Kök hücrelerden kondrogenezis kültür koşulları ince ayar gerektirir. Burada, hücreleri yoğunlaştırmak için bir manyetik yaklaşım sunmak, önemli bir adım kondorjenez başlatmak için. Buna ek olarak, bir biyo-reaktör içinde dinamik olgunlaşma hücresel yapıların mekanik uyarma uygulanır ve kıkırdak hücre dışı matris üretimini artırdığını göstermektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kıkırdak Yenileme için 3D Manyetik Kök Hücre Toplama ve Biyoreaktör Olgunlaşma
Bu makalede
Özet
Özet
Kıkırdak mühendislik, doğal dokusuna benzer bir in vitro fonksiyonel implant oluşturmada zorluklar nedeniyle bir sorun olmaya devam etmektedir. Son zamanlarda otolog değiştirmeler geliştirilmesi için araştırdı bir yaklaşım kondrositlere kök hücrelerin farklılaşmasını içerir. Bu kondorjenez gereklidir kök hücre sıkıştırılması derecesi başlatmak için; Bu yüzden, hücre çekicilerin olarak minyatür bir manyetik alan kaynakları kullanılarak, kalın yapı iskeleleri ve iskele içermeyen içinde hem de manyetik olarak yoğunlaştırma hücrelerin uygulanabileceğini göstermiştir. Bu durum, manyetik yaklaşım, aynı zamanda, toplam füzyon kılavuz ve skafold içermeyen, organize oluşturmak için kullanılan, üç boyutlu (3D) boyut olarak birkaç milimetre dokular. gelişmiş bir boyuta sahip ek olarak, manyetik tahrikli füzyonuyla oluşturulan doku kolajen II ekspresyonunda önemli bir artış mevcuttur, ve benzer bir gelişme agrekan ifadesi için gözlemlendi. doğal kıkırdak kuvvetleri t tabi tutuldu olarakşapka onun 3D yapısını etkilemiş, dinamik olgunlaşma da yapıldı. mekanik uyaran sağlayan bir biyo-reaktör, 21 günlük bir süre boyunca kültüre manyetik ekildi iskeleleri kullanılmıştır. Biyoreaktör olgunlaşma ölçüde cellularized iskele içine kondrojenezi geliştirilmiş; Bu koşullar altında elde edilen hücre dışı matris, kolajen II ve agrekan zengin oldu. Bu çalışma, geliştirilmiş kondrojenik farklılaşması, her iki iskele içermeyen ve polisakarid iskeleleri için bir biyo-reaktör içinde etiketlenmiş kök hücrelerin manyetik yoğunlaştırılması ve dinamik olgunlaşma yenilikçi potansiyel özetlenmektedir.
Giriş
Manyetik nanopartiküller zaten manyetik rezonans görüntüleme (MRI) için kontrast ajanları olarak klinikte kullanılmaktadır ve bunların tedavi edici uygulamalar genişleyen tutun. Örneğin, son zamanlarda etiketli hücreler implantasyonu, 1, 2, 3 ve belirlenen bir alanda bir dış manyetik alan kullanılarak in vivo olarak manipüle edilebilir ve yönlendirilebilir ve / veya muhafaza gösterilmiştir. Rejeneratif tıpta, vasküler dokuda 5, 6, 7, kemik 8 ve kıkır....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Manyetik Cihazların 1. İnşaat
Not: Hücre ekimi için kullanılan cihazlar, uygulamaya bağlı olarak değişir (Şekil 1). Manyetik uçları (çapı 750 mm), çok ince olmalıdır, böylece agrega oluşturmak için, hücrelerin sayısı, 2.5 x 10 5 / agrega ile sınırlıdır. 1.8 cm 2/7 mm kalınlığında iskeleleri tohum için, mıknatısların daha büyük (Çapı 3 mm) olması gerekir ve skafold gözeneklerinin içinden hücre göçünü sağlayacaktır.
- Agregat oluşumu için mikro-mıknatıs olan bir cihaz yapımı (Şekil 1A)
- alüminyum plakalar içinden bir 0.8 mm matkap ile mikro-delikleri (3 cm çapında ve 6....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İlk olarak, gruplar ayrı ayrı 2.5 x 10 5 etiketli kök hücreleri (Şekil 2A) biriktirilmesiyle mikro mıknatıslar kullanılarak oluşturulabilir. Bu tek agregalar (girişlerinin boyu yaklaşık olarak 0.8 mm), daha sonra ardışık manyetik indüklenen füzyon daha büyük yapılar sayesinde içine birleştirilebilir. Örneğin, kondrojenik olgunlaşma 8. günde, agrega çiftleri oluşturmak üzere çiftler halinde temas halinde yerleştirilmiştir; quadruplets 2 ikili birleştirme ile 11.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada sunulan teknikler manyetik nanopartiküllerin içselleştirilmesi güvenmek çünkü hücrelerin içinde lokalize bir kez Birincisi, bir önemli konu nanopartiküllerin sonucudur. Demir nanopartikullerin potansiyel toksisite veya maruz kalma 19, 22 boyutları, kaplama ve zamana bağlı olarak bozulmuş farklılaşma kapasitesi tetikleyebilir doğrudur. Kapsüllenmiş demir nanopartiküllerin magnetoferritin şeklinde, biyolojik manyetik nano parçacık 24.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Yazarlar biyoreaktör sağlamada yardımcı olan QuinXell Teknolojileri ve CellD, özellikle Lothar Grannemann Dominique Ghozlan kabul etmek istiyorum. Biz pullulan / dekstran polisakkarit iskeleleri ile bize sağladığı Catherine Le Visage, teşekkür ederim. Bu çalışma, Avrupa Birliği (ERC-2014-ağırlık merkezi projesi Matisse 648779) tarafından ve AgenceNationalede la Recherche (ANR), Fransa (MagStem proje ANR-11 SVSE5) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Demir oksit (maghemit) nanopartikülleri (γ-Fe2O3) | PHENIX - University Paris 6 | C. Mé tarafından yapılmış ve verilmiştir; nager | Ortalama 8.1 nm çap ve negatif yüzey yükü |
| Polisakkarit Pullulan/Dekstran iskeleleri | LIOAD - University Nantes | C. Le Visage tarafından yapılmış ve verilmiştir. | Alkali koşullarda 75:25 pullulan / dekstran karışımından hazırlanmıştır (10 M NaOH). Gözeneklilik: 185-205 &mikro; m; Kalınlık: 7 Mm; Yüzey alanı: 1.8 cm2. |
| TisXell Rejenerasyon Sistemi | QuinXell Technologies | QX900-002 | 500 mL kültür odacıklı çift eksenli biyoreaktör |
| İskeleler için kafes: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mezenkimal Kök Hücre (MSC) | Lonza | PT-2501 | Üç bağımsız parti kullanılmıştır |
| MSCGM BulletKit ortamı | Lonza | PT-3001 | Tam ortam için, sağlanan BulletKit'i (serum, glutamin ve antibiyotik içeren) |
| Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | DMEM Sodyum piruvat yok, HEPES yok |
| RPMI ortamı 1640, Glutamin yok | Yaşam Teknolojileri | 31870-025 | Sodyum piruvat yok, HEPES |
| yok CaCl2 MgCl olmadan PBS2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| %0,05 Tripsin-EDTA (1x) | Yaşam Teknolojileri | 25300-054 | |
| Penisilin (10.000 U/mL) / Streptomisin (10.000 &mikro; g/mL) | Yaşam Teknolojileri | 15140-122 | |
| ITS Premiks Evrensel Kültür Takviyesi (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodyum piruvat çözeltisi 100 mM | Sigma | S8636 | |
| L-Askorbik Asit 2-fosfat | Sigma | A8960 | Konsantre çözeltiyi (25 mM) damıtılmış suda doğaçlama olarak hazırlayın |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Damıtılmış suda seyreltilmiş 175 mM stok çözeltisini hazırlayın ve 4 ° C |
| Deksametazon | Sigma | D4902 | Etanol% 100 seyreltilmiş 1 mM stok çözeltisini hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın; ° C |
| TGF-beta 3 proteini 10 &mikro; g | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodyum sitrat | VWR | 33615.268 | 1 Damıtılmış suda seyreltilmiş M stok çözeltisi ve 4 ° |
| Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986'dan | |
| Chaetomium erraticumSigma'dan Dekstranaz D0443 | |||
| NucleoSpin RNA Ekstraksiyon Kiti | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Ters Transkriptaz | Yaşam Teknolojileri | 18064-014 | |
| Rastgele Astar - Heksamer | Promega | C1181 | 500 ve mikro; g / mL: Seyreltilmiş 1/2 kullanın ve 1 & mikro koyun; Örnek başına L |
| : Ribonükleaz inhibitörü | Promega | N2511 | 40 U/&mikro'daki rekombinant RNA'lar; L: 1 ve mikro koy; Örnek başına L |
| PCR nükleotid dNTP karışımı (10 her biri mM) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life | 4368708 | |
| Step One Plus Gerçek Zamanlı PCR Sistem | Ömrü Teknolojileri | 4381792 | |
| Formalin çözeltisi %10 nötr tamponlu | Sigma | HT5012 | |
| OCT çözeltisi | VWR | 361603E | |
| İzopentan | Sigma | M32631 | |
| Toluidin mavisi O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Etanol mutlak | VWR | 20821.310 | |
| Toluen | VWR | 1.08323.1000 | |
| Montaj ortamı Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3' için astar; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'qPCR | |
| Eurogentec | için Aggrecan Primer | ' için 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'Kollajen | |
| II Astarı | ; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
Kaynaklar
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat Biotechnol. 32 (8), 804-818 (2014).
- Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
