Дифференциальная сканирующая калориметрия - метод оценки термической устойчивости и конформации белка антигена

Summary

Дифференциальная сканирующая калориметрия измеряет термическую температуру перехода (ы) и суммарное количество тепловой энергии, необходимой для денатурации белка. Полученные результаты используются для оценки термической стабильности белковых антигенов в вакцинных препаратах.

Abstract

По данным дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) представляет собой аналитический метод, который измеряет молярной теплоемкости образцов в зависимости от температуры. В случае образцов белка, профили ДСК дают информацию о термической стабильности, и в некоторой степени служит в качестве структурного "отпечатки пальцев", которые могут быть использованы для оценки структурной конформации. Это выполняется с помощью дифференциального сканирующего калориметра , который измеряет температуру термической перехода (температура плавления, Т _м) и энергии , необходимой для разрушения взаимодействий стабилизирующие третичную структуру (энтальпию; & delta ; н) белков. Сравнения между рецептур, а также производственных партий, а также различия в полученных значениях указывают на различия в термической стабильности и структурной конформации. Данные, иллюстрирующие использование DSC в промышленных условиях для исследований стабильности, а также мониторинг ключевых производственных этапов представлены в качестве доказательства эффективности этой протокол. По сравнению с другими методами для оценки термической стабильности конформации белков, DSC является экономически эффективным, требует несколько шагов подготовки проб, а также обеспечивает полный профиль термодинамического процесса разворачивания белка.

Introduction

По данным дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) представляет собой экспериментальный метод , который непосредственно измеряет разницу в поглощении энергии тепла происходит в образце относительно эталона во время регулируемого изменения температуры ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12.} Проведенная в дифференциальном сканирующем калориметре, способ включает в себя введение тепловой энергии в ячейку для образца и опорной ячейки одновременно в то время как одинаково увеличивая температуру обеих клеток в течение долгого времени ^{2, 13,}14. Из - за разницы в составе образца и справки, различное количество энергии будет необходимо повышать температуру клеток ^{2, 12, 13.} Таким образом, избыточное количество энергии , необходимой для компенсации разницы температур между клетками измеряют и непосредственно коррелирует с конкретными термодинамическими свойствами образца ^{1, 3.}

В 1960 - е годы, MJ О'Нил и Е. Уотсон Perkin Elmer разработал первый дифференциальный сканирующий калориметр для измерения теплового потока твердых материалов ^{2, 3, 4.} Параллельно с этим, П. Л. Привалов и DR Monaseldze EL Института физики, Республика Грузия (бывший СССР) создал уникальный дифференциальный адиабатический калориметр, который может быть использован FOг биохимические исследования ^{5, 6.} Впоследствии команда Э. Л. Андроникашвили в Институте физики Республики Грузии, сообщает теплоемкость биомолекул , таких как волокнистые и глобулярных белков, ДНК и РНК с использованием DSC ^{7, 8, 9.} Несколько команд во главе с Стертевант ^{10, 11, 12, 13,} Brandts и Привалова ^{14, 15, 16} направлены на развитие теории и практического применения ДСК для исследования термодинамических деталей разворачивания белка. Значение ДСК при изучении крупных надмолекулярных структур , таких как фагов, хлоропласт, фосфолипидных жидкие кристаллы, и белки мяса также сообщалось ^{17 SUP>, 18, 19, 20.}

DSC теперь стало обычным явлением в фармацевтических исследованиях и разработках для оценки термической стабильности биомолекул, особенно белки ^{1, 21, 22.} В основном это связано с прогрессом с точки зрения чувствительности и автоматизации приборов , используемых для проведения эксперимента ^{23, 24.} Здесь конечный результат ДСК эксперимента, а именно, молярной теплоемкости в зависимости от температуры, используется для оценки следующих термодинамических параметров (изменение теплоемкости (ΔCp), энтальпия (H), энтропией (& Dgr; S) , и свободная энергия Гиббса (ΔG)) с помощью уравнения ниже:

eq1.jpg "/> (1)

(2)

(3)

(4)

(5)

Там, где Cp измеряется теплоемкость; д представляет собой поток тепла в исследуемом материале; Т ₀ и Т являются начальная и конечная температуры перехода соответственно ^{22, 25.} Стоит также отметить , что приведенные выше уравнения применимы к однодоменных белков , которые могут пройти два-переход между состояниями и обратимое термическое разворачивание ^22. Анализ более сложных белков (например, не с двумя состояниями белков и олигомеры) чпр сообщили Фрира и др. ^26; Джонсон и др. ^27; и Касимова и др. ^28.

Для того, чтобы определить , подвергается ли белок с двумя состояниями переход или образует промежуточные продукты в процессе термической денатурации, экспериментально полученных энтальпию (& Dgr ; H, называемый также калориметрические энтальпией & delta ; н _Cal) сравнивается с энтальпией , полученной с помощью уравнения Вант - Гофф , приводимому ниже (также упоминается как Вант - Гоффа энтальпией; & Dgr ; H _VH):

(6)

Где T _м является серединой температура перехода, R является идеальным газовая постоянная (1,987 кал моль ^-1 К ^-1) и Y представляет собой долю населения белка в разложенном состоянии ^{16, 29.} Если& Dgr ; H _VH равно _Cal ; H; или & Dgr ; H _VH / _Cal & Dgr ; H равен 1, то белок подвергается "все или ничего" переход (т.е. с двумя состояниями перехода) ^{16, 25, 29.} Тем не менее, если & Dgr ; H _VH меньше _Cal & delta ; H; или & Dgr ; H _В.Х. / & Dgr ; H _Кал меньше , чем 1, то белок подвергается не-двумя состояниями перехода ^{16, 25, 29.} Отношение _VH / delta ; H ; H _Cal также соответствует доле белковой структуры , которая плавится как термодинамической кооперативной единицы или домена ^26.

Термодинамические параметры, упомянутые выше, такие как ΔG и предоставить полезную; H информацию о термической стабильности белков, в том числе биопрепаратов ^30. Тем не менее, акцент будет сделан на Т _м и в этом ; H публикации, так как они являются приведенные значения для данного протокола. T _м температура в средней точке перехода, где складывают и развернутые состояния белка находятся в равновесии (т.е. 0 DG =) ^{25, 31.} Чем выше Т _м белка, тем выше его термостабильность ^31. & Dgr ; H соответствует площади под пиком (ами) Температурная зависимость теплоемкости графике (также известный как термограммы) генерируется в конце эксперимента DSC ^{16, 25.} Это энергия , необходимая для денатурации белков и может быть использовано для оценки активной фракции (F _A) в композиции белка (то есть, доля белков с активной конформации в образце) с использованием следующего уравнения:

jove_content "> (7)

Там , где & Dgr ; H является экспериментально получена энтальпия образца белка и Q является энтальпия определяется для хорошо охарактеризованного ссылки или стандартизированной белка ^22. Оценка F _A имеет большое значение для контроля стабильности в реальном масштабе времени продукции, а также проведение исследований устойчивости в стрессовых условиях в соответствии с требованиями руководящих принципов ICH ^32. Сравнение также предоставляет delta ; H информацию о компактности третичной структуры конформации белка ^31.

Этот протокол подробно процедура для оценки термической устойчивости белков в промышленных условиях и широко используется для разработки вакцин. Она была разработана с использованием автоматического дифференциального сканирующего калориметра, который генерирует воспроизводимые результаты Fили концентрации белка, как низко как 300 мкг / мл.

Protocol

1. Инструмент Запуск

1. Включите Дифференциальный сканирующий калориметр и увеличения давления в клетках, чтобы подавить кипение образцов, а также предотвратить образование пузырьков при повышенных температурах. Это, как правило, достигается за счет подачи азота в систему.
2. В зависимости от составляющего материала клетки (например, тантал, золото, платина и т.д.), регулировать давление подачи газообразного азота в соответствии с рекомендуемыми давлением производителя, чтобы не повредить клетки. Например, установите давление подачи газа азота до 45 фунтов на квадратный дюйм для инструмента, используемого для разработки этой процедуры, и давление выше 80 фунтов на квадратный дюйм может повредить клетку.
3. Убедитесь, что все резервуары чистящее средство заполнены до требуемого объема. Чистящие средства, необходимые включают моющее средство и воду, чтобы мыть и чистить клетку, соответственно, после каждого образца прогона.
4. Установите температуру фиксации образцов отсекадо подходящего значения, предпочтительно от 5 & deg; С, чтобы сохранить целостность образца до эксперимента.

2. Подготовка проб

1. Диализировать образца против буфера, который будет использоваться в качестве эталона для эксперимента. В качестве альтернативы, можно использовать элюции буфер собирали на конечной стадии очистки белка (т.е. элюции колонки).
2. Определить концентрацию образца белка с использованием наиболее подходящего метода определения концентрации белка , такие как метод Kjedahl ³³ или ³⁴ методом Лоури. Для объективного сравнения результатов, использовать тот же метод последовательно в рамках одного исследования. Требуемый диапазон концентраций может варьироваться в зависимости от модели прибора. Для прибора, используемого в данном протоколе, предпочтительный рабочий диапазон составляет 0,5 - 1 мг / мл.
3. Дега образец и эталонный буфер в вакууме, чтобы избавиться от микропузырьков, которые могут вызвать объем inaccurНКД. Этот шаг может быть пропущен для новых моделей калориметра.
4. С помощью микропипетки и стерильные наконечники в шкафу с ламинарным потоком биосдерживанию, загружать образцы и их соответствующий буфер в парах в 96-луночные планшеты, совместимых с данным инструментом. Заполните первые две пары скважин с буфером и последние две пары с водой для буфера-буфера и воды сканирования соответственно. Буфер-буфер сканирует проверки пригодности прибора перед измерением (т.е. оценка погрешности измерительных приборов), а также установить базовый уровень; в то время как вода сканирование выполняются, чтобы очистить клетки.
5. Накройте 96-луночный планшет с уплотнительной пленкой, и убедитесь, что лунки должным образом запечатаны, прежде чем принимать пластины из кабинета биологической безопасности, чтобы избежать загрязнения образца.
6. Поместите пластину в отсек фиксации образцов в правильной ориентации.

Настройка параметров 3. Экспериментальные

Примечание: В зависимости от Instrumentation, образцы могут быть загружены в клетку либо вручную, с помощью шприца, или автоматически с помощью пробоотборника. В этом случае (т.е. промышленных условиях), автоматический пробоотборник используется для экономии времени.

1. С помощью программного обеспечения сбора, введите информацию об образце в порядке, планшет был загружен в соответствии с разделом 2.4. Введите концентрации если таковые имеются, в противном случае, введите значения концентрации в программное обеспечение для анализа до анализа данных (раздел 4.2).
2. Выберите вариант, который обеспечивает очистку клеток с моющим средством перед каждым сканированием образца, который должны следовать несколько этапов ополаскивания водой, чтобы убедиться в отсутствии остатков моющего средства остается в клетках.
3. Установка начальной температуры эксперимента до 20 ° С, но это может варьироваться в зависимости от предварительного знания образца. Для известных белков, предварительно определенной стартовой температуры можно использовать, в то время как ниже начальной температуры может быть применен для неизвестных образцов.
4. Установить конечную температуруэксперимента, например , 100 ° С. Конечная температура может варьировать в зависимости от предварительного знания образца.
5. Установите скорость сканирования эксперимента, например , 60 ° C / ч, что является типичным скорость сканирования. Тем не менее, скорость сканирования может изменяться в зависимости от предварительного знания образца, например , 90 ° C / час, или 120 ° C / ч. Желательно, чтобы сканировать неизвестные образцы при различных скоростях сканирования для оценки кинетики разворачивания.
6. Пересканировать образцы для исследования обратимости тепловой разворачивания. Разворачивание белка считается обратимым, если энтальпия, полученные для второго сканирования составляет по меньшей мере 80% от энтальпий значения для первого сканирования.
7. Установите после эксперимента термостат на 10 ° С, чтобы сохранить целостность клеток калориметр в.
8. Убедитесь в том, что параметры настройки эксперимента являются правильными перед выполнением эксперимента. Если все в порядке, начать эксперимент.

4. Данныеalysis

1. Получение исходных данных из эксперимента и выбрать один образец в то время для анализа. Вычтите опорного сканирования, то есть буфер, из сканирования образца.
   Примечание: Ссылка вычитание осуществляется автоматически с помощью новых моделей DSC инструментов.
2. Введите значение концентрации образца, если она была опущена, как указано в разделе 3.1.
3. Установить и вычесть базовую линию от приобретенной термограммы для учета различий в теплоемкостей свернутых и развернутых состояний белка, которое вызвано воздействием гидрофобных групп к воде на разворачивание. Линейные или кубической аппроксимации кривой может быть применен в зависимости от формы профиля DSC для образца. Для согласованности, тот же тип фитинга должен быть использован во время исследования, например , исследование стабильности в режиме реального времени. Этот шаг необходим для обработки кривой для пика интеграции для получения энтальпию перехода.
4. Выполните пик интеграции с использованием нелинейных наименьших квадратов. На основе продуктазнания применяются в два состояния или не-модели двух состояний. Два состояния модель может быть использована для отдельных кооперативных тепловых переходов, а также для неизвестных белков, применять не-две модели государства до дальнейшего знания продукта не доступен. В случае необходимости, корректировать кривой с помощью итерационного подбора кривых функции программного обеспечения оборудования, пока Хи-квадрат значение остается постоянным.
5. Полученные результаты будут показаны значения для средней точки переходных температур (Tm), калориметрической энтальпии (H) и Вант - Гоффа энтальпию (H) _VH образца.

Results

Необработанные данные от большинства экспериментов ДСК представлены в виде теплового потока в зависимости от температуры графика, так как на самом деле калориметр измеряет разницу в скорости теплового потока в раствор пробы и буфер ^35. Таким образом, если обе клетки (например , образцы и опорные клетки) содержат идентичные решения в ходе эксперимента, необработанные данные от сканирования должна быть плоская линия без заметных пиков. Любой пик , наблюдаемый можно отнести к погрешности измерительных приборов (например , поврежденные или загрязненные клетки), поэтому выполняется сканирование буфера до анализа проб является адекватным тест пригодности системы. На рисунке 1 показан результат типичного сканирования буфера , указывающий , что калориметр находился в хорошем рабочем состоянии до анализа проб.

На рисунке 2 показано , исходные данные для эксперимента ДСК проводили на Diffразличны много двух образцов белка. Как следует из ранее, наблюдаемые пики являются различия в тепловом потоке образцов и их соответствующих буферов. Различия в концентрации образца может привести к изменению теплоемкости, записанного калориметра; Однако эти изменения нормированы в ходе анализа проб в соответствии с разделом 4.2 процедуры. Более высокие концентрации могут также выявить дополнительные термодинамические домены не способствует переходу на более низких концентрациях. Кроме того, каждый переход представляет собой термодинамическую домен , который может включать одну или несколько структурных доменов белка ^36. В этом случае белок 1 имеет три структурных домена, которые плавятся кооперативно.

На рисунке 3 показаны результаты , полученные на основе анализа исходных данных для белка 1 и 2 , представленных на рисунке 2, т.е. после базового вычитания и итеративной кривой цчал. Полученные термограммы были нормированы на скорости сканирования (автоматически осуществляется с помощью заранее заданного алгоритма в программном обеспечении анализа) и концентрации; Таким образом, представляя результаты эксперимента в сопоставимой теплоемкости в зависимости от температуры графиков. Программное обеспечение для анализа использует данные из теплоемкости в зависимости от температуры графиков, таких как Т _м и ΔCp, чтобы получить другие термодинамические параметры , используя вариации приведенных выше уравнений в зависимости от кооперативности разворачивания белка.

При тестировании неизвестных образцов, установив соответствующий температурный диапазон имеет решающее значение. В противном случае, неполные термограммы может привести, как показано на рисунке 4. Хотя Т _м от таких профилей могут быть получены, & Dgr ; H не может быть точно определена. Таким образом, образец должен быть повторно с более широким диапазоном температур, чтобы полностью захватить термическому переходу. Некоторые белки также повторноadily образуют агрегаты после полной денатурации, что ведет к увеличению емкости после перехода тепла: это часто появляется как неполный термограмме , как показано на фигуре 2В. Тем не менее, повторное тестирование с более высокой конечной температуре может помочь подтвердить, есть ли возникновение конформационного перехода в этой области термограммы или это просто поглощающий тепло эффект белковых агрегатов.

Термическая стабильность является одним из наиболее важных физических свойств белков и белковых продуктов в промышленности ^37. В фармацевтических препаратов, он используется для определения стабильности биопрепаратов в различных условиях, включая разработку буферов и факторов окружающей среды, таких как влажность и температура. Он также используется для контроля ключевой шаг изготовления (например, очищение и детоксикация) , чтобы обеспечить согласованность между конформационной производственных партий. > На рисунках 5 и 6 иллюстрируют использование DSC для изучения влияния химических дезинтоксикации и условий хранения , соответственно , на стабильность и структурной конформации двух различных белков. Значительные различия в Tm и указывают на конформационные; H изменений и деградации белка соответственно. Кроме того, утрата третьего перехода на рисунке 6 дополнительно иллюстрирует деградацию домена что подтверждалось уменьшением молекулярной массы , когда образцы были проанализированы с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием нескольких ракурсов рассеяния света (SEC-MALS) ( данные не показаны).

Рисунок 1: Buffer сканы. Сходство с градиентом каждого сканирования без заметных пиков указывает на то, что прибор находится в хорошем рабочем состоянии и генерируются воспроизводимые результаты.//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Исходные данные , собранные из DSC экспериментов. Эти графики являются хорошими представлениями о непроанализированных (сырых) данных , полученных после опытов (т.е. до базового вычитания и подгонки кривой). Каждая строка представляет собой производственный участок. Белок 2 имеет тенденцию к агрегации более легко при нагревании, что приводит к увеличению теплоемкости выше 100 ° С в постпереходный области термограммы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Исследуемый DSC данных. Эти графики являются хорошими представления анализируемых данных ДСК (т.е. после базового вычитания и подгонки кривой). Синяя линия представляет термограмма после базового вычитания, в то время как красная линия представляет собой кривую с лучшей подгонки к термограмме. (А) Т _м и & Dgr ; H для белка 1 Образец # 12 80.16 ° C и 1,69 х 10 ⁶ кал / моль соответственно. (В) _Тпл и & Dgr ; H для белка 1 Образец № 13 являются 80,15 ° C и 1,71 х 10 ⁶ кал / моль соответственно. (С) Т _м и & Dgr ; H для Протеин 2 Образец # 21 75,01 ° C и 4,08 х 10 ⁶ кал / моль соответственно. (D) Т _м и & Dgr ; H для Протеин 2 Образец # 22 75,67 ° С и 4,22 х 10 ⁶ кал / моль соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобыпросмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Неполное термограмма. Исходные данные для сбора белка 1 анализировали в неадекватном диапазоне температур. Конечная температура эксперимента был установлен на 90 ° C, не размещения всего профиля перехода белка по сравнению с экспериментом на фигуре 2А , который был установлен на 120 & deg ; С. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Анализируются данные , показывающие влияние химического Detoxification на третичную структуру белка 1. (А) Белок 1 представляет собой токсин в его нативной конформации и гаS его T _м при 56.84 ° C и при & Dgr ; H 2,57 × 10 ⁵ кал / моль. (Б) детоксифицированный форма белка 1 (т.е. анатоксином) имеет _Тт и значения & delta ; н от 81,01 ° С и 1,89 х 10 ⁶ кал / моль соответственно. Таким образом, можно сделать вывод о том , что шаг детоксификации ввел некоторую форму изменения структурной конформации белка 1 , который придает большую стабильность (выше Т _м) до его детоксицированного форме. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: анализируемые данные , показывающие эффект условиях хранения на конформацию белка 3. Эти графики иллюстрируют влияние температуры хранения (2 - 8 ° С) на стабильность и третичной структуры ProTein 3 более 30 недель. _Тпл и значения & delta ; н на содержание белка 3 на 8 - ^й (А) и 38 - ^й недели (В) хранения, приведены в таблице 1 ниже. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Образец	Тт 1 (° С)	& Dgr ; H 1 (кал / моль)	Тт 2 (° С)	& Dgr ; H 2 (кал / моль)	Тт 3 (° С)	& Dgr ; H 3 (кал / моль)
Белок 3 хранят при температуре 2-8 ° С в течение 8 недель	61.91	1,71 х 10 5	75.54	2,17 х 10 5	90.29	4,17 х 10 5
	61.87	1,66 х 10 5	75,18	1,46 х 10 5	90.22	5,76 х 10 5

Таблица 1: Tm и значения для delta ; H белка 3 на 8 - ^й и 38 - ^й недели хранения при 2 - 8 ° C. Несмотря на то, _т значений Т в обеих временных точках одинаковы, разница в величинах & delta ; н указывает на то, что третичная структура белка 3 деградировал в течение 30 недель при Заданные условия хранения.

Discussion

Эта процедура была успешно зарегистрирована в различных тестовых характеристик пакетов, включая стабильность и сопоставимость продукт исследований ^21. В исследованиях стабильности в режиме реального времени, DSC используется для контроля Т _м, а также оценить диафрагменное _А биопрепаратов с течением времени , чтобы определить их срок годности. Что касается сопоставимости продукта, он используется для оценки влияния процесса и изменения объекта, а также влияние ключевых этапов производства по структурной конформации производимых партий. Это, как правило, включает в себя прямое сравнение произведенного; H лота к эталонным продуктом, который был назначен в качестве идеального продукта. Кроме того, DSC, оказалось полезным аналитическим инструментом для исследований ³⁷ рецептуры продукта. _Тпл белка в различных буферных растворах и при различных концентрациях могут быть использованы для определения формулировку, Протягивает наиболее стабильностьбелок.

Для обеспечения надежности этого метода и объективность его результатов, важно сохранить параметры тестирования в соответствии с запуска к запуску в рамках того же исследования (например, вакцина препарат исследования). Тем не менее, эта процедура может быть изменена, чтобы приспособить различия в физических свойствах различных белков. Пример модификации , которые могут быть сделаны изменяет частоту развертки эксперимента ^{38, 39.} Белки , которые были склонны к образованию агрегатов при нагревании исследовали с более высокой скоростью сканирования (например, 120 ° С / ч) , чтобы избежать вклада агрегатов в термальный профиля перехода, а также закупоривать капилляры калориметра. Стоит отметить , что скорость сканирования может повлиять на результаты ДСК эксперимента ^38. Уширение теплового перехода пика наблюдается при увеличении скорости сканирования в некоторых про; белки Тем не менее, T _м оставалась довольно постоянной ^38. Кроме того, диализ и дегазация шаги для подготовки образцов также очень важно для получения точных результатов ^31. Диализ гарантирует, что единственное различие в составе образца и буфера является белок; Таким образом, все избыточное тепло, поглощаемая образцом можно отнести к теплоемкости белка. Дегазация обеспечивает точный анализ объема, так как экстраполяция термодинамического параметра предполагает , что разворачивание событие происходит при постоянном объеме и давлении ^31. Постоянная часть давления в предположении объясняется воздействием давлени азота системы в соответствии с разделом 1.1 процедуры.

По сравнению с другими методами определения устойчивости конформации белков, таких как кругового дихроизма (КД) и флуоресцентной спектроскопии, ДСК предлагает ряд преимуществ в комустановка мерческий включая стоимость и экономию времени. Во - первых, адиабатическое конструкция дифференциального сканирующего калориметра позволяет измерять термостабильности с более высокой точностью температуры по сравнению с измерениями с аппаратурой для CD и флуоресцентной спектроскопии ^6. Во- вторых, в отличие от компакт - диска, точность данных DSC не зависит от спиральности белка ^{39, 40;} Тем не менее, CD содержит дополнительную информацию о развертывании вторичной структуры, которая будет дополнять ЦФК ^41. Кроме того, повышение давления системы DSC позволяет испытывать с широким диапазоном температур без кипения образца; Таким образом, широкий спектр белков может быть проверена с помощью DSC.

В то время как DSC относительно быстрый и простой подход для определения термостабильности биопрепаратов, не без ограничений. Во-первых, базоваяшаг линии вычитания вводит некоторую форму человеческой непоследовательности в анализ необработанных данных; Таким образом, изменения в результатах могут наблюдаться у разных пользователей. Во-вторых, дифференциальные сканирующие калориметры имеют минимальные предельно допустимой концентрации, которые могут быть трудно достичь в объемном промышленном масштабе. В-третьих, & Dgr; H необратимой тепловой денатурации не является абсолютным; откуда следует, что полученный ΔG (показатель стабильности белка) в подобных сценариях может вводить в заблуждение. Кроме того, метод лучше всего работает для очищенных образцов. Наличие примесей может либо вызвать сдвиг в Т _м , если есть взаимодействие с белком исследуемого или появление новых тепловых переходов , если не существует никакого взаимодействия. В любом случае эти дополнительные функции на термограмм могут быть ошибочно отнесены к образцам, тем самым влияя на интерпретацию результатов. Несмотря на эти ограничения, DSC остается надежный метод, который может предоставить подробную информацию о термодинамической гое белка процесс развертывания , если выполняется должным образом ^42.

В заключение, DSC предлагает значительное преимущество в качестве конформационного инструмент для считывания продуктов вакцин и их промежуточных продуктов. Два параметра, Т _м и & Dgr ; H, собранные для массива лотов одного и того же продукта может стать эмпирический базис , который может быть использован для изучения влияния изменений процесса, состава и условий хранения на третичной структуры и стабильности белка и вирусные антигены ^{21, 43.}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Дифференциальный сканирующий калориметр	Malvern Instruments Ltd	28428948 (через GE Healthcare)	Имеет автосэмплер для автоматической подачи образцов в ячейку, чтобы уменьшить человеческие усилия и ошибки.
Contrad 100	Decon Laboratories Inc	1504	Перед применением разбавить водой до 20%
L Полипропиленовая пластина с круглым дном 96 лунок	Canadian Life Science	ML072100	Эквивалентные пластины от других поставщиков (например, VW) также могут быть использованы
MicroCal ThermoVac	Malvern Instruments Ltd	N/Ap	поставляется с шкафом биобезопасности Cap VP DSC
	Labconco	Logic+ -	Ламинарный проточный шкаф A2 для биоизоляции для подготовки образцов
Кассета для диализа Slide-A-Lyzer	Thermo Scientific	66810 или 66380	для балансировки образца и буфера