Nous présentons ici pluripotentes humaines protocoles de culture de cellules souches (hPSC), utilisés pour différencier les hPSCs en CD34+ progéniteurs hématopoïétiques. Cette méthode utilise la manipulation spécifique au stade de canonique WNT de signalisation indiquer les cellules exclusivement pour le programme hématopoïétique de définitif ou primitif.
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Article de méthode
Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines
Dans cet article
Résumé
Résumé
Un des objectifs majeurs pour la médecine régénérative est la production et la maintenance de cellules souches hématopoïétiques (CSH) dérivé des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs). Jusqu'à une date récente, efforts pour hPSCs se différencient en CSH ont généré principalement des progéniteurs hématopoïétiques qui manquent potentiel d’HSC et plutôt ressembler à l’hématopoïèse sac vitellin. Ces progéniteurs hématopoïétiques qui en résulte peuvent ont une utilité pour in vitro de modélisation maladie de divers troubles hématopoïétiques adultes, particulièrement ceux des lignées lymphoïdes limitée. Cependant, nous avons récemment décrit des méthodes pour générer l’érythro-myélo-lymphoïdes multilignées progéniteurs hématopoïétiques définitifs de hPSCs à l’aide d’un protocole spécifique au stade de différenciation dirigée, qui nous exposons ici. Par le biais de dissociation enzymatique du hPSCs sur la membrane basale enduit de matrice ustensiles en plastique, corps embryoïdes (EBs) sont forment. EBs sont différenciés au mésoderme par BMP4 recombinant, qui est spécifié par la suite au programme hématopoïétique définitif par l’inhibiteur de la GSK3β, CHIR99021. Alternativement, l’hématopoïèse primitif est spécifiée par l’inhibiteur de la PORCN, IWP2. Hématopoïèse est plus entraîné par l’addition de recombinant VEGF et soutien hématopoïétique cytokines. Les progéniteurs hématopoïétiques résultants générés à l’aide de cette méthode ont le potentiel d’être utilisé pour la modélisation du développement, in vitroet de maladie.
Introduction
Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) sont définis comme englobant les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs) et ont la capacité unique non seulement en cours de renouvellement automatique dans des conditions appropriées de croissance, mais aussi, la capacité à se différencier en tous types de cellules dérivées des trois couches de germe : ectoderme, mésoderme et endoderme1. En raison de ces capacités uniques, hPSCs sont très prometteurs pour la médecine régénérative, modélisation de maladies et thérapies à base cellulaire2. Alors que ....
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Protocole
1. réactifs
- obtenir cell lines ; CSEh ou hiPSCs 1, souris fibroblastes embryonnaires (MEFs) 29, OP9-DL4 stroma 30 , 31.
- préparation du réactif
- préparer une solution à 0,1 % p/v de la gélatine dans du PBS. Stériliser à l’autoclave et conserver à 4 ° C après aliquotage.
- Prepare les ustensiles en plastique enduit de gélatine. Manteau 6 paraboloïdes avec 1,5 mL de solution de gélatine de 0,1 %. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Immédiatement avant l’emploi, aspirer la solution de gélatine restant....
- préparer une solution à 0,1 % p/v de la gélatine dans du PBS. Stériliser à l’autoclave et conserver à 4 ° C après aliquotage.
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Résultats
Un schéma illustrant l’induction des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitives de hPSCs est illustré à la Figure 1. Mésoderme structuration par canonique WNT signaling se produit pendant les jours 2 et 3 de la différenciation, suivie de la spécification des cellules souches hématopoïétiques.
Représentatif de cytométrie et formant les dosages de méthylcellulose de cultures hPSC dérivé d.......
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Discussion
Ce protocole décrit une méthode rapide, sans sérum, exempt de stroma de la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives ou définitifs. Mésodermiques spécification des progéniteurs hématopoïétiques primitives ou définitifs peut être réalisée de façon fiable utilisant notre protocole, qui exploite uniquement des petites molécules inhibitrices de la signalisation WNT canonique. Activation de WNT spécifiques au stade de l’inhibiteur de la GSK3β CHIR9902133 donne lieu à mésoderme hémato.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le Department of Internal Medicine, Division d’hématologie, Washington University School of Medicine. CD a été pris en charge par T32HL007088 du National Heart, Lung, and Blood Institute. CMS a été pris en charge par une société américaine d’hématologie Scholar Award.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Milieu Dulbecco’s modifié (IMD) | Corning | 10-016 | |
| Sérum de veau fœtal (FBS), ES noté cellule | Gemini Bioproducts | 100-500 | |
| Sérum de veau fœtal (FBS) | Hyclone | SH30396.03 | |
| L-glutamine, solution 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | |
| Pénicilline-streptomycine | Vie Technologies | 15070-063 | |
| 0,25 % Trypsine-EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| 0,05 % Trypsine-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Gélatine, peau porcine, type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Alpha-MEM | Life Technologies | 12000-022 | |
| DMEM-F12 | Corning | 10-092-CV | |
| Remplacement sérique knock-out | Life Technologies | 10828028 | "KOSR" |
| Acides aminés non essentiels (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| b-mercaptoéthanol, solution 55 mM | Technologies | 21985023 | |
| Acide chlorhydrique | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Fraction V, Albumine sérique | bovine Fisher Scientific | BP1605 | |
| Ham’s F12 | Corning | 10-080 | |
| Supplément N2 | Life Technologies | 17502048 | |
| supplément B27, sans vitamine A | Technologies | 12587010 | |
| Stempro-34 (SP34) | Life Technologies | 10639011 | "SP34" |
| Facteur de croissance réduit Matrigel | Corning | 354230 | "MAT" |
| Acide L-absorbique | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Transferrine sérique humaine | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Monothioglycérol (MTG) | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| Collagénase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagenase II | Technologies | 17101015 | |
| DNaseI | Calbiochem | 260913 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| bFGF | R& D Systems | 233-FB | |
| BMP4 | R& D Systems | 314-BP | |
| Activin A | R& D Systems | 338-AC | |
| VEGF | R& D Systems | 293-VE | |
| SCF | R& D Systems | 255-SC | |
| IGF-1 | R& D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R& D Systems | 203-IL | |
| IL-6 | R& D Systems | 206-IL | |
| IL-7 | R& D Systems | 207-IL | |
| IL-11 | R& D Systems | 218-1L | |
| TPO | R& D Systems | 288-TP | |
| EPO | Peprotech | 100-64 | |
| Flt-3 ligand (FLT3-L) | R& D Systems | 308-FK | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| IWP2 | Tocris | 3533 | |
| Angiotensine II | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Losartan Potassium | Tocris | 3798 | |
| CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 | BD Biosciences | 560650 | Dilution 1:100 ; Dosage des lymphocytes |
| T CD8 PE Clone RPA-T8 | BD Biosciences | 561950 | Dilution 1:10 ; Dosage des lymphocytes |
| T CD34 APC Clone 8G12 | BD Biosciences | 340441 | Dilution 1:100 ; Test EHT |
| CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 | BD Biosciences | 348801 | Dilution 1:100 ; Endothélium |
| hémogénique CD43 FITC Clone 1G10 | BD Biosciences | 555475 | Dilution 1:10 ; Endothélium hémogénique |
| CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 | BD Biosciences | 557833 | Dilution 1:50 ; Dosage des lymphocytes |
| T CD45 eFluor450 Clone 2D1 | BD Biosciences | 642284 | Dilution 1:50 ; Test EHT |
| CD56 APC Clone B159 | BD Biosciences | 555518 | Dilution 1:20 ; Dosage des lymphocytes |
| T CD73 PE Clone AD2 | BD Biosciences | 550257 | Dilution 1:50 ; Endothélium hémogénique |
| CD184 Clone APC 12G5 | BD Biosciences | 555976 | Dilution 1:50 ; endothélium hémogénique |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | BD Biosciences | 564907 | Dilution 1:10 000 ; Dosage des lymphocytes |
| T Cellules | Holmes, R. et J.C. Zuniga-Pflucker. Printemps froid Harb Protoc, 2009. 2009(2) : p. pdb prot5156 | ||
| MethoCult H4034 | Stemcell Technologies | 4034 | "MeC" |
| Système de purification d’eau Milli-Q | EMD Millipore | ||
| 5 % CO2 incubateur | Set à 37 C | ||
| Incubateur | Set à 37 C, 5 % CO2, 5 % O2 | ||
| puits plaque de culture tissulaire | Corning | 353046 | |
| Plaque de culture tissulaire à 24 puits | Corning | 353226 | |
| Plaque de culture tissulaire à faible adhérence à 6 puits | Corning | 3471 | |
| Plaque de culture tissulaire à faible adhérence à 24 puits | Corning | 3473 | |
| Boîtes de culture tissulaire de 35 mm | Corning | 353001 | |
| Aiguille à extrémité arrondie, calibre 16 | Corning | 305198 | |
| seringues | de 3 ccTube | ||
| 5 mL Tube à essai en polystyrène | Corning | 352063 | |
| 5 mL Tube à essai en polypropylène | conique Corning | 352058 | |
| 15 mL | 430791 | ||
| cône en polypropylène | Corning | 430921 | |
| 2 mL Pipette sérologique | Corning | 357507 | |
| Pipette sérologique 5 mL | Corning | 4487 | |
| Pipette sérologique 10 mL | Corning | 4488 | |
| Pipette sérologique 25 mL | Corning | 4489 | |
| Racleurs cellulaires | Corning | 353085 | |
| 5 mL tube à essai avec 40 µ ; Crépine à cellules M | Corning | 352235 | |
| 40 µ ; Filtre à cellules M | Corning | 352340 | |
| Centrifugeuse | |||
| Hotte | |||
| FACS AriaII ou équivalent | |||
| logiciel FlowJo TreeStar | |||
| Bain | d’eau réglé à 37 °C | ||
| 0,22 et micro ; Système de filtration M | Corning | ||
| Autoclave | |||
| 4 C réfrigérateur-20 | |||
| C Congélateur-80 | |||
| C Congélateur |
Références
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic developme....
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Réimpressions et autorisations
