We beschrijven een methode om enkele zoogdiercellen te sorteren en om de expressie van maximaal 96 doelgenen van belang in elke cel te kwantificeren. Deze methode omvat het gebruik van interne qPCR-standaarden om de schatting van absolute transcripttellingen mogelijk te maken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Eencellige Gene Expression Profiling Met behulp van FACS en qPCR met interne standaarden
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Meetingen van genexpressie van bulkpopulaties van cellen kunnen de aanzienlijke transcriptomische variatie van individuele cellen binnen die populaties verdoezelen. Metingen van genexpressie op enkele cellen kunnen helpen bij het beoordelen van de rol van ruis in genexpressie, het identificeren van correlaties in de expressie van paar genen en het onthullen van subpopulaties van cellen die anders reageren op een stimulus. Hier beschrijven we een procedure om de expressie van maximaal 96 genen te meten in enkele zoogdiercellen die zijn geïsoleerd uit een populatie die groeit in weefselkweek. Cellen worden door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) gesorteerd in lysebuffer, en de mRNA-soorten van belang worden reverse-getranscripteerd en geamplificeerd. Genexpressie wordt vervolgens gemeten met behulp van een microfluïdische real-time PCR-machine, die maximaal 96 qPCR-assays uitvoert op maximaal 96 monsters tegelijk. We beschrijven ook het genereren en gebruik van PCR-ampliconstandaarden om de schatting van het absolute aantal van elk transcript mogelijk te maken. In vergelijking met andere methoden om genexpressie in enkele cellen te meten, maakt deze aanpak de kwantificering van meer verschillende transcripten mogelijk dan RNA FISH tegen een lagere kostprijs dan RNA-Seq.
Inleiding
Afzonderlijke cellen in een populatie kan sterk verschillende reacties op een uniforme fysiologische stimulus 1, 2, 3, 4 vertonen. De genetische variatie van cellen in een populatie is één mechanisme voor deze verschillende reacties, maar er zijn ook een aantal niet-genetische factoren die de variabiliteit van de reacties kan verhogen, zelfs in een klonale populatie van cellen. Bijvoorbeeld kan de hoeveelheid melk eiwitten en andere belangrijke signaalmoleculen afhankelijk van een cel per cel basis, hetgeen leidt tot variatie in stroomafwaa....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Advance Voorbereiding
- Selecteer tot 96 genen van belang waarvan de expressie zal worden gemeten.
OPMERKING: Ten minste één van deze genen zou een "huishoud gen" zoals ACTB of GAPDH, dat bekend is tot expressie op een betrekkelijk hoog en constant niveau onder de in het experimentele omstandigheden. Dit gen wordt gebruikt om positief gesorteerd putjes (stap 8,1) en geamplificeerde monsters (stap 10.1) te identificeren.
OPMERKING: Bij het voorbeeld experiment goed gekarakteriseerd, directe doelwit van p53 met allerlei gekende functies 11, 14 en GAPDH als een housekeeping controle wer....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een algemeen overzicht van het protocol wordt weergegeven in figuur 1, inclusief stappen voor celtherapie, het isoleren van afzonderlijke cellen door FACS, het genereren en pre-amplificatie van cDNA-bibliotheken van eencellige lysaten, de bevestiging van eencellige cDNA bibliotheken gesorteerde putten, en de meting van genexpressie door qPCR.
Ter voorbereiding van eencellige isolatie en genexpressie-analyse, i.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We hebben voorgesteld een werkwijze voor het isoleren van afzonderlijke zoogdiercellen van een populatie van hechtende cellen gekweekt in kweek en voor het testen van de expressie van ongeveer 96 genen in elke cel. Goede voorbereiding vooraf is essentieel voor deze methode goed te werken. Vooral ontwikkelen en testen primerparen die specifiek zijn voor de transcripten van belang (stap 1,2-1,3) tijdrovend maar belangrijke stappen, zoals de primers bepaalt de kwaliteit van de eencellige metingen. Zodra betrouwbare primerp.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We willen graag bedanken V. Kapoor in de CCR ETIB Flow Cytometry Core voor haar hulp bij het uitvoeren van de cel sortering tijdens de ontwikkeling van dit protocol. We danken ook M. Raffeld en de CCR LP Moleculaire Diagnostiek Unit en J. Zhu en de NHLBI DNA Sequencing and Genomics Core voor hun hulp bij het uitvoeren van de qPCR tijdens de ontwikkeling van dit protocol. Dit onderzoek werd ondersteund door de Intramurale Program van de NIH.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | ThermoFisher | 4374966 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q33120 | |
| 2.0 ml low adhesion microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1420-2600 | |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0221 | |
| Axygen 0.2 ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm | 100-3415 | |
| HyClone RPMI 1640 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified (US) | ThermoFisher | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Neocarzinostatin | Sigma | N9162 | |
| ELIMINase | Decon Labs | 1101 | |
| SUPERase-In | ThermoFisher | AM2696 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher | 11753500 | |
| E. coli DNA | Affymetrix | 14380 10 MG | |
| ThermalSeal Sealing Film, Sterile | Excel Scientific | STR-THER-PLT | |
| BD FACSAria IIu | BD Biosciences | ||
| HyClone Trypsin 0.05% | GE Healthcare Life Sciences | SH30236.01 | |
| PBS, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Exonuclease I | New England BioLabs | M0293S | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad | 172-5210 | |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| IFC Controller HX (loading machine) | Fluidigm | ||
| BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) | Fluidigm | ||
| Real-Time PCR Analysis software | Fluidigm | ||
| MATLAB software | MathWorks |
Referenties
- Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
