Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Eencellige Gene Expression Profiling Met behulp van FACS en qPCR met interne standaarden

doi: 10.3791/55219 Published: February 25, 2017

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Afzonderlijke cellen in een populatie kan sterk verschillende reacties op een uniforme fysiologische stimulus 1, 2, 3, 4 vertonen. De genetische variatie van cellen in een populatie is één mechanisme voor deze verschillende reacties, maar er zijn ook een aantal niet-genetische factoren die de variabiliteit van de reacties kan verhogen, zelfs in een klonale populatie van cellen. Bijvoorbeeld kan de hoeveelheid melk eiwitten en andere belangrijke signaalmoleculen afhankelijk van een cel per cel basis, hetgeen leidt tot variatie in stroomafwaartse genexpressieprofielen. Bovendien kan genactivatie optreden bij kortdurende uitbarstingen van transcripten 5, 6 die kan worden beperkt tot een relatief klein aantal transcripten per burst 7, 8, 9. zodanigstochasticity in genactivering kan aanzienlijk bijdragen tot variabiliteit in biologische reacties en een selectief voordeel verschaffen in microörganismen 10 en zoogdiercellen 1, 2 reageert op een fysiologische stimulus. Door zowel genetische en niet-genetische bronnen van variatie, kan het genexpressie profiel van elke bepaalde cel in reactie op een stimulus sterk afwijken van de gemiddelde genexpressieprofiel verkregen uit de meting van de massa respons. Vaststelling van de mate waarin individuele cellen geven variabiliteit in reactie op een stimulus vereist technieken voor isolatie van afzonderlijke cellen, het meten van de expressieniveaus van transcripten van belang en de geautomatiseerde analyse van de resulterende expressieplasmide gegevens.

Er zijn verschillende manieren voor het bepalen van genexpressie in enkele cellen, die een breed scala van kosten, het aantal transcripten gesondeerd ennauwkeurigheid van de kwantificering. Bijvoorbeeld eencellige RNA-Seq biedt een grotere scherptediepte transcript dekking en het vermogen om duizenden verschillende transcripten voor de hoogst uitgedrukte genen in individuele cellen te kwantificeren; echter kunnen de kosten voor een dergelijke sequentie diepte onbetaalbaar, maar kosten blijven dalen. Omgekeerd, enkel-molecuul RNA fluorescentie in situ hybridisatie (FISH smRNA) biedt nauwkeurige kwantificering van transcripten voor zelfs low-genen tot expressie tegen een redelijke prijs per gen van belang; echter, kan slechts een klein aantal doelgenen worden getest in een bepaalde cel van deze benadering. Kwantitatieve PCR-gebaseerde testen beschreven in dit protocol, te midden tussen deze technieken. Deze assays maken gebruik van een microfluïdische real-time PCR machine te kwantificeren 96 transcripten plaats in een tijd tot 96 cellen. Terwijl elk van de bovengenoemde methoden heeft hardwarefuncties, de kosten van elke afzonderlijke qPCR assay relatieflaag. Dit protocol is een bewerking van een door een fabrikant van een microfluïdische real-time PCR machine (Protocol ADP 41, Fluidigm) voorgesteld. Om de schatting van het absolute aantal van elke transcript in een PCR-gebaseerde aanpak mogelijk te maken, hebben we het protocol om gebruik te maken van de interne controle van bereide target-gen amplicons die over meerdere experimenten kan worden gebruikt maken uitgebreid.

Als voorbeeld van deze techniek wordt de kwantificering van de expressie van genen gereguleerd door de tumorsuppressor p53 in MCF-7 humane borstcarcinoomcellen 11 beschreven. De cellen worden blootgesteld aan een chemisch agens dat DNA dubbelstrengige breuken induceert. Eerdere studies hebben aangetoond dat de p53 respons op DNA dubbelstrengs breuken vertoont veel heterogeniteit in individuele cellen, zowel wat p53 niveaus 12 en bij de activering van verschillende doelgenen 11. Bovendien p53 regelt de expressie van meer dan 100goed gekarakteriseerde target genen betrokken bij tal stroomafwaartse paden, zoals celcyclus, apoptose, senescentie en 13, 14. Aangezien de p53-gemedieerde respons in elke cel is complex en variabel, de analyse van het systeem beschikt over een benadering waarbij bijna 100 doelgenen kan gelijktijdig geprobed in individuele cellen, zoals hieronder beschreven. Met kleine aanpassingen (zoals alternatieve methoden voor eencellige isolatie en lysis) Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan een breed scala van zoogdier celtypen, transcripties en cellulaire reacties te bestuderen.

Met een goede voorbereiding vooraf, kan een rondje celsortering en genexpressie metingen worden uitgevoerd volgens dit protocol over een periode van drie dagen. De volgende timing wordt voorgesteld: van tevoren, selecteert u de transcripties van belang, te identificeren en valideren van de primerparen dat de cDNA versterken van die transcrIPTS, en de voorbereiding van de normen en primer mixen met behulp van deze primers. Op dag 1 na celtherapie, oogst en de cellen te sorteren, voert reverse transcriptie en specifieke amplificatie en behandeling van de monsters met een exonuclease om niet opgenomen primers te verwijderen. Op dag 2, het uitvoeren van kwaliteitscontroles op gesorteerde cellen met behulp van qPCR. Tenslotte op dag 3, meet de genexpressie in de cellen gesorteerd met behulp microfluïdische qPCR. Figuur 1 vat de stappen betrokken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Advance Voorbereiding

  1. Selecteer tot 96 genen van belang waarvan de expressie zal worden gemeten.
    OPMERKING: Ten minste één van deze genen zou een "huishoud gen" zoals ACTB of GAPDH, dat bekend is tot expressie op een betrekkelijk hoog en constant niveau onder de in het experimentele omstandigheden. Dit gen wordt gebruikt om positief gesorteerd putjes (stap 8,1) en geamplificeerde monsters (stap 10.1) te identificeren.
    OPMERKING: Bij het voorbeeld experiment goed gekarakteriseerd, directe doelwit van p53 met allerlei gekende functies 11, 14 en GAPDH als een housekeeping controle werden geselecteerd. Zie Referentie 11 voor de volledige lijst van target genen en primer sequenties die in deze studie.
  2. Identificeren van potentiële primerparen die specifiek zijn voor de genen van belang (bijvoorbeeld, met behulp van de wetenschappelijke literatuur of een primer design tool zoals Primer-BLAST) 15. Laat de primers gesynthetiseerd en hen te handhaven op een voorraad concentratie van 100 uM in nuclease-vrij water.
    LET OP: Deze primers moeten 15-25 basen lang zijn; produceren van een amplicon 90-130 baseparen (bp) lang; overspannen een exon junctie, indien aanwezig, om de kans op het amplificeren van genomisch DNA te verminderen; hebben smelttemperaturen van 60 ± 1 ° C; en hebben een minimale secundaire structuur 16. Deze primers worden gebruikt voor het primen reverse transcriptie, cDNA amplificeren van de transcripten van belang, en meet genexpressie in DNA bindende kleurstof gebaseerde qPCR.
  3. Valideren de primers.
    1. Eerst verkrijgen cDNA uit de cellen van belang. Oogst RNA uit de cellen met een RNA oogsten kit volgens de instructies van de fabrikant of standaard moleculair biologische werkwijzen 17. Reverse-transcriberen het RNA in cDNA met behulp van een reverse transcriptie kit met willekeurige hexameren volgens de instructies van de fabrikant of standaard methods 17.
    2. Voor elk primerpaar, opgericht qPCR met DNA-bindende kleurstof master mix, voorwaartse en achterwaartse primers, en het cDNA van de vorige stap, naar aanleiding van de aanbevelingen van de master mix fabrikant voor suggereerde reactie omstandigheden. Run deze reacties op een real-time PCR machine met behulp van een thermische cyclus protocol aanbevolen door de master mix fabrikant die smelt curve overname omvat.
    3. Na de qPCR, voert het geamplificeerde DNA monsters op een 2% w / v agarosegel en het DNA te visualiseren via een DNA intercalerende kleurstof volgens een standaard protocol 17.
    4. Bepaal de efficiëntie van het primerpaar door het construeren van een standaardkromme seriële verdunningen van cDNA (in stap 1.3.1) volgens een standaard protocol 16.
      LET OP: Een goede primer pair zal een smelt curve opleveren met een enkele, goed gedefinieerde piek en een enkele band in de verwachte locatie op de gel 16, up class = "xref"> 17 (figuur 2). Als de smelt curve meerdere pieken of een "schouder" of wanneer de gel meerdere banden of een uitstrijkje, worden de primers amplificeren een off-doelsequentie. Redesign elke primers die zijn waargenomen aan off-target sequenties versterken en herhaal de vorige validatie stappen als dat nodig is. Een goede primerpaar zal ook een rendement van 90-110%, met R 2 ≥0.985 de standaardkromme 16; herontwerp alle primers die de doelmatigheid of R 2 vallen buiten deze bereiken.
  4. Bereid normen van gezuiverd DNA amplicons.
    1. Voor elk gevalideerd primerpaar:
      1. Amplify het interessegebied van cDNA met behulp van een high-fidelity DNA polymerase volgens de aanbevelingen van de fabrikant voor polymerase primer en matrijs-DNA concentraties reactieomstandigheden en PCR cyclingcondities, of met een standaard PCR-protocol"xref"> 17.
      2. Voer het geamplificeerde cDNA op een 2% w / v agarosegel en breng de band met een DNA intercalerende kleurstof 17. Accijnzen de band die het amplicon met een schone scheermesje en plaats de gel stuk in een microcentrifugebuis.
      3. Zuiver het amplicon van de gel met een standaard extractieprocedure gel, zoals een agarase-gebaseerde extractie 17 of een spin-kolom gel extractie kit volgens de instructies van de fabrikant.
      4. Meet de concentratie van amplicon met een op fluorescentie gebaseerde kwantitatieve dsDNA kit volgens instructies van de fabrikant. Verdeel de gemeten concentratie dsDNA de bekende molecuulgewicht van het amplicon basis van het amplicon sequentie het aantal moleculen per amplicon pl verkrijgen.
      5. In een 2,0 ml laag-bindende microfugebuis, voeg 2 pl gezuiverde amplicon tot een volume van DNA suspensie buffer zodat de uiteindelijke concentratie ampLicon is 5 x 10 8 moleculen / ul.
    2. Wanneer alle amplicons zijn gezuiverd en gecombineerd 18 pi van elke gezuiverde amplicon in een 2,0 ml laag-bindende microcentrifugebuis. Voeg DNA suspensie buffer tot een totaal volume van 1800 gl maken; dus de concentratie van elke amplicon 5 x 10 6 moleculen / pl.
      LET OP: Dit mengsel, dat cDNA amplicons bevat van alle genen van belang in bekende equimolaire hoeveelheden, zal dienen als een standaard in de single-cell qPCR.
    3. Vortex deze "5E6" standaard grondig, centrifugeren gedurende 10 sec bij 2000 xg, en verdeel het in 20 ul fracties in low-bindende PCR-buizen. Bewaar de fracties bij -80 ° C.
  5. Bereid de specifieke doelgroep amplificatie (STA) primer mix (10x).
    1. In een 15 ml conische buis, combineer 25 pi van elk 100 uM stock primer (tot 192). Voeg DNA suspensie buffer tot een totaal volume van 5000 gl maken.
      Merk opconcentratie van elke primer in dit mengsel is 500 nM. Elke plaat van gesorteerde cellen zal 105,6 ul van deze primer mix gebruiken om prime het omgekeerde transcriptie en specifieke doelgroepen versterking. Het volume van de primer mix hier gegeven is genoeg om 45 platen te maken om te sorteren. Het is raadzaam om een ​​voldoende grote hoeveelheid primer mix zodat deze slechts eenmaal te worden; schaal volumes nodig.
    2. Meng goed door vortexen, te verdelen in 110 ul fracties en de fracties op te slaan bij -20 ° C.
  6. Bereid assay mengsels, één voor elk primerpaar voor gebruik in microfluïdische chip-gebaseerde qPCR.
    1. In elk putje van een 96-well PCR plaat, combineer 3,0 pl van de 100 pM forward primer voor een bepaald gen, 3,0 pl van de overeenkomstige 100 uM reverse primer, 24,0 pl DNA suspensie buffer en 30,0 pl 2x assay loading reagens .
    2. Vortex deze plaat rotatie gedurende 10 sec bij 500 xg en bewaar bij -20 ° C.
  7. Maak twee thermische cycli programma's: RTSTA (reverse transcriptie en specifieke doelgroep versterking; tabel 1) en EXOI (exonuclease I behandeling, tabel 2).

2. Behandeling

  1. De plaat zoogdiercellen op een weefselkweekschaal zodanig dat ze groeien tot de gewenste samenvloeiing op het moment van de behandeling, afhankelijk van de omstandigheden van het experimentele onderzoek. Voor de in dit onderzoek voorbeeld plate 4 x 10 5 MCF-7 p53-Venus cellen 18 per 6 cm schaaltje in RPMI met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine, en 250 ng / ml amfotericine B. Incubeer de cellen gedurende twee dagen bij 37 ° C met 5% CO2 totdat ze 50% confluentie bereiken.
  2. Behandel de cellen om de conditie van belang op basis van de experimentele studie vast. Voor de in dit onderzoek voorbeeld incubeer MCF-7-p53 Venus cellen met 400 ng / ml neocarzinostatine gedurende 3 uur, 8,5 uur, 14 uur of 24 uur.

3. Lysis Buffer Voorbereiding voor celsortering

NB: Het maken van een enkele plaat van lysisbuffer duurt ongeveer 1 uur. Het is raadzaam om te sorteren en meerdere platen, zoals celsortering inefficiënt kan zijn en leveren vele putjes zonder detecteerbare cel.

  1. Maak de bank, pipetten, buis rek, koude PCR-plaat houders, en handschoenen met DNA ontsmetting oplossing als voorbereiding op de PCR.
  2. Verdun de RNAse remmer 2,64 U / gl door het toevoegen van voorraad RNAse inhibitor om nuclease-vrij water in een 1,5 ml buis.
    Opmerking: Dit laat RNAse inhibitor de lysisbuffer toegevoegd zonder pipetteren sub-ul volumes.
  3. Voeg lysis buffer voor de cellen door combinatie van de in tabel 3 vermelde bestanddelen.
  4. Transfer 92,4 ul van de lysisbuffer van de cellen in een afzonderlijke buis; Dit zal de lysis buffer voor het amplicon normen.
  5. Met behulp van low-bindende pipetpunten en microcentrifugebuizen, bereiden 200 pl en 500 pl E. coli DNA verdund tot 3,1 pg / pl en 6,2 pg / pl respectievelijk met DNA suspensie buffer.
  6. Voeg 184,8 pi 3,1 pg / pl E. coli DNA aan de lysis buffer voor de cellen.
    OPMERKING: De E. coli DNA-drager dient om de omvang van niet-specifieke primer binding mogelijkheden verbreden en waardoor de waarschijnlijkheid dat primer dimerisatie leidt tot een PCR-product te verminderen.
  7. Bereid normen.
    1. Label zes low-bindend microcentrifugebuizen als 5e5, 5e4, ... 5e0.
    2. Voeg 90 pl DNA suspensie buffer van "5e5" tube.
    3. Voeg 90 ul van 6,2 pg / pl E. coli DNA aan elk van de vijf andere buizen. Houd alle buizen op ijs.
      OPMERKING: Integratie carrier DNA in de normen maakt de totale massa van DNA in de standaard putjes vergelijkbaar met die in de 1-cel wells; Dit vermindert de probability dat de concentratie van normen worden beïnvloed door DNA te binden aan buizen of pipetpunten.
    4. Neem een monster van het "5E6" standaard (5 x 10 6 moleculen / ul van elke amplicon, bereid in stap 1,4) uit opslag. Kort vortexen en spin kort (5 sec bij 500 xg), zodat de vloeistof op de bodem van de buis.
    5. Met behulp van een low-bindende pipet, voeg 10 ul van 5E6 norm aan de "5e5" tube. Vortex kort, rotatie (5 sec bij 500 xg), en zet de slang terug op het ijs.
    6. Pipet 10 ul van de "5e5" buis in de "5e4" tube. Vortex kort, rotatie (5 sec bij 500 xg), en weer op het ijs.
    7. Herhaal deze seriële verdunningen, waarbij elke buis ontvangt 10 gl van de vorige buis, totdat alle buizen een verdunning van standaard.
  8. Bereid een rij van 12 PCR buizen met doppen. Verdeel 67 ui "cel" lysis buffer aan elke buis. Cap de buizen en spin down kort (5s bij 500 xg) indien nodig.
  9. Met behulp van een 12-kanaals pipet, distribueren 9 pl "cel" lysisbuffer uit de rij van PCR buizen in elk putje van de eerste 7 rijen van een PCR-plaat (figuur 3).
  10. Verdeel 7 pl "standaard" lysis buffer aan elk putje van de laatste rij van de plaat (figuur 3).
  11. Door lage bindende pipetpunten, voeg 2 ul standaard aan elk putje van de onderste rij volgens de plaat kaart (Figuur 3).
    LET OP: 2 pi van 5 x 10 0 moleculen / ul norm bedraagt 10 moleculen, enz.
  12. Voeg 2 pl 3,1 pg / pl E. coli DNA in het 10-cellen en 100-cellen putjes; Voeg 2 pi 6,2 pg / pl E. coli DNA in de niet-celputjes.
    Opmerking: Elke 1-cel, 10-cellen en 100-cel en 6,2 pg E. coli DNA, benadert de massa van genomisch DNA in een menselijke cel. Elke standaard en no-cel en heeft 12,4 pg of E. coli DNA, ongeveer twee menselijke cellen waard.
  13. Dicht de plaat met een steriele thermische afdichting, rotatie gedurende 5 sec bij 500 xg en bewaar bij 4 ° C totdat de cellen klaar voor het sorteren.

4. Cell Sorter Setup

  1. Programmeer de fluorescentie geactiveerde cel sorteerder sorteren in een 96-wells plaat volgens de plaat kaart (Figuur 3); geen cellen worden gesorteerd in putten H1-H8 of H11-H12.
  2. Controleer of de cel sorter goed is gericht voor het sorteren in een PCR-plaat.
    1. Stel de hoek van het soort stroom zo gering mogelijk; Deze instelling vergroot de kans dat de cellen worden gesorteerd naar de bodem van putjes plaats raken de zijkanten.
    2. Om de machine te richten, te verzegelen een lege PCR-plaat en het gebruik van de test stroom op 'sort' druppels PBS op het zegel van de lege plaat, volgens de instructies van de machine 19; de druppels zal landen op the oppervlak van de afdichting op een positie boven het midden van de put. Voor het beste resultaat, controleert het doel over de lengte en de breedte van de plaat.
    3. Als de druppels niet te landen op de juiste plaats, veeg ze van het oppervlak van de afdichting, opnieuw te kalibreren de cel sorter volgens de instructies van de machinefabrikant, en herhaal tot de druppels in het soort stroom correct worden afgezet.

5. Cell Harvest en sorteren

  1. Trypsinize de cellen afhankelijk van de cellijn. Bijvoorbeeld, voor MCF-7 cellen, zuig het medium uit de cellen Spoel de cellen met 1 ml 0,05% trypsine en incubeer de cellen met 2 ml 0,05% trypsine gedurende 5 minuten bij 37 ° C en 5% CO 2 .
  2. Voeg 8 ml celkweekmedium de getrypsiniseerd cellen en de overdracht van alle 10 ml celsuspensie aan een 15 ml buis. Centrifugeer gedurende 4 min bij 400 x g.
  3. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in PBS + 2% FBS. <br /> LET OP: Een kleinere resuspensie volume concentreert de cellen en vergemakkelijkt celsortering; een 500 ul resuspensie volume werkt goed voor een 6 cm schaaltje cellen bij 50% confluentie.
  4. Breng de celsuspensie aan een 5 ml flowcytometrie buis pipetteren door een 40 urn filter om klompjes cellen te verwijderen.
  5. Centrifugeer de plaat lysisbuffer bij 400 g gedurende 30 seconden bij 4 ° C voor het sorteren van de cellen zodat de vloeistof op de bodem van de putjes.
  6. Plaats de buis met de celsuspensie in de cel sorteerder. Open de afdichting op de plaat lysisbuffer en zorgvuldig sorteren van de cellen van belang in de plaat volgens de plaat kaart en de instructies van de fabrikant celsorteerinrichting 19. Om ervoor te zorgen dat de afzonderlijke cellen worden gesorteerd op de maximale zuiverheid, voert u de machine in "single cell" mode en gebruik maken van standaard flowcytometrie venstertijd gebaseerd op voorwaartse en zijwaartse verstrooiing 19.
    LET OP: In devoorbeeldexperiment, poort de cellen op basis van p53-Venus fluorescentie isoleren helderste 15% van de individuele cellen 11.
  7. Verzegel de plaat met een nieuw, steriel thermische afdichting en centrifugeer bij 400 xg gedurende 1 min bij 4 ° C. Plaats de plaat in de thermische cycler en voer het RTSTA programma (zie stap 1.7).
    LET OP: Deze voert reverse transcriptie van het mRNA uit de gesorteerde cellen en versterkt het cDNA van de transcripten van belang.

6. exonucleasebehandeling

  1. Meng verdund exonuclease I combineren van de in tabel 4 vermelde bestanddelen. Bereid een rij van 12 PCR buizen met doppen. Verdeel 30,5 ul van verdunde exonuclease I in elke buis. Cap de buizen en spin kort (5 sec bij 500 xg), zodat de vloeistof op de bodem van de buis.
  2. Wanneer de RTSTA klaar is, draai het monster plaat gedurende 5 sec bij 500 x g. Met behulp van een 12-kanaals pipet, distribueren 3,6 gl verdunde exonucleaseIk in elk putje van de plaat.
  3. Sluit de plaat met een steriele thermische afdichting en draai kort (5 sec bij 500 xg). Plaats de plaat in de thermische cycler en voer het EXOI programma (zie stap 1.7).
    OPMERKING: Deze stap degradeert elke primers overblijft na een specifieke doelgroep versterking, zodat ze niet zal bemoeien met de toekomstige PCR.

7. Monsterverdunning

  1. Wanneer de exonuclease behandeling is voltooid, voeg 32,4 ul TE-buffer aan elk putje van de monsterplaat; Dit is een optionele stopplaats, en samples gedurende enkele dagen bewaard bij -20 ° C.

8. Sort Quality Control Met behulp van qPCR

Opmerking Omdat celsortering niet perfect efficiënt Deze stap is noodzakelijk om te bepalen welke putjes van de plaat gesorteerde eigenlijk een cel ontvangen. Deze monsters kunnen dan worden gebruikt voor verdere analyse.

  1. Meet de huishouding genexpressie in elk monster door qPCR.
  2. Bereid 900 pi DNA bindende kleurstof qPCR master mix voor 96 reacties volgens het protocol gebruik van primers van de polymerase fabrikant voor een van de housekeeping genen geselecteerd in stap 1.1; de exacte concentratie reactiebuffer, polymerase, primers, enz. Voor deze omzetting is afhankelijk van de specifieke gebruikte polymerase.
  3. Verdeel 9 pi master mix aan elk putje van een 96-well PCR-plaat. Voeg 1 pl monster van de monsterplaat het overeenkomstige putje van de PCR-plaat.
  4. Voer de plaat op een real-time PCR machine met behulp van een thermische cycli protocol door de fabrikant master mix voorgesteld of volgens een standaard protocol 20.
  • Analyseer de qPCR gegevens 20; Een voorbeeld van qPCR data van het soort kwaliteitscontrole stappen hieronder wordt getoond in figuur 4.
    1. Controleer of de metingen van de no-cel putten vertonen een laag (achtergrond) niveauvan genexpressie of geen expressie helemaal.
    2. Controleer of metingen van 1-cel putjes verdelen duidelijk in twee groepen: positieve monsters met hoge genexpressie en negatieve monsters met achtergrondniveaus van expressie of geen expressie helemaal, vergelijkbaar met de niet-celputjes.
      LET OP: De monsters met een hoge genexpressie vertegenwoordigen werkelijke gesorteerde cellen; mensen met een achtergrond expressie moeten worden uitgesloten van verdere analyse.
    3. Controleer of metingen van de 10-cellen en 100-cellen putjes tijdens genexpressie hoger dan in de positieve wells 1-cel, waardoor de mogelijkheid dat inefficiënte sortering kunnen veroorzaken die putten minder cellen dan gewenst.
    4. Controleer dat de metingen van de standaard putten gelijkmatig verdeeld zijn in logaritmische ruimte (dat wil zeggen, dat de C t waarde gelijkelijk verdeeld zijn).
  • Na het identificeren van alle positieve 1-cel monsters, maak een "Sample Mixes" plaat kaart om positieve 1-ce kaartll monsters naar een nieuwe 96-well plaat. Bestaat uit acht putten voor normen op deze plaat kaart. Zie figuur 5 voor een voorbeeld.
  • 9. Gene Expression meting met behulp van microfluïdische qPCR

    LET OP: Voor elke stap in deze sectie, pipet alleen voor de eerste stop om de vorming van bellen in de reagentia te minimaliseren.

    1. Open een rij van 8 buisjes PCR. Als er meerdere platen van de monsters, het openen van een tweede rij van 8 PCR-buizen en label de buizen 1-8. Deze rij zal zijn voor het bundelen van de normen van meerdere platen.
    2. In een 1,5 ml tube, meng 360 pi van DNA-bindende kleurstof qPCR master mix met 36 ul van DNA-bindende kleurstof monster laden reagens. Vortex kort en draaien voor 10 sec bij 2.000 x g. Verdeel het mengsel (396 pi) in de ongelabelde PCR rij van 8 buisjes, plaatsen 48 pl in elke buis.
    3. Onder toepassing van een 8-kanaals pipet, verdelen 3,3 ul van de master mix / monster laden reactiemengsel in elk putjevan een nieuwe 96-well PCR plaat. Label deze plaat, "Sample Mixes."
    4. Voor elke PCR plaat monsters:
      1. Vortex de plaat gedurende 10 sec en centrifugeren gedurende 10 sec bij 500 x g. Verwijder het deksel en breng 2,7 pi van elke positieve 1-cel monster de bijbehorende goed op de Sample Mixen plaat voor de 1-cel putten aangegeven op het bord kaart.
      2. Als er slechts één plaat van monsters, overdracht 2,7 pi van elke geamplificeerde standaard zijn corresponderende goed op Sample mixt Bevestigingsplaat volgens de plaat kaart.
      3. Als er meerdere platen monsters, overdracht 2,7 pi van elke geamplificeerde standaard zijn overeenkomstige positie in de rij gelabelde PCR buizen. standaarden toe te voegen van de huidige plaat van monsters aan alle normen er al. Seal de plaat van de monsters bij gedaan met behulp van een afsluitende film.
    5. Als er meerdere borden van monsters:
      1. Vortex de rij van PCR-buisjes met normen voor10 sec en draaien voor 10 sec bij 2.000 x g. Transfer 2,7 pi van elke buis van gemengde normen in de overeenkomstige goed op de Sample Mixen plaat volgens de plaat kaart.
    6. Laad de NTC putten met 2,7 ul van nuclease-vrij water, waar aangegeven op het bord kaart. Sluit de Sample Mixen plaat en bewaar bij 4 ° C totdat het nodig is.
    7. Schil de sticker van de bodem van een nieuwe microfluïdische chip qPCR. Met behulp van een injectiespuit van de controle lijn vloeistof met de dop nog op, duw elke accumulator voorjaar om het los te maken, en injecteer elke accumulator met 150-200 ul van controle lijn vloeistof.
    8. Plaats de chip in het laden machine en voer de "Prime" script. Dit duurt ~ 20 minuten.
    9. Wanneer priming wordt gedaan, vortex en spin down de platen van assay mixen (bereid in stap 1.6) en sample mixen.
    10. Onder toepassing van een 8-kanaals pipet 4,5 ul van elk testmengsel in de linkerkant van de microfluïdische chip qPCR volgens het schema in g> Figure 6. Pipet zeer zorgvuldig te voorkomen dat luchtbellen onder aan de putjes. Wanneer u klaar bent, sluit de plaat van assay mixen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik.
    11. Transfer 4,5 pi van elk monster mengsel naar de rechterkant van de microfluïdische chip qPCR volgens figuur 6. Plaats de chip in de laden machine en voer de "Laad Mix" script. Dit duurt ~ 90 minuten.
    12. Schakel de microfluïdische real-time PCR machine, start het verzamelen van gegevens software, en zet de lamp om het op te warmen. Dit duurt ~ 20 minuten.
    13. Wanneer de belasting Mix script wordt uitgevoerd, controleert u of er geen lijnen over de chip-dit zou een laad probleem aan te geven. Verwijder zorgvuldig eventuele stofdeeltjes uit de chip met behulp van Scotch tape of lab tape. Plaats de chip in de microfluïdische real-time PCR-machine en voer het verzamelen van gegevens script. Gebruik de analyse software om de resultaten te inspecteren en de gegevens exporteren voor verdere analyse.
    _title "> 10. Gegevensanalyse

    1. Verwijder de metingen waarvoor de qPCR amplificatie curven slechte kwaliteit (dat wil zeggen, waarbij de curven niet de standaard sigmoïdale amplificatiecurve lijken) 20.
    2. Verwijderen monsters met meer dan 30 slechte kwaliteit of nul metingen of waarvoor housekeeping genexpressie (zie stap 1,1) veel lager is dan de meeste andere monsters (Figuur 7).
    3. Voor elk gen, schat de juiste smeltpiek locatie als de mediaan van de smelt pieklocaties uit elk monster. Als een meting heeft een smelt piek op meer dan 1 ° C van de mediaan, verwijder die meting uit overweging 20.
    4. Voor elk gen, het creëren van een standaard curve aan het mRNA telling in elk monster met behulp van een spreadsheet of scripttaal 20 te schatten.
      OPMERKING: De normen in dit experiment uit 10, 100, 1000 of 10.000 moleculendsDNA overeenkomt met elk transcript plaats. Als reverse transcriptie perfect efficiënt waren, zou de normen overeenkomen met 20, 200, 2000 en 20.000 moleculen mRNA, aangezien mRNA en cDNA enkelstrengs. In de praktijk is dit niet het geval, dus uitdrukken metingen een schatting in eenheden van moleculen x E RT, waarbij RT E is de efficiëntie van reverse transcriptie.
      1. Voor elke standaard en identificeren m, het aantal moleculen van ssDNA (tweemaal het aantal moleculen dsDNA) voor amplificatie (bijvoorbeeld 20 moleculen, 200 moleculen, etc.).
      2. Voor elke standaard goed, identificeren van de C t-waarde van qPCR 20.
      3. Met de waarden van m en t C, uitvoeren van een lineaire regressie met behulp van de volgende vergelijking met een standaard kromme met parameters a en b voor elk gen te genereren en bepaal de R2 waarde alsn indicator van de goedheid van fit:
        vergelijking 1
      4. Van de standaard curve, bereken de PCR efficiëntie E voor elk gen:
        vergelijking 2
        OPMERKING: De waarde E veel groter is dan 1,0 (bijvoorbeeld E> 1,1) is niet fysiek realistisch; een R2 waarde voor de lineaire regressie minder dan 1,0 (bijvoorbeeld, R 2 <0,985) betekent dat de normen niet betrouwbaar werken. Deze problemen algemeen aan dat de laagste amplicon standaard onder een drempel van betrouwbare kwantificering, en dus moeten de laagste standaard uit de lineaire regressie worden uitgesloten. Wanneer een bevredigende lineaire regressie niet mogelijk is met ten minste drie unieke normen, gooi de expressiemetingen voor het gen.
      5. Als de lineaire regressie voldoende Gebruik de resulterende fit parameters a en b </ em> voor elk gen van het aantal mRNA moleculen schatten m est (in eenheden van moleculen x E RT) van het overeenkomstige gen in elke eencellige monster uit de gemeten Ct waarde:
        vergelijking 3
      6. Wijs een meting m est <1 als m est = 0. Ook wijzen een meting zonder versterking in qPCR en dus geen C t waarde m est = 0.
        OPMERKING: Metingen met m est lager dan de laagste of groter dan de hoogste norm in de regressie worden gevonden door extrapolatie van de standaardkromme. Deze schattingen zijn niet noodzakelijkerwijs ongeldig, maar moet met de nodige voorzichtigheid worden beschouwd.
    5. Visualiseer de single-cell genexpressie data.
      1. Maak een beeswarm perceel (Dorn, J. en de Heilige, T., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange / 37105) waarin elk punt is de genexpressie in een bepaalde cel; Een voorbeeld is getoond in figuur 8.
      2. Voeg een viool perceel (Dorn, J., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/23661) waarin de breedte van de "viool" geeft de frequentie van expressiemetingen rond een bepaald niveau in de populatie cellen geanalyseerd; Een voorbeeld is getoond in figuur 8.
        OPMERKING: Meer geavanceerde analyse kunnen de verhoudingen in expressie tussen sonde genenparen 21, 22 en kan genexpressie netwerken afleiden.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Een algemeen overzicht van het protocol wordt weergegeven in figuur 1, inclusief stappen voor celtherapie, het isoleren van afzonderlijke cellen door FACS, het genereren en pre-amplificatie van cDNA-bibliotheken van eencellige lysaten, de bevestiging van eencellige cDNA bibliotheken gesorteerde putten, en de meting van genexpressie door qPCR.

    Ter voorbereiding van eencellige isolatie en genexpressie-analyse, is het noodzakelijk om eerst identificeren geldige oligonucleotide primerparen voor elk doelwitgen van belang. Figuur 2 toont twee voorbeelden van primer kwaliteitsmethodieken. Smelt curven gegenereerd na qPCR met het primerpaar getest. Geldige primers resulteert in een smelt curve een enkele piek (figuur 2A, groene curve). Als meerdere pieken (Figuur 2A, blauwe lijn), of een curve met een duidelijke schouder (Figure 2A, red curve) aanwezig zijn, geeft dit de aanwezigheid van meerdere PCR producten en de primers moeten worden herzien. Als tweede kwaliteitscontrole methode kan agarose gelelektroforese worden gebruikt om visueel te verifiëren dat een enkele band van de juiste afmeting aanwezige elk primerpaar getest (figuur 2B) is. Meerdere banden of banden van de verkeerde maat aangeven dat de primers niet geldig (figuur 2B).

    Na primer validatie en het genereren van bibliotheken van qPCR normen van de juiste amplicons, kan celsortering worden uitgevoerd. Een voorbeeld sorteerschema is in figuur 3. Elke gesorteerde plaat moet bevatten putjes die een verdunningsreeks van amplicon normen, 10, 100, 1000 of 10.000 kopieën van elk doelwit amplicon. Het wordt ook aanbevolen om putjes waarin geen cellen, 10 cellen of 100-cellen worden gesorteerd, naast de eencellige putjes omvatten.Door sorteren inefficiëntie, is het vaak nodig om de putjes van de plaat waarin de afzonderlijke cellen met succes zijn gedeponeerd identificeren. Hiervoor validatiestap, volgens de procedure voor reverse transcriptie en amplificatie specifiek doel dienen qPCR worden uitgevoerd om de expressie van een huishoudgen (figuur 4) te meten. De putjes van de amplicon normen (Figuur 4, zwarte curves) wordt gelijkmatig verdeeld amplificatie curven. (; Rode curves figuur 4), "10-cell" putjes (Figuur 4, blauwe curves), en "100-cell" putjes (figuur 4 er ook duidelijke scheiding in de bochten die overeenkomt met de "no-cell" wells ; paars curves). Een duidelijke scheiding moet ook gebeurt om de "1-cel" putten overeenkomend met succesvolle cel depositie (figuur 4 en groen amplificatiecurves met Ct-waarden lager dan die van de niet-celcontroles maar greater dan die voor de 10-celcontroles) versus ongelijk cell deposition (figuur 4 en groen bochten met Ct-waarden dichtbij die van de niet-celcontroles). Zodra putjes met een cellysaat zijn geïdentificeerd, kunnen cDNA uit de putjes (eventueel uit meerdere platen) worden overgebracht naar een microfluïdische chip qPCR, met een enkele-cellysaat per putje. Bijvoorbeeld, Figuur 5 toont een hypothetische matrix die cDNA combinatie van enkelvoudige cellen uit drie verschillende gesorteerd 96-well platen tot één nieuwe plaat voor qPCR analyse.

    Om de microfluïdische qPCR resultaten te analyseren, moeten de monsters die waarschijnlijk geen cellen ontvingen eerst worden verwijderd, zoals door veel ontbrekende of nul expressiemetingen (Figuur 7, rijen met pijlen) of ongebruikelijk lage housekeeping genexpressie. Voor elke test, de metingen met smelt pieken die niet overeenkomen met die van de eedr monsters in dezelfde test moeten worden verwijderd. Na het verwijderen van slechte monsters en metingen, kunnen lineaire regressie uitgevoerd op de afmetingen overeenkomen met de amplicon normen de absolute telling van elk transcript plaats in elke eencellige monster te schatten. Figuur 8 toont een visualisatie van deze genexpressie schattingen, gemeten in eenheden van moleculen × reverse transcriptie efficiëntie, beeswarm en viool plots. In dit voorbeeld behandelde cellen een groot aantal CDKN1A expressieniveaus met vele cellen niet tot expressie CDKN1A helemaal en anderen expressie van het gen in gehalten spanning twee orden van grootte. Na behandeling met neocarzinostatine (NCS) gedurende 3 uur, de meeste cellen brengen CDKN1A op veel hogere niveaus, en de variabiliteit afneemt tot ongeveer één orde van grootte. Aangezien de duur van de behandeling toeneemt, het gemiddelde niveau van CDKN1A expressie afneemt en de variabiliteit in uitdrukking uitbreidt.

    Figuur 1
    Figuur 1: Overzicht van de stappen in eencellige genexpressieprofilering. Behandelde cellen worden geoogst en gesorteerd via FACS direct in lysisbuffer. mRNA van belang zijnde species wordt reverse getranscribeerd en het resulterende cDNA wordt geamplificeerd door PCR. Housekeeping genexpressie in elk monster wordt gemeten door qPCR te bepalen welke monsters eigenlijk een cel ontvangen. In monsters passeren van deze kwaliteit-controletest, wordt de expressie van maximaal 96 genen gemeten met microfluïdische qPCR. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van een eerdere publicatie 11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    19 / 55219fig2.jpg "/>
    Figuur 2: Voorbeeld resultaten primer testen. (A) Smelt curven van qPCR. De blauwe smelt curve (TNFRSF10D) meerdere pieken en de rode smelt curve (TRIM22) een "schouder", hetgeen een tweede piek dichtbij de eerste piek. Daaruit blijkt dat de in die reacties primers amplificeren meerdere doelen en moeten worden herzien. De groene smelt curve (SCN3B) een enkele piek, in overeenstemming met primers die een enkel doel amplificeren. (B) Amplified DNA run op een agarosegel. De rijstroken voor SCN3B, TRIM22 en TRPM2 bevatten meerdere bands; het gebruikt om die DNA amplicons maken primers versterken meerdere doelen en moeten worden vernieuwd. De rijstrook voor TNFRSF10D heeft een enkele band, in overeenstemming met primers die een enkel doel te versterken. Het is vermeldenswaard dat de primers voor SCN3B passeren van de smelt curve test, maar niet de gel test, terwijl die voor TNFRSF10D passeren de gel test, maar niet de smelt curvetest; deze twee methoden van primer validatie zijn complementair. In dit voorbeeld kan men concluderen dat alle vier primersets moeten worden herzien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 3
    Figuur 3: Plaat kaart voor celsortering. Deze plaat kaart inclusief 1-cell wells (rood), 10- en 100-cell wells (donkerder rood), normen (groen), en no-cell wells (wit). Waaronder twee replicaten van elke standaard op elke plaat helpt om te compenseren voor variatie in normen. Waaronder 10-cel en 100-cell wells is nuttig als een sanity check voor genexpressie. De niet-celputjes dienen als een negatieve controle. Klik hier om een grotere versie van t bekijkenzijn figuur.

    figuur 4
    Figuur 4: Voorbeeld van qPCR amplificatie curves van soort kwaliteitscontrole meten GAPDH expressie. No-cel monsters (rood) laten een achtergrond niveau van expressie. 1-cel monsters (groen) verdelen in twee verschillende groepen, één met hoge expressie en één met lage expressie vergelijkbaar met de no-cel monsters. De high-expressie monsters hoogstwaarschijnlijk kreeg een echte cel tijdens het sorteren; de low-expressie monsters deed waarschijnlijk niet. 10-cel (blauw) en 100-cel (paars) monsters vertonen hogere expressie dan de 1-cel monsters; de 10-celmonsters dicht bij de hoogste tot expressie 1-celmonsters vanwege soort inefficiëntie. Standaarden (zwart) gelijkmatig verdeeld, zoals verwacht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. </ P>

    figuur 5
    Figuur 5: Voorbeeld van Monster Mixes plaat kaart. Deze plaat kaart inclusief 1-cel monsters uit drie verschillende platen (rijen AG), normen gemengd uit alle drie platen (H1-H8), no-cel-controles (H9-H10), en no-template regelaars voor qPCR (H11-H12 ). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 6
    Figuur 6: Schematische weergave van microfluïdische chip qPCR met de volgorde van lading (1, 2, 3 ...). De inkeping (A1) is de linker bovenhoek van de plaat. Klik hier om een grotere versie van thi bekijkens figuur.

    figuur 7
    Figuur 7: Heat kaart van de qPCR resultaten. Elke rij staat voor een 1-cel monster, standaard of controle; elke kolom vertegenwoordigt een gemeten transcript. Rijen met een ongebruikelijk aantal zwarte vierkanten of Xs (pijlen) waarschijnlijk geven monsters die niet een echte cel heeft ontvangen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 8
    Figuur 8: Beeswarm en viool percelen. In een beeswarm perceel (blauwe punten), elk punt vertegenwoordigt genexpressie in een bepaalde cel. In een viool perceel (grijze vorm), de breedte van de "viool" geeft de frequentie van genexpressie measusingen rond een bepaald niveau in de populatie van cellen geanalyseerd. Licht blauwe balken geven de laagste norm. Metingen boven de blauwe balken worden geïnterpoleerd tussen de normen, terwijl metingen binnen de blauwe balken worden geëxtrapoleerd. De hier vermelde gegevens zijn de afmetingen van CDKN1A expressie in MCF-7 cellen die Venus-gelabeld p53 behandeld met neocarzinostatine (NCS) gedurende de aangegeven tijden om DNA dubbelstrengige breuken induceren. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van de vorige publicatie 11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Staat Temperatuur Tijd
    Houden 50 ° C 15 minuten
    Houden 95 ° C 2 minuten
    20 cycli 95 ° C 15 sec
    60 ° C 4 min
    Houden 4 ° C

    Tabel 1: Reverse transcriptie en specifieke doelgroepen amplificatie (RTSTA) thermische cycli programma.

    Staat Temperatuur Tijd
    Houden 37 ° C 30 minuten
    Houden 80 ° C 15 minuten
    Houden 4 ° C

    Tabel 2: exonuclease I behandeling (EXOI) thermische cycli programma.

    bestanddeel Volume / goed (pl) 96 volumes w / 10% overmaat (pl)
    2x reactiemengsel 5.00 528.00
    Reverse transcriptase / polymerase mengsel 0.20 21.12
    10x STA Primer Mix 1.00 105,60
    2,64 U / pl (verdund) RNAse inhibitor 0.02 2.00
    Nuclease-vrij water 0.78 82,48
    Totaal 7.00 739,20

    Tabel 3: Componenten van de lysis buffer voor de cellen.

    bestanddeel Volume / goed (pl) 96 volumes w / 10% overmaat (pl)
    Nuclease-vrij water 2.52 266.00
    Exonuclease I Reaction Buffer (10x) 0.36 38.00
    Exonuclease I (20 U / pl) 0.72 76.00
    Totaal 3.60 380.00

    Tabel 4: Onderdelen van de exonuclease mengen om de versterkte cDNA monsters te behandelen.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    We hebben voorgesteld een werkwijze voor het isoleren van afzonderlijke zoogdiercellen van een populatie van hechtende cellen gekweekt in kweek en voor het testen van de expressie van ongeveer 96 genen in elke cel. Goede voorbereiding vooraf is essentieel voor deze methode goed te werken. Vooral ontwikkelen en testen primerparen die specifiek zijn voor de transcripten van belang (stap 1,2-1,3) tijdrovend maar belangrijke stappen, zoals de primers bepaalt de kwaliteit van de eencellige metingen. Zodra betrouwbare primerparen zijn verkregen, worden ze gebruikt om cDNA te versterken van de transcripties van belang; de amplicons worden vervolgens gecombineerd in equimolaire hoeveelheden aan de normen (stap 1.4) te maken. Deze stap is essentieel, aangezien de eisen worden gesteld aan de absolute tellingen transcript schatten; normen moeten een keer worden gemaakt, in porties verdeeld, en wordt gebruikt voor alle volgende ronden van celsortering en genexpressie metingen. Ook op de dag dat de cellen gesorteerd, is het vooral important aan de normen voorzichtig met low-bindend pipet tips en microcentrifugebuizen bij het maken van platen van lysisbuffer (stappen 3.7 en 3.11) te verdunnen. Het streven van de cel sorter (stap 4.2) is een cruciale stap; Dit moet voorzichtig gebeuren zodat de cellen met succes het doel van 9 ul lysisbuffer hit in een PCR-plaat.

    Er zijn verscheidene aanpassingen aan het protocol dat kan worden gemaakt aan te passen aan diverse behoeften aan onderzoek. Hier hebben we ons gericht op een DNA-bindende kleurstof gebaseerde qPCR aanpak, die een relatief betaalbare methode voor het kwantificeren van genexpressie biedt. Deze werkwijze heeft het potentieel tot een hoog achtergrondsignaal, aangezien elke geamplificeerde DNA, zelfs van off-doelsequenties, resulteert in een fluorescent signaal. Dergelijke achtergrond kan worden geminimaliseerd door te verzekeren dat het primerpaar gebruikt om een specifiek doel te amplificeren levert een smelt kromme met een enkele piek en een PCR-product van de correcte grootte (figuur 2). Als de achtergrond nog steeds zorgen na het gebruik van dergelijke kwaliteitscontrole methoden kunnen probes gebaseerde qPCR techniek onderzocht worden off-target detectie minimaliseren, zij het in een grotere kosten van de reagentia. Een andere optie zou geneste PCR benadering, waarbij een stel primers wordt gebruikt in de RTSTA stap reverse transcriberen en amplificeren een groot gebied van het transcript en een tweede set primers, waarbij een kleiner gebied opgenomen in dat grote regio versterkt worden wordt gebruikt om genexpressie door qPCR. Deze benadering is aangetoond dat het specifieke DNA bindende kleurstof gebaseerde qPCR 23 verbeteren.

    Verscheidene werkwijzen zijn beschikbaar voor het isoleren van individuele cellen voor genexpressie analyse. De keuze van celisolatie is afhankelijk van verschillende factoren, waaronder de beschikbaarheid van apparatuur (bijvoorbeeld een fluorescentie geactiveerde cel sorteerder), de bron van de cellen te evalueren (zoals vaste cellijnen versus primaire cellen van een weefsel), ofde snelheid waarmee de cellen moeten worden geïsoleerd. In de in dit protocol voorbeeld, gebruikten we FACS van een cellijn die een duidelijk waarneembare fluorescent-gelabeld eiwit. FACS heeft de voordelen van de zeldzame cel detectiemogelijkheden en relatief snelle cel isolement. Een probleem van deze methode is dat de afzetting van de cellen van belang in de vereiste kleine hoeveelheid lysis buffer in een 96-well PCR plaat inefficiënt kan zijn en het optimaliseren van de celsortering geometrie vereist een succesvolle ontkoppeling. Alternatieve benaderingen die kunnen leiden tot een grotere nauwkeurigheid in celisolatie bij lagere snelheden en / of hoger omvatten de micropipetteren van individuele cellen, de laser capture microdissectie van specifieke cellen van een tumor monster, of het gebruik van microfluïdische systemen (bijvoorbeeld de Fluidigm C1 systeem).

    Een groot voordeel van de hier beschreven protocol is dat de interne controle, een verdunningsreeks van gezuiverde PCR amplicons, e Nable de schatting van het absolute aantal van elke transcript in elke cel. Zonder deze normen kunnen alleen relatieve niveaus van genexpressie te verkrijgen gebaseerd op berekeningen verkregen uit de Ct-waarden. Echter, met deze normen, absolute transcript tellingen kan worden geschat, bij voorkeur door middel van interpolatie binnen het bereik van nauwkeurig gekwantificeerde amplicon normen (figuur 8). Zoals bij elke PCR-methode van genexpressie kwantificering nauwkeurige absolute kwantificatie vereist kennis van de efficiëntie van elk proces, met inbegrip van omgekeerde transcriptie.

    Een actueel probleem bij het kwantificeren transcript niveaus in individuele cellen is dat de detectielimiet voor vele methoden wordt geschat op 10-100 mRNA per cel 24 zijn, waardoor de betrouwbare kwantificatie van een significant percentage van de transcriptoom. Als alternatieve benadering kan men smRNA FISH om doelen van bijzonder belang kwantificerenass = "xref"> 25, 26, waaronder die met zeer weinig transcripten. Vooruitgang in smRNA FISH is het aantal verschillende transcripten die tegelijk 27 kunnen worden gedetecteerd en het aantal cellen die kunnen worden geprofileerd in een keer 28, met de juiste apparatuur uitgebreid. Hoewel smRNA vis heeft zijn eigen beperkingen (potentieel vals-positieve en vals-negatieve transcript detectie beperkingen slechts enkele doelgenen per cel, de kosten van apparatuur en reagentia), kan een krachtige werkwijze aan te vullen en te valideren resultaten van een qPCR-gebaseerde analyse van een subset van doelgenen van belang.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    We willen graag bedanken V. Kapoor in de CCR ETIB Flow Cytometry Core voor haar hulp bij het uitvoeren van de cel sortering tijdens de ontwikkeling van dit protocol. We danken ook M. Raffeld en de CCR LP Moleculaire Diagnostiek Unit en J. Zhu en de NHLBI DNA Sequencing and Genomics Core voor hun hulp bij het uitvoeren van de qPCR tijdens de ontwikkeling van dit protocol. Dit onderzoek werd ondersteund door de Intramurale Program van de NIH.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134
    High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor ThermoFisher 4374966
    Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0530S
    QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
    Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit ThermoFisher Q33120 
    2.0 ml low adhesion microcentrifuge tubes USA Scientific 1420-2600
    DNA Suspension Buffer Teknova T0221
    Axygen 0.2 ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes Corning PCR-02-L-C
    GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit Fluidigm 100-3415
    HyClone RPMI 1640 media GE Healthcare Life Sciences SH30027.01
    Fetal Bovine Serum, Certified (US) ThermoFisher 16000-044
    Antibiotic-Antimycotic Solution Corning 30-004-CI
    Neocarzinostatin Sigma N9162
    ELIMINase Decon Labs 1101
    SUPERase-In ThermoFisher AM2696
    CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher 11753500
    E. coli DNA Affymetrix 14380 10 MG
    ThermalSeal Sealing Film, Sterile Excel Scientific STR-THER-PLT
    BD FACSAria IIu BD Biosciences
    HyClone Trypsin 0.05% GE Healthcare Life Sciences SH30236.01
    PBS, 1x Corning 21-040-CV
    Falcon 40 µm Cell Strainer Corning 352340
    Exonuclease I New England BioLabs M0293S
    SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX Bio-Rad 172-5210
    96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) Fluidigm BMK-M-96.96
    IFC Controller HX (loading machine) Fluidigm
    BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) Fluidigm
    Real-Time PCR Analysis software  Fluidigm
    MATLAB software MathWorks

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321, (5892), 1081-1084 (2008).
    2. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459, (7245), 428-432 (2009).
    3. Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. Oscillations and variability in the p53 system. Mol. Syst. Biol. 2, (1), (2006).
    4. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437, (7059), 699-706 (2005).
    5. Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria. Cell. 158, (2), 314-326 (2014).
    6. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biol. 4, (10), e309+ (2006).
    7. Senecal, A., Munsky, B., et al. Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts. Cell Rep. 8, (1), 75-83 (2014).
    8. Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci. Mol. Syst. Biol. 11, (5), 806+ (2015).
    9. Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, (43), 17454-17459 (2012).
    10. Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167, (1), 523-530 (2004).
    11. Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks. Cell Syst. 2, (4), 272-282 (2016).
    12. Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells. Nat. Genet. 36, (2), 147-150 (2004).
    13. Levine, A. J., Oren, M. The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat. Rev. Cancer. 9, (10), 749-758 (2009).
    14. Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, (5), 402-412 (2008).
    15. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinf. 13, (1), 134 (2012).
    16. PCR Technologies: A Technical Guide. Sigma-Aldrich. St. Louis, MO. (2014).
    17. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
    18. Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage. Mol. Cell. 30, (3), 277-289 (2008).
    19. Flow Cytometry: Principles and Applications. Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
    20. Real-time PCR. Taylor & Francis. (2006).
    21. Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices. BMC Bioinf. 13, (1), 328 (2012).
    22. Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context. BMC Bioinf. 7, (Suppl 1), (2006).
    23. Haff, L. A. Improved quantitative PCR using nested primers. PCR Methods Appl. 3, (6), 332-337 (1994).
    24. Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biol. 17, 77 (2016).
    25. Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073 (2012).
    26. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, (10), 877-879 (2008).
    27. Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nat. Methods. 9, (7), 743-748 (2012).
    28. Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nat. Methods. 10, (11), 1127-1133 (2013).
    Eencellige Gene Expression Profiling Met behulp van FACS en qPCR met interne standaarden
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Porter, J. R., Telford, W. G., Batchelor, E. Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards. J. Vis. Exp. (120), e55219, doi:10.3791/55219 (2017).More

    Porter, J. R., Telford, W. G., Batchelor, E. Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards. J. Vis. Exp. (120), e55219, doi:10.3791/55219 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter