Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.
Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.
99mTc forblir den dominerende radioisotopen benyttes i diagnostisk kjernefysisk medisin, med over 50 millioner avbildningsprosedyrer som utføres hvert år på verdensbasis 1, 2, 3. Flertallet av 99mTc midler som anvendes klinisk er perfusjon typen radiofarmasøytika. Det er et begrenset antall av aktivt målrettede forbindelser hvor 99mTc er rettet til å binde en spesifikk biomarkør gjennom ligering til en målretting konstruksjon. Opprettelsen av målrettet 99mTc radiofarmasøytika er ofte hindret ved påvirkning av 99mTc-ligand-kompleksene på evnen av den målsøkende molekyl for å binde det biomarkør av interesse, eller de isotoper halveringstid er ikke lang nok for bruk med høyere molekylvekt biomolekyler slik som antistoffer. Sistnevnte krever vanligvis flere dager før bildene er ervervet for at biomolekyl å fjerne fra ikke-target tiss verdier. Pre-målretting tilbyr en alternativ tilnærming til å overvinne disse utfordringene.
Pre-målretting kombinert med bioorthogonal kjemi har vist seg å være en effektiv måte for å utvikle nye molekylære avbildnings prober for både fluorescens og radio-avbilding 4, 5, 6, 7, 8. Den inverse elektron krav Diels-Alder (IEDDA) Reaksjonen mellom 1,2,4,5-tetrazine (Tz) og trans -cyclooctene (TCO) derivater, slik som vist i figur 1, har vist seg å være spesielt effektiv 6. Den IEDDA reaksjon med disse komponentene kan fremvise raske kinetikk i PBS (k 2 ≈ 6000 M -1 s -1) og høy selektivitet, noe som gjør den ideell for in vivo pre-målretting applikasjoner 9, 10.
e_content "> Den vanligste tilnærmingen som brukes innebærer å administrere en TCO-avledet målretting vektor og etter en tilstrekkelig forsinkelsesperioden, er en radiomerket tetrazine administreres. Radiomerkede tetraziner basert på 11 C, 18 F, 64 Cu, 89 Zr, og 111 In har vært rapporterte 11, 12, 13, 14, 15. i motsetning til dette, er det bare en rapport av en 99m Tc-merket Tz, som ble fremstilt ved anvendelse av en HYNIC typen ligand som krever bruk av ko-ligander for å forhindre proteinbinding og degradering in vivo 16. som et alternativ, rapporterer vi her syntesen av 99mTc (i) merket tetraziner ved hjelp av en familie av ligander som danner stabile komplekser med tridentate en [99mTc (CO) 3] + kjerne. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-palder = "en">Familien av ligander fremstilt inneholde tridentate chelater som varierer i polaritet og arten av bindingsgruppe mellom metall-bindende regionen og den Tz (figur 2). Målet var å identifisere en 99m Tc-Tetrazine konstruksjon som effektivt kunne lokalisere og reagere med TCO-merkede områder in vivo og raskt klart da ikke er bundet, for å gi høy target-til-ikke-target-forhold. For å teste ligander, ble en TCO-derivat av et bisfosfonat (TCO-BP) brukes 17. Vi har tidligere vist at TCO-BP lokaliserer til områder med aktiv benmetabolisme og kan reagere medradiomerket tetraziner in vivo 18. Det er et passende reagens for å teste nye tetraziner, fordi det kan fremstilles i et enkelt trinn og eksperimenter kan utføres i normale mus, hvor lokaliseringen skjer hovedsakelig i leddene (knær og skuldrene).
En samling av tetrazine bundet tridentate chelater av ulik polaritet var forberedt, og nytten av sine 99m Tc komplekser i IEDDA reaksjon med en TCO derivat in vivo ble vurdert. En effektiv og reproduserbar 99mTc merking metode ble utviklet for fem tetrazine-chelatene, hvor ligandkonsentrasjonen var 10 -3 M. markeringstrinn ble etterfulgt av avbeskyttelse av t- butyl-grupper (for forbindelsene 2-5). Den høye konsentrasjonen av ligand ble anvendt for å …
The authors have nothing to disclose.
This work supported by research grant funding from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada, the Ontario Institute for Cancer Research (OICR, #P.SI.015.8), and the Canadian Cancer Society (CCS, #703857). The authors acknowledge the contributions of Dr. Denis Snider who provided assistance in preparing the manuscript.
Argon gas | Alphagaz | — | — |
Na2CO3 | EMD Millipore | 106395 | — |
Na2B4O7.10H2O | Anachemia | S9640 | — |
KNaC4H4O6.4H2O | Anachemia | 217255 | — |
Technelite 99mTc generator | Lantheus medical imaging | — | Source of 99mTcO4- |
0.9% Saline | Lantheus medical imaging | — | To elute generator |
1 M HCl | Lab Chem | — | — |
MeOH | Caledon | — | — |
ACN | Caledon | — | HPLC grade |
Millipore H2O | Thermo Fisher Scientific | Barnstead Nanopure | — |
DCM | Caledon | — | — |
TFA | Caledon | — | — |
PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 1X |
BSA | Sigma Aldrich | A7906 | — |
Tween80 | Sigma Aldrich | P8047 | — |
Isoflurane | CDMV | 108737 | Supplier: Fresenius Kabi Animal Health |
HPLC | Waters | 1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590) | — |
HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4 | Phenomenex | 00G-4435-E0 | Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm, |
HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5 | Waters | 186003115 | XBridge BEH C18 Column, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm X 100 mm |
Microwave Reactor | Biotage | Initiator 8 | — |
Biotage V10 Evaporator | Biotage | Serial # V1041 | — |
Dose calibrator | Capintec, Inc. | CRC-25R | — |
Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | — |
Animal room scale | Mettler Toledo | XP105 Delta Range | — |
Microwave vials | Biotage | 355629 | 0.5-2 mL |