälpa avslöja effekter av perifer strålning på immun och annat biologiskt signalering, samt efterföljande förändringar i det centrala nervsystemet som kan producera brister i samband med CRF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: Denna studie har godkänts av National Institutes of Health (NIH) Djurvård och användning kommittén. Alla utredare som deltar i djurhantering och mätning av studieresultat var ordentligt utbildade av NIH Office of Animal Care och användning och National Heart, Lung, and Blood Institute Murin Fenotypning kärnan. Alla aspekter av djurförsök, bostäder och miljöförhållanden som användes i denna studie var i enlighet med Guide för vård och användning av försöksdjur 11.
1. Bostäder och försöksdjur
OBS: Hus male C57BL / 6-möss (ungefär fem veckor gamla vid ankomsten) individuellt genom hela experimentet och ger ad libitum tillgång till mat och vatten. Alla burar hålls på en 12:12 h ljus-mörker-cykel med den lätta fasen börjar vid 06:00 och mörka fasen vid 18:00.
- Identifiera mössen och hänföra dem till enskilda standard ventilerad mus burar. Tillåt 24 timmar efter identifiering för återvinning.
OBS: Tail tatuering rekommenderas som ett medel för identifiering för att utesluta möjligheten att ett öronmärke kan fastna i en löphjul. Tatuera ett nummer på svansen på varje mus, med numret på svansen att matcha nummer skrivet på musens bur. - Tillåt möss för att acklimatisera sig till sina burar under minst tre dagar, hantering varje mus försiktigt under en period av tre minuter per dag.
2. löphjul Acklimatisering och baslinje
- Presentera mössen till enskilda VWRA burar, var och en utrustad med en löphjul som är ansluten till en elektronisk räknare för kontinuerlig inspelning.
OBS: Alla hjullastare räknare ansluta till en dator via en USB-gränssnitt (se Materials List). Den mjukvara beräknar antalet hjulrotationer, tillryggalagd sträcka, och medelhastighet över varje utsedd tidsintervall av den angivna totala duration. När inspelningen stoppas, är data automatiskt sparas både som text och som kalkylblad. - Initiera inspelning av VWRA genom datormjukvarugränssnittet. Ställ inspelning mellanrum till en timme och varaktighet till minst fem dagar. Fortsätt inspelning VWRA minst fem dagar.
OBS: Vid slutet av steg 2,2, bör alla möss uppnå en relativt konstant mängd av daglig hjul aktiviteten att springa. Om inte, då identifiera och utesluta eventuella extremvärden. - Stoppa VWRA inspelning genom programvaran gränssnitt och återgå mössen till sina standardburar som beskrivs i steg 1,1 (burar utan att hjul).
- Randomisera möss in i antingen sham-bestrålade kontroll eller bestrålade grupper.
3. Bestrålning
Obs: Utför följande steg för alla möss i båda grupperna, en gång per dag under tre på varandra följande dagar. Behandla möss i samma ordning varje dag.
- Söva varje mus genom intraperitoneal injektion aven ketamin (100 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg) blandningen.
- Bekräfta anestesi med en tå nypa och använda salva på ögonen för att förhindra torrhet under narkos.
- Överför sövda musen i en ledande avskärmningsanordning. Ordna musen i skärmn så att endast den nedre delen av buken / bäckenregionen är exponerad.
OBS: avskärmning är sammansatt av två bly "lådor", med ett smalt öppet utrymme däremellan som tillåter strålningsexponering till en liten, riktad regionen av mus (se Figur 1). - Använda medicinsk tejp för att fästa basen på musens svans i läge i skärmning.
OBS: Steg 3,4 är valfritt, men detta kan bidra till att läget för musen inte ändras under nästa steg. - Transportera skärmanordningen i bestrålningsanordningen, se till att djuret position inom skärm bibehålls.
- Om musen är i strålnings gruppen leverera 800 cGy vid en dose hastighet av omkring 110 cGy / min. Om musen är i bluff-bestrålning kontrollgruppen lämna musen i den inaktiva bestrå för motsvarande tid.
OBS: Optimala bestrå inställningar kommer att bero på den speciella enheten. Dosraten av 110 cGy / min levereras från en 137 cesiumkälla är den centrala doshastighet på den bestrålare användas här. Exponeringstiden justerades för att nå den önskade totala dosen av 800 cGy. - Ta bort musen från bestrålare och avskärmning, och sedan tillbaka till sin ursprungliga standard bur som nämns i steg 1,1.
- Kontinuerligt övervaka musen tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA.
4. Strålinducerad Trötthet Mätning
- På dagen efter avslutad tre på varandra följande dagar av strålning, överföra mössen till sina individuella VWRA burar som beskrivs i steg 2,1.
- Record VWRA, som beskrivs i steg 2,2, utom här ställa in inspelningsvaraktighet till mer än 15 dagar. Vid slutet av de 15 dagarna, manuellt stoppa VWRA inspelning via programvaran gränssnitt.
OBS: Data från varje inspelningstiden sparas automatiskt som kalkylblad, som var och en innehåller rotations, avstånd och hastighetsmätningar för alla djur (kolumner) och vid alla intervall (rader) under hela varaktigheten av inspelningen. Vid slutet av experimentet finns det två kalkylark som genereras av inspelningsprogrammet: en för pre-bestrålning VWRA, och ett för efter bestrålning VWRA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre partier av möss kördes genom det protokoll som beskrivits ovan. Det fanns totalt 16 bluff och 20 bestrålade (2400 cGy, 3 x 800 cGy / dag) möss. Efter tre dagar i rad av strålning, visade det bestrålade gruppen signifikant reducerad VWRA jämfört med placebo (blandade upprepade mätningar ANOVA: huvudsakliga effekten av strålbehandling, F 1,13 = 19,233, p <0,001). Effekten var signifikant för de första sju dagarna efter bestrålning (enkla viktigaste effekterna, p <0,05 med Bonferroni-korrektion), med den lägsta genomsnittliga VWRA avstånd förekommer på den tredje dagen efter strålning (Figur 2A). På dagarna 25 och 26, fanns inga data som samlas in på grund av andra beteendetestning.
Figur 2B visar fördelningen av förändringen i VWRA från före till efter bestrålning. Medan majoriteten av möss testades visade trötthet liknande symtom (en minskning in hjul aktiviteten att springa), fanns det ett litet antal möss som uppvisade liten förändring eller till och med en ökning av VWRA (Figur 2B, lägre plot). På grund av denna variation, kan experiment med små provstorlekar inte fånga trötthet-liknande beteende.
Figur 1: Lead skyddsapparaten. Att skärmning, som utvecklats internt, monteras som två identiska boxar. Placeras mössen med endast deras bäckenregionen exponerade i mellanrummet mellan de ledande rutorna. (A) Ett fotografi av den skärmande i sin behållare. Ledningen lådor är omgivna av polystyrenskum för att hålla dem på plats, som är omgiven av den 10,5-tums plexiglas diameter behållare som var avsedd för den bestrålare. (B) Schematisk bild av ledningen avskärmning. Ledningen avskärmning består av en tum tjocka block av bly arvarierade som två lådor. Varje låda består av fyra delar: de övre och nedre bitar är 4,25 "x 3" x 1 ", medan sidostyckena är ~ 0,5" x 3 "x 1". När den är monterad, de yttre dimensionerna hos varje låda är 4,25 "x 3" x 3 ", och det finns en 1" mellanrum mellan dem. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Daglig Frivillig Wheel körsträckan. (A) Genomsnittlig total sträcka drivs av möss varje dag (n = 16 kontroll, 20 bestrålade). Möss bestrålades på dagarna 14, 15 och 16. På dagarna 25 och 26, fanns inga data som samlas in på grund av andra beteendetestning. Felstaplar visar standardfelet av medelvärdet. * P <0,05. (B) Histogram av förändringen i VWRA, definieras här som medelvärdet av den tRE dagar omedelbart före bestrålning (dag 11 - 13) minus medelvärdet av de tre dagarna omedelbart efter strålning (dag 17 - 19). Positiva tal indikerar en minskning av VWRA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrivit ett protokoll med hjälp av riktad perifer bestrålning för att inducera en minskning av VWRA i möss utan confounding sjuklighet eller dödlighet. Viktigt, gör en enkel skärmanordning bestrålning i detta protokoll för att nå en önskad region konsekvent, imitera strålbehandling emot av patienter med bäckencancer. Till skillnad från befintliga CRF modeller som involverar hjärnan eller helkroppsbestrålning 8, 9, utforskar denna modell hur ett perifert riktade bestrålning förfarande kan påverka centralt driven utmattning. I våra representativa resultat visar vi att perifera bestrålning levereras på detta sätt är tillräcklig för att producera trötthet-liknande beteende med en fullständig återhämtning ungefär en vecka senare.
Som ett mått på trötthet, tillåter VWRA för enkel och objektiv bedömning av avstånd och hastighet under 24 timmar per dag, vilket kräver minimal utbildning och experimentera tid. det göres kräva bostäder möss i enskilda burar, vilket gör anläggningen utrymme en möjlig begränsande faktor. Även enskilda bostäder kan påverka mus beteende, vilket kan leda till ångest 12 eller hyperaktivitet 13, finns det bevis för att hjulet igång kan minska dessa negativa effekter 14. Hjul kör beteende har också visat sig ha mindre intra-mus variation och ökad reproducerbarhet än andra bedömningar av fysisk aktivitet 15. Det är dock möjligt att fysisk trötthet kan mer selektivt fångas i andra än frivillig aktivitet sätt, eftersom frivillig aktivitet kan bero på motivation eller annan än strikt fysisk trötthet 16 faktorer. Ytterligare experiment skulle vara nödvändigt att göra en sådan bestämning.
Emellertid finns det flera punkter inom det protokoll som är kritiska för att lyckas. Det är viktigt att möss är tillåtna tid att Recover vid ankomsten i en ny anläggning, och att hantering skall genomföras under denna period som noterats. Dessa procedurer minska stress och ångest, vilket kan påverka frivilligarbete 17. Att upprätthålla fullständig anestesi under bestrålningen processen är också kritisk, inte bara på grund av att begränsas i slutna utrymmen (blyavskärmning) kan vara en betydande stressfaktor för djuren 18, men också för att undvika onödig exponering av andra organ / vävnader bestrålning. Det är därför viktigt att säkerställa att dosen av bedövningsmedlet är tillräcklig för ålder och stam av möss före start av bestrålningen portion av detta protokoll. Dessutom är acklimatisering av möss till löphjul i minst fem dagar kritisk för att erhålla stabila beteende före bestrålning och lämpliga data för analys.
Att felsöka ovanliga VWRA nummer bör VWRA burar regelbundet kontrolleras för eventuella problem. för example, om bäddmaterial blir staplade på eller direkt under hjulet, eller om löphjulen inte är tillräckligt ren, kan detta lägga motstånd till hjulspinning och minska aktivitetsmätningar nivå. Dessutom, eftersom de flesta hjul kör inträffar under dygnets mörka timmar 7, kan VWRA vara känsliga för variationer i ljuscykel, och försiktighet bör vidtas för att hålla ljuscykler regelbundet och utan avbrott.
Detta protokoll kan rymma användningen av olika nivåer av bestrålning. Till exempel beskrev vi tre dagars dosering med 800 cGy i detta protokoll, men vi har sett något lägre nivåer av trötthet med hjälp av tre dagar av 600 cGy dosering 7. Effekterna av en viss strålningsdos kommer att bero på den stam av möss 19, doseringshastighet av bestrålningsanordningen 20, fraktionering över flera dagar 21 och sannolikt regionens storlek expSTÄNGD nedanför skärmning. Enstaka doser av 1000 cGy helkroppsbestrålning har använts i C57 / BL6 möss utan ökad dödlighet 22, men försiktighet bör vidtas för att säkerställa att höga doser av strålning producerar inte några tecken på sjuklighet.
Förutom stråldosen kan flera andra steg kan modifieras för att passa försöket till hands. Genom att modifiera blyavskärmning eller djurets placering inom avskärmningen, kan dessa metoder anpassas för att rikta andra kroppsregioner med bestrålning. Dock bör ändringar i skärmanordningen valideras med dosimetri för att säkerställa att bestrålning inte tränga in i avskärmade området. Detta protokoll kan också anpassas för att införliva en mängd olika beteendeåtgärder, som frivilliga aktiviteten att springa inte utesluter beteendeförsök som är mer fysiskt eller mentalt krävande. Till exempel förekommer CRF ofta tillsammans med kognitiva brister 3; framtidaexperiment kan utforska den roll som strålbehandling kan spela i denna förening. Närvaron av hjulet igång verksamheten måste beaktas när man utför ytterligare beteendetester, som VWRA kan påverka fysiologi och beteende på många sätt 16.
Med strålningsdoser av 800 cGy eller mindre, bör mössen inte behöver särskild vård efter att återhämta sig från anestesi. Emellertid kan strålningsförfarande och resulterande trötthet potentiellt interagera med andra insatser som ytterligare beteendetester eller läkemedelsbehandling. Djuren bör övervakas noga på dagarna omedelbart efter bestrålning när ändra eller lägga till denna beskrivna proceduren. Olika stammar av möss kan också visa olika känslighet för strålning 19, så krävs försiktighet vid användning av andra än C57BL / 6-stammar.
Även om denna teknik är utformad för att representera strålning-inproduceras trötthet, är det bara en del av den komplexa CRF konceptet. CRF är ett tillstånd som sannolikt har många orsaker och uppträder hos patienter som har cancer och ofta får flera behandlingar. En förståelse av CRF kan därför kräva uppsättningar av experiment med tumörbärande möss och med andra behandlingar såsom kemoterapi eller hormonterapi. Införliva dessa variabler i biologiska och beteendetester kommer att tillåta forskare att identifiera deras bidrag till denna komplexa tillstånd. Musmodellen beskrivs här kan hjälpa till att förstå den specifika roll av strålning i CRF och utveckla potentiella läkemedel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Denna forskning stöds av avdelningen för Intramural Research, National Institute of Nursing Research, National Institutes of Health.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Michele Allen av National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) av National Institutes of Health (NIH) för generöst dela sin expertis i murina fenotypning metoder och för hennes pågående tekniskt stöd, liksom för Timothy Hunt av NHLBI för att hjälpa oss att utveckla skärmanordningen. Denna studie stöds av Avdelningen för Intramural forskning av National Institute of Nursing Research av NIH, och en del av validerings prov stöds av ett bidrag från Oncology Nursing Society Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mice | Charles River | Strain code 027 (http://www.criver.com/products-services/basic-research/find-a-model/c57bl-6n-mouse) | |
| Ketamine HCl | Putney | 100 mg/mL stock solution | |
| Xylazine HCl | Lloyd Laboratories | 100 mg/mL stock solution | |
| Rodent Tattoo System | AIMS | ATS-3 | http://animalid.com/lab-animal-identification-systems/ats-3-general-rodent-tattoo-system |
| Lead Shielding Apparatus | (custom made) | One-inch thick lead shielding arranged as two boxes with a one-inch thick gap between them for targeted irradiation | |
| Plexiglass shielding container | (custom made) | Plexiglass container filled with styrofoam. Styrofoam cutouts hold the lead shielding in place. | |
| GammaCell 40 Exactor | Best Theratronics | http://www.theratronics.ca/product_gamma40.html | |
| RAD Disk Ultra | Best Theratronics | http://www.theratronics.ca/product_rad.html | |
| Mouse Single Activity Wheel Chamber | Lafayette Instrument Company | #80820 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=980 |
| Activity Wheel Counter for Computer Monitoring | Lafayette Instrument Company | #86061 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1052 |
| Modular Cable for Wheel Counters | Lafayette Instrument Company | #86051-7 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1046 |
| USB Computer Interface for Activity Wheel Counters | Lafayette Instrument Company | #86056A | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1047 |
| Activity Wheel Monitor Software | Lafayette Instrument Company | #86065 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1053 |
References
- Minton, O., et al. Cancer-related fatigue and its impact on functioning. Cancer. 119, Suppl 11. 2124-2130 (2013).
- Bower, J. E. Cancer-related fatigue--mechanisms, risk factors, and treatments. Nat Rev Clin Oncol. 11 (10), 597-609 (2014).
- Saligan, L. N., et al. The biology of cancer-related fatigue: a review of the literature. Support Care Cancer. 23 (8), 2461-2478 (2015).
- Norden, D. M., et al. Tumor growth increases neuroinflammation, fatigue and depressive-like behavior prior to alterations in muscle function. Brain Behav Immun. 43, 76-85 (2015).
- Ray, M. A., Trammell, R. A., Verhulst, S., Ran, S., Toth, L. A. Development of a mouse model for assessing fatigue during chemotherapy. Comp Med. 61 (2), 119-130 (2011).
- Zombeck, J. A., Fey, E. G., Lyng, G. D., Sonis, S. T. A clinically translatable mouse model for chemotherapy-related fatigue. Comp Med. 63 (6), 491-497 (2013).
- Renner, M., et al. A murine model of peripheral irradiation-induced fatigue. Behav Brain Res. 307, 218-226 (2016).
- Van der Meeren, A., Lebaron-Jacobs, L. Behavioural consequences of an 8 Gy total body irradiation in mice: Regulation by interleukin-4. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 79 (2), 140-143 (2001).
- York, J. M., et al. The biobehavioral and neuroimmune impact of low-dose ionizing radiation. Brain Behav Immun. 26 (2), 218-227 (2012).
- Meijer, J. H., Robbers, Y.
- The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th Edition, National Research Council of the National Academies. (2011).
- Heredia, L., Torrente, M., Domingo, J. L., Colomina, M. T. Individual housing and handling procedures modify anxiety levels of Tg2576 mice assessed in the zero maze test. Physiol Behav. 107 (2), 187-191 (2012).
- Varty, G. B., Paulus, M. P., Braff, D. L., Geyer, M. A. Environmental enrichment and isolation rearing in the rat: effects on locomotor behavior and startle response plasticity. Biol Psychiatry. 47 (10), 864-873 (2000).
- Pham, T. M., Brene, S., Baumans, V. Behavioral assessment of intermittent wheel running and individual housing in mice in the laboratory. J Appl Anim Welf Sci. 8 (3), 157-173 (2005).
- Knab, A. M., et al.
- Novak, C. M., Burghardt, P. R., Levine, J. A. The use of a running wheel to measure activity in rodents: relationship to energy balance, general activity, and reward. Neurosci Biobehav Rev. 36 (3), 1001-1014 (2012).
- Mineur, Y. S., Belzung, C., Crusio, W. E. Effects of unpredictable chronic mild stress on anxiety and depression-like behavior in mice. Behav Brain Res. 175 (1), 43-50 (2006).
- Perhach, J. L. Jr, Barry, H. 3rd Stress responses of rats to acute body or neck restraint. Physiol Behav. 5 (4), 443-448 (1970).
- Iwakawa, M., et al. Different radiation susceptibility among five strains of mice detected by a skin reaction. J Radiat Res. 44 (1), 7-13 (2003).
- Travis, E. L., Peters, L. J., McNeill, J., Thames, H. D. Jr, Karolis, C. Effect of dose-rate on total body irradiation: lethality and pathologic findings. Radiother Oncol. 4 (4), 341-351 (1985).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
- Duran-Struuck, R., et al. Differential susceptibility of C57BL/6NCr and B6.Cg-Ptprca mice to commensal bacteria after whole body irradiation in translational bone marrow transplant studies. J Transl Med. 6, 10 (2008).
