Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

نظام لفعالية والسمسة فحص مثبطات استهداف بين الخلايا Published: April 5, 2017 doi: 10.3791/55273

Summary

لقد قمنا بتطوير نظام الفحص الإنتاجية العالية وحدات لاكتشاف مركبات جديدة ضد السل المتفطرة، تستهدف داخل وفي مرق تزايد البكتيريا وكذلك السمية الخلوية ضد الخلية المضيفة الثدييات.

Introduction

المتفطرة السلية، العامل المسبب لمرض السل (TB)، هو أحد الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. TB الحساس للأدوية هو مرض قابل للعلاج يتطلب مضادات حيوية متعددة لمدة 6 أشهر. على الرغم من كونه مرض قابل للعلاج، وقدرت نسبة الوفيات بمرض السل أن يكون 1.5 مليون في عام 2015 1. في السنوات ال 10 الماضية، كانت هناك زيادة المخاوف من انتشار M. السل المقاوم للأدوية. يتم تعريف للأدوية المتعددة مقاومة السل (MDR-TB) كما TB التي هي مقاومة على الأقل أيزونيازيد (INH) وريفامبيسين (RMP)، ومعظم سلالات السل المقاوم للأدوية المتعددة هي أيضا مقاومة لتحديد الأدوية TB الخط الثاني، مما يحد من خيارات العلاج . آثار مقاومة المخدرات تخلق تحديا أكبر لعلاج المرضى الذين يعانون شارك في المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV). 400000 المرضى في جميع أنحاء العالم توفي من مرض السل المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية في عام 2015 1. مخيبة للآمال، والولايات المتحدة الأمريكية للغذاء والدواء Administوقد وافقت التموينية واحد فقط المخدرات TB جديدة ضد MDR-TB، bedaquiline، في السنوات ال 40 الماضية 2. هناك حاجة ماسة إلى التقدم في إيجاد علاجات أفضل وأقصر TB من أجل البقاء قدما في مكافحة السل وMDR-TB.

تقليديا، يتم تنفيذ الشاشات المخدرات TB تحت في المختبر ظروف النمو في متوسط النمو، حيث تتم إضافة مركبات للثقافة متنامية ويتم تحديد فعاليتها في القضاء على الكائنات الحية الدقيقة عن طريق عد مستعمرة (كفو) في وسط صلب. كما تعول CFU هي كثيفة العمالة، تستغرق وقتا طويلا، ومكلفة، وقد وضعت وسائل غير مباشرة مختلفة للتخفيف من حدة هذه المشكلة. وتشمل هذه الأساليب في الامار الأزرق جدوى فحص وتحديد مضان 4 من البروتين الأخضر الفلورسنت (GFP) أو التلألؤ 5 من البكتيريا، معربا عن وسيفيراز، وتقدير مجموع أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) 6 و 7.

يتميز TB نموذجي من عدوى السل M. في الرئة، حيث تتواجد البكتيريا وتتكاثر داخل جسم بلعمي الضامة السنخية 8. الشاشة المظهرية بسيطة في مرق قد تتناسب مع مسببات الأمراض خارج الخلية. ومع ذلك، في المنظور التاريخي، وأصيب المركبات ضد M. السل التي تم تحديدها باستخدام هذه الطريقة غالبا ما تفشل في الارتقاء إلى مستوى التوقعات خلال خطوات التحقق من صحة المصب في نماذج العدوى. نقترح أن المخدرات TB يتم تنفيذ الأفضل في نموذج عدوى الخلية المضيفة داخل الخلايا. ومع ذلك، ونماذج الخلايا تمتلك العديد من الحواجز التكنولوجية والبيولوجية لفحص (HTS) تطوير الإنتاجية العالية. وهناك عقبة كبيرة هي تعقيد عملية العدوى، والتي تجسدت خطوات عديدة وإزالة متطورة من البكتيريا خارج الخلية التي كتبها في الفترات الفاصلة بين الغسيل. وهناك عقبة رئيسية الثانية هي المرة إعادة طويلةيتطلبه، كما كشف عن النمو، ويتم عادة CFU تعول على لوحات ثقافة، هي العملية التي تستغرق أكثر من 3 أسابيع لإكمال. تم توفير حل واحد ليحل محل التهم CFU بواسطة المجهر الفلورسنت الآلي في تركيبة مع البكتيريا الفلورسنت. ومع ذلك، هذا الحل يتطلب الاستثمار في المعدات الأولي الذي هو خارج عن متناول العديد من مختبرات البحوث. ومن شأن ومنخفضة التكلفة بسيطة، والأمراض ذات الصلة طريقة HTS يعزز إلى حد كبير عملية اكتشاف المخدرات.

في هذه الدراسة، ونحن التقرير نظام HTS جديد، وحدات التي تهدف إلى توفير السريع، وتدرجية عالية، بعد اقتصادي، فحص مناسبة لتحديد النشاط من المركبات ضد الخلايا السل M.. ويتكون هذا النظام من ثلاث وحدات: (ط) داخل الخلايا، (ب) السمية الخلوية، و (iii) فحوصات في المرق. توفر النتيجة النهائية مجتمعة وصفا شاملا للخصائص مركب، مع معلومات إضافية عن الوضع المحتمل للعمل. هذا الشورينظام reening استخدمت في العديد من المشاريع مع المكتبات مجمع المختلفة التي تستهدف طريقة العمل، بما في ذلك تحليل التآزر المخدرات وتحفيز الالتهام الذاتي 10، وتثبيط M. السل -secreted عامل الضراوة (غير منشورة). كما تم دراسة المركبات من وضع غير معروف من عمل 11. اعتمد نسخة معدلة من هذا الأسلوب أيضا شريك صناعي لدينا كأسلوب غربلة أولية لتحديد مركبات جديدة ضد الخلايا السل M. 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. سلالة بكتيرية والنمو المتوسطة

  1. جعل سكر العنب الزلال وحل الأسهم الملح (ADS) من خلال الانحلال 25 غرام من الزلال المصل البقري، 10.0 غرام من سكر العنب، و4.05 غرام من كلوريد الصوديوم في 460 مل من الماء منزوع الأيونات. تصفية تعقيم ADS وتخزينها في 4 ° C.
  2. جعل 7H9 مرق من خلال إضافة 4.7 غرام من مسحوق 7H9 و 2 مل من الجلسرين 900 مل من الماء النقي. الأوتوكلاف مرق 7H9 على 121 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة والسماح لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل المتابعة. جعل 7H9ADST بإضافة 100 مل من ADS و 0.5 مل من Tween80 إلى 900 مل من مرق 7H9. تخزينها في 4 ° C.
  3. تزن 50 ملغ من كبريتات كانامايسين وتذوب في 1 مل من الماء منزوع الأيونات. التركيز النهائي هو 50 ملغ / مل. تصفية تعقيم وتخزين في -20 ° C. إضافة 0.5 مل من الكانامايسين حل سهم لكل 1 لتر من 7H9ADST.
    ملاحظة: يجب أن يتم هذا متوسطة جديدة، لذلك حجم وحدات التخزين بشكل مناسب وفقا لحجم الثقافة.
  4. تنمو السل M. في 7Hتستكمل 9ADST مع كانامايسين في الثقافة واقفا. يهز الثقافة يوميا وتمييع قبل أن يصل OD600 1.0 لتجنب تراكمها.
    ملاحظة: سلالة السل M. المستخدمة في تطوير هذه الطريقة كان H37Rv تحولت مع pJAK2.A البلازميد 12. pJAK2.A هو البلازميد التكاملي على أساس ناقلات pMV361، والذي يسمح التعبير رفيع المستوى من الجين يراعة luciferase من المروج hsp60 ويمكن اختيار باستخدام كانامايسين.

2. THP-1 المتوسطة والصيانة

  1. إضافة 50 مل من الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS) و 5 مل من 200 ملي L-الجلوتامين إلى 500 مل من RPMI 1640 لجعل RPMI المتوسطة ناقصة (حوالي 10٪ FBS و 2 الجلوتامين ملم).
  2. الحفاظ على ثقافة الخلية THP-1 وفقا لبروتوكول قياسي 13. لفترة وجيزة، وتنمو THP-1 الخلايا في RPMI المتوسطة ناقصة مع الحفاظ على كثافة خلية من ،2-1٬000٬000 في مل من المتوسط ​​بين نظام تقييم الأداءحكماء.

3. فحص عالية الإنتاجية داخل الخلايا عن طريق معربا عن luciferase المراسل M. السل H37Rv

  1. قياس الكثافة البصرية لتعليق البكتيرية بنشاط متزايد في معمل عند طول موجي 600 نانومتر. حساب كثافة البكتيرية باستخدام عامل التحويل من 0.1 OD 600 = 3 × 10 7 بكتيريا لكل مليلتر.
  2. ماصة البكتيريا كافية لعدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 10: 1 في أنبوب الطرد المركزي الجديدة. بيليه في 3000 x ج لمدة 10 دقيقة، ونضح السائل. إضافة 50 ميكرولتر من المصل البشري إلى 450 ميكرولتر من RPMI1640. مقياس حجم تخصيص قيم لهذه التجربة.
  3. ليستطهي البكتيريا، إعادة تعليق بيليه في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 8 بكتيريا في كل 500 ميليلتر من RPMI1640 المحتوية على مصل الإنسان 10٪. السماح للخليط لاحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تحديد THP-1 خلية كثافة الثقافة عن طريق العد مع عدادة الكريات وmicrosco مقلوببي.
  4. بيليه الخلايا في أنابيب الطرد المركزي معقمة في 100 x ج و 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. نضح في وطاف resuspend الخلايا في RPMI غير مكتملة في مناطق ذات كثافة من 1 مليون خلية لكل مليلتر. إضافة phorbol 12 ميريستيت-13-خلات (PMA) إلى 40 نانوغرام / مل تركيز النهائي.
    ملاحظة: سيتم يشار إلى ذلك المزيج التمايز.
  5. الجمع بين opsonized السل M. مع مزيج التمايز THP-1 في وزارة الداخلية من 10: 1 وقسامة المزيج النهائي في 100 ميكرولتر لكل بئر في لوحة بيضاء 96-جيدا مسطحة القاع. يحرك الخليط بانتظام لضمان الاتساق. السماح للتمايز وعدوى والمضي قدما ليلا 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2.
  6. يغسل الآبار مرتين مع 100 ميكرولتر من RPMI لكل منهما. إضافة مركبات مخففة للتركيز المطلوب في RPMI غير مكتملة واحتضان لمدة 3 أيام.
  7. نضح في المتوسط ​​من الآبار. إضافة 50 ميكرولتر من كاشف فحص وسيفيراز إلى كل بئر. ختم لوحات مع تيransparent السدادات لوحة لاصقة. سماح 5 دقائق من الحضانة عند 22 درجة مئوية ومن ثم الحصول على قراءات في luminometer في 1 ثانية لكل بئر.

4. تحليل السمسة باستخدام 3- (4،5-Dimethylthiazol-2-YL) -2،5-diphenyltetrazolium بروميد (MTT) فحص 14

  1. التفريق THP-1 الخلايا في RPMI تستكمل كاملة مع 40 نانوغرام / مل من سلطة النقد الفلسطينية في واضحة لوحات 96-جيدا. الحفاظ على كثافة الخلية 1 مليون لكل مليلتر وقسامة 100 ميكرولتر لكل بئر. السماح التمايز والمضي قدما ليلا 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2.
  2. نضح المتوسط ​​من الآبار وغسلها مرتين مع RPMI 1640. اضافة مركبات مخففة في RPMI غير مكتملة إلى الآبار. احتضان لمدة 3 أيام.
  3. حل 0.5 غرام من MTT في 100 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لجعل حل الأسهم من 5 ملغ / مل. تصفية العقيمة وتخزينها في -20 ° C، بعيدا عن الضوء. فمن الأفضل لجعل هذا الحل الطازجة.
  4. 2.5 ساعة قبل احتسابه نهاية فترة الحضانة لمدة 3 أيام، إضافة 25 ميكرولتر من محلول MTT إلى كل بئر واستكمال فترة الحضانة.
  5. تجهيز 50٪ N، N -dimethyl الفورماميد (DMF) عن طريق خلط 250 مل من DMF مع 250 مل من الماء منزوع الأيونات.
  6. إعداد استخراج العازلة MTT على النحو التالي: وزن 100 غرام من SDS في زجاجة 500 مل وإضافة 300 مل من 50٪ DMF. تطبيق الحرارة المنخفضة للسماح للSDS إلى حل. إضافة 10 مل من حمض الخليك النقي و 12.5 مل من 1 M حمض الهيدروكلوريك. ملء ما يصل الى علامة 500 مل مع 50٪ DMF. التشكيل النهائي لاستخراج العازلة هو 50٪ DMF، و 20٪ SDS، 2.5٪ حامض الخليك، و 2.5٪ 1 M حمض الهيدروكلوريك.
  7. في نهاية فترة العلاج، إضافة 100 ميكرولتر من استخراج العازلة (درجة حرارة 45 ° C حل أي بلورات) إلى كل بئر. السماح للخليط لاحتضان ليلا 37 ° C في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2. قراءة الامتصاصية في 570 نانومتر.
    ملاحظة: من الأفضل أداء في مقايسة السمسة بالتوازي مع intracellشاشة ular باستخدام نفس الدفعي وعمر THP-1 الخلايا.

5. في ومرق تحليل آخر باستخدام ريسازورين الفحص 3

  1. تنمو السل M. في 7H9ADST إلى مرحلة منتصف السجل (~ 0،5-0،8 OD 600). تمييع الثقافة مع 7H9ADST إلى 0.01 OD 600. تمييع المركبات في 7H9ADST إلى 2x تركيزات الاختبار وقسامة 100 ميكرولتر من كل مجمع المخفف في كل بئر.
  2. نقل 100 ميكرولتر من تعليق البكتيرية مخففة في كل بئر. السماح لوحات لاحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب لمدة 5 أيام. حل 10 ملغ من ريسازورين في 100 مل من الماء منزوع الأيونات وتصفية العقيمة.
  3. إضافة 30 ميكرولتر من محلول ريسازورين ورصد تغير اللون بعد 48 ساعة. يشار نمو البكتيريا عن طريق تحويل اللون من الأزرق إلى اللون الوردي.
    ملاحظة: يمكن أيضا إجراء تحليل الكمي عن طريق قياس إما مضان في 590 نانومتر مع الإثارة في 530-560نانومتر أو الامتصاصية في 570 نانومتر و 600 نانومتر (15).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الإنتاجية العالية فحص الخلايا باستخدام M. السل التعبير عن الجينات وسيفيراز

الشكل 2A والجدول 1 يحتوي على البيانات الخام التي تم جمعها من قبل luminometer، أعرب في وحدات الانارة النسبية (RLU)، والتي تبين تأثير تركيز المتزايد للريفامبيسين المخدرات TB على M. السل داخل THP-1 الخلايا. الشكل 2A هو مؤامرة مبعثر من التألق الخام تقاس RLU لتركيزات مختلفة من ريفامبيسين. أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM). ويبين الشكل 2B انخفاض في المئة في التألق في الآبار التي تمت معالجتها مقارنة مع الآبار غير المعالجة. وتظهر البيانات أن ريفامبيسين قادر على خفض> 99.9٪ من RLU من الخلايا السل M. بتركيز 0.1 ميكروغرام / مل. هذا هو وفقا لpreviouslنشرت ذ MIC بين 0.1 و 0.4 ميكروغرام / مل 16. التلألؤ المنتجة في كل بئر هو دلالة على وسيفيراز الكلي الذي أعرب عنه M. السل ومؤشرا لحالة التمثيل الغذائي السل M. داخل البئر الآن. فمن الطبيعي لمستويات الانارة الخام لتختلف بين التجارب. على هذا النحو، فإن المقارنة بين البيانات الخام تولد نتائج غير موثوق بها. وبالتالي، ينبغي تطبيع البيانات ضد سيطرة سلبية محددة، والتي ستكون العينات تعامل مع DMSO فقط. ويمكن التعبير عن القيم الناتجة كما خفض في المئة في M. السل في الآبار (الشكل 2B).

تحليل السمية الخلوية باستخدام فحص MTT

فحص MTT هو مقايسة راسخة لسمية الخلايا حقيقية النواة. هذا الاختبار اللونية يشير الخلايا الحية من خلال تحويل MTT (الصفراء) لformazan الأرجواني اللون. يتم إجراء هذا الاختبار دون وجود عدوى السل M. لأن البكتيريا قادرة على تأييض MTT، مما يقلل من سمية المرصودة من المركبات. اقتراح مشترك لفحص MTT هو استخدام وسائل الإعلام دون مؤشر الرقم الهيدروجيني الفينول الأحمر بسبب امتصاص عند 570 نانومتر (17). ومع ذلك، فإن استخراج العازلة المحمضة وصفها في هذه الطريقة هي قادرة على تقليل التداخل الذي تسببه الفينول الأحمر 17.

ويوضح الشكل 3 السمسة الناجمة عن زيادة تركيز اختبار مركب G1-1H مشفرة. عادة، يتم توظيف تركيز مثبط 50٪ (IC 50) لتحديد مستوى السمية الخلوية. في حالة G1-1H، تركيزات من 10 ميكرومتر و 3 ميكرومتر بشكل واضح دون تركيز IC 50.

في ومرق تحليل النشاط لناجي الفحص ريسازورين

يستخدم فحص ريسازورين عادة لتحليل للخلايا في الخلايا حقيقية النواة، ولكن يمكن أن تستخدم أيضا لمراقبة البكتيريا الحية في مرق 3. فحص ريسازورين هو مقايسة على أساس الأكسدة مماثل لفحص MTT. أنه يقيس مستويات NADPH وNADPH النشاط نازعة من خلال تحويل ريسازورين إلى resorufin، وfluorophore الأحمر. الطريقة الأسهل والأسرع لتحديد فعالية الدواء هو للبحث عن أدنى تركيز العلاج حيث لا تزال الآبار زرقاء اللون. ويبين الشكل 4 جزء من لوحة 96-جيدا تظهر آثار تركيزات مختلفة من أبراميسين المضادات الحيوية لها على ريسازورين التحويل عن طريق M. السل. تم تحديد MIC في مرق ما بين 2.5 و 5 ميكروغرام / مل. وهذا هو أعلى قليلا من القيمة التي تم نشرها مسبقا من 1.5 ميكروغرام / مل 18، لكنه لا يزال جيدا داخل acceptabلو النطاق. في كثير من الحالات، وتغيير اللون بشكل تدريجي بدلا من ذلك، ولذلك فمن الصعب اتخاذ قرار واثق. في ظل هذه الظروف، فمن الأفضل لتحديد الكمية الفعلية للريسازورين التحويل باستخدام إما الامتصاصية أو مضان. ويرجع ذلك إلى الخصائص الامتصاصية مماثلة من ريسازورين وresorufin، تقرير هيئة التصنيع العسكري باستخدام الامتصاصية يتطلب قياسات باستخدام اثنين من أطوال موجية مختلفة والعمليات الحسابية المعقدة 15. ولذلك، فإن أفضل طريقة لقياس مضان باستخدام 530- 560 نانومتر موجات الإثارة والطول الموجي انبعاث 590 نانومتر، كما هو موضح في الأدب الشركة المصنعة 15.

ويوضح الشكل 4 مصدرا محتملا للتناقض المرتبطة حضانات أياما عدة يمكن أن يغير بشكل جذري نتائج الفرز. بسبب الرطوبة غير لائق لل37 ° C حاضنة المستخدمة في هذه التجربة، والآبار على حواف ع عانى المرحومين أكبر بكثير من التبخر. ومن المفترض أن كل 15 بئرا المعالجة DMSO أن تكون متطابقة، ولكن قد الآبار على طول الحواف اليسرى وأعلى انخفاض أحجام التداول. تظهر هذه الآبار أيضا لدينا ألوان مختلفة من غيرها من الآبار المعالجة DMSO في منتصف اللوحة. ويمكن أيضا نفس التناقض أن تراعى في 2.5 ميكروغرام / مل الآبار المعالجة أبراميسين. في هذه الحالة، فإن انخفاض حجم يؤدي أيضا إلى قراءة الكمية التي كتبها معمل والتألق. تبخر يصبح كبيرا لجميع التجارب مع أوقات حضانة طويلة، لذلك يجب توخي الحذر للحفاظ على حاضنات مرطب جيد لتجنب هذا المصدر من التناقض.

شكل 1
الشكل 1: طريقة الخطط. رسم بياني يصور الخطط فحص لمدة 3 وحدات منفصلة من نظام الفرز الإنتاجية العالية. _upload / 55273 / 55273fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: الممثل بيانات من بين الخلايا لدراسة فعالية الريفامبيسين في القضاء على مرض السل M. داخل THP-1 الخلايا. (A) رسم بياني لمتوسط قراءة التلألؤ (في وحدات التلألؤ النسبية) لكل تركيز العلاج (ريفامبيسين). أشرطة الخطأ دلالة على الخطأ المعياري للمتوسط ​​لكل ثلاث نسخ. (B) رسم بياني لخفض المئة المحسوبة في التألق الذي يسببه علاج ريفامبيسين، حيث تشير قيم أعلى قدر أكبر من الفعالية. تركيز مثبط 90٪ (IC 90) في هذه الحالة هو في مكان ما بين 0.01 و 0.1 ميكروغرام / مل.ناغورني كاراباخ "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): الممثل البيانات من الفحص السمسة (MTT) لدراسة التأثيرات السمية للG1-1H مجمع على المتباينة THP-1 الخلايا. الرسم البياني لحساب "في المئة من السيطرة" القيم لكل تركيز G1-1H مجمع العلاج، حيث تشير القيم العليا صحة THP-1 الخلايا. وIC 50 في هذه الحالة هو في مكان ما بين 10 و 30 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: بيانات تمثيلية من ريسازورين الفحص لفحص Effectiveness من أبراميسين في تثبيط M. السل في ومرق. يتم جمع البيانات النوعية الوحيد في هذه الحالة بسبب القيود المعدات في 3 (BSL3) مختبر مستوى السلامة الحيوية. تبين الصورة جزء من لوحة 96-جيدا تحتوي على M. السل تعامل مع أي DMSO أو كميات متفاوتة من أبراميسين. الآبار المعالجة DMSO عرضت على تحويل ريسازورين إلى resorufin، كما يدل على ذلك تحويل اللون من الأزرق إلى اللون الوردي. العينات المعالجة أبراميسين خضع بوضوح تحويل لون أقل من 5 ميكروغرام / مل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

د> متوسط
[ريفامبيسين] REP1 Rep2 Rep3 ٪ اختزال
4 ميكروغرام / مل 184 190 210 195 100
1 ميكروغرام / مل 244 215 159 206 100
0.1 ميكروغرام / مل 1037 731 976 915 98
0.01 ميكروغرام / مل 19200 24400 23919 22506 54
0 ميكروغرام / مل 39877 49655 57728 49087 0

الجدول 1: البيانات الخام من فحص وسيفيراز لتحديد الخلايا IC 90 من ريفامبيسين.

س: المحافظة على مع next.within صفحة = "دائما">
[G1-1H] النائب 1 A570 مندوب 2 A570 النائب 3 A570 متوسط A570 ٪ من دون علاج
30 ميكرومتر 0.056 0.056 0.055 0.056 7
10 ميكرومتر 0.518 0.488 0.492 0.499 62
3 ميكرومتر 0.652 0.638 0.656 0.649 80
0 ميكرومتر 0.822 0.782 0.815 0.806 100

الجدول 2: البيانات الخام من MTT الفحص لتحديد من السمسة اختبار مجمع G1-1H في احالإقليم الشمالي التركيزات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وكان الهدف من هذه الدراسة هو إيجاد طريقة HTS بسيطة وفعالة من حيث التكلفة باستخدام نموذج العدوى داخل الخلايا البشرية لM. السل. والسل هو مرض يصيب الإنسان تتميز إصابة الضامة السنخية التي كتبها M. السل. بسبب قضايا السلامة الأحيائية، وقد استخدم البحوث التي تنطوي على النماذج البيولوجية لكل من البكتيريا والخلايا المضيفة في الماضي. ومع ذلك، فقد تبين أن استخدام البكتيريا البديلة ونماذج غير البشرية لا تنبئ الفقيرة من نجاح الكر إلى المبادرة في تطوير الأدوية، مشيرا إلى أن فحص المخدرات من الأفضل القيام مع الخلايا البشرية بفيروس السل م 19، 20، 21، 22.

في هذه الطريقة، لدينا متقدمة وتكييفها البروتوكولات الحالية للدولة من بين الفن فحص للTHP-1 خلية خط مثل بلعم البشري. من أجل تحقيق عاليةالإنتاجية، قدمنا ​​العديد من التحسينات التقنية للبروتوكول العدوى. أولا وقبل كل شيء، نحن استبدال جميع الخطوات المتبعة في تحديد كفو واستبداله عليها مع نظام مراسل القائم على وسيفيراز. وقد تم اختيار اليراع وسيفيراز بسبب بسيط فحص نقطة النهاية، والتحلل السريع من الانزيمات الخلية المضيفة يحلول، ومتطلبات الحد الأدنى من المعدات. القضاء هذا الاستبدال بشكل فعال فترة الحضانة لمدة 30 يوما، وكذلك تكاليف العمالة والمواد الاستهلاكية المرتبطة الطلاء ومستعمرة العد الخطوات.

وكان تحسنا كبيرا الثاني قدمنا ​​تجهيز دفعة والعدوى، الأمر الذي يزيد من تحسين الإنتاجية والاتساق بين الآبار مع بروتوكول إصابة أكثر بساطة. من خلال الجمع بين التمايز وإصابة الخطوات إلى خطوة واحدة، كنا قادرين على تقصير بروتوكول بيوم واحد. وفي الوقت نفسه، كنا قادرين على الحد من الجولات الثلاث من الغسيل التي يمكن أن تحدث عادة بين التمايز وinfectioن، وهو مصدر من احتمال فقدان خلايا THP-1 بسبب انفصال.

وقد تم تطوير هذا البروتوكول لفحص داخل الخط خلية THP-1، الذي يمنح العديد من المزايا. THP-1، باعتبارها خط الخلية مخلد، يمكن أن يكون مثقف بشكل صحيح في المختبر لأكثر من 20 ممرات 23. وهذا أمر مهم خاصة بالنسبة للحملات فحص كبيرة، حيث يمكن أن يكون تحديا للحفاظ على خلايا كافية لتوفير الإعداد الإنتاجية العالية. بالإضافة إلى ذلك، اختبار في THP-1 يوفر خلفية وراثية متجانسة أن يقلل من التباين في النتائج. وهذا مفيد للغاية لمركبات الاختبار التي تؤثر على استجابات الخلايا المضيفة (10). اضاف باعتبارها مكافأة، التعبير الجيني في خط الخلية THP-1 يمكن أن يكون تنظيم أسفل من الرنا التدخل الصغيرة (الرناوات siRNAs) 24. وهذا يوفر أداة قيمة لالتحقيقات المصب في طريقة عمل مركبات ضرب. على الرغم من أن هذه الطريقة صممت باستخدام THP-1 خط الخلية، فإنهيمكن تكييفها بسهولة للخلايا الإنسان الأساسية، مثل خلايا الدم وحيدات النوى الطرفية (PBMC)، كما سبق ان عرضه 10.

لمحاكاة أفضل التفاعل الفعلي بين الضامة السنخية وM. السل، ويشمل البروتوكول فحص الخلايا خطوة ليستطهي البكتيريا. طهاية مع المعاطف مصل الإنسان M. السل وتسهل دخول الخلية عن طريق تكملة مستقبلات 3 (CR3) 25. هم أكثر عرضة لدخول الضامة عبر مستقبلات كتين 8 البكتيريا المجردة. وبالنظر إلى أن السائل الشعبى المعروف أن تحتوي على مكونات المصل البشري 25، طهاية، أو عدم وجودها، قد يكون لها تأثير جوهري على نتائج الفحص. ومع ذلك، قد تختار بعض لتخطي هذه الخطوة من أجل زيادة تبسيط عملية العدوى 16، أو أنه قد لا يكون من الممكن الحصول على المصل البشري بما فيه الكفاية نظرا لحجم لىbrary يجري فحص 11.

ويشمل فحص الخلايا خطوة لإزالة جميع السوائل التي تحتوي على مواد غير مرتبط من الآبار قبل إضافة كاشف وسيفيراز. تم تصميم هذه الخطوة لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء مع تقليل الكمية المستخدمة كاشف لكل بئر. ومع ذلك، فإن إدراج هذه الخطوة قد تؤدي بيانات إيجابية كاذبة للمركبات التي تقتل THP-1 ولكن ليس M. السل، منفصلة منذ ذلك الحين وهي lysed أن THP-1 وخالية من السل العائمة M. إزالتها. لذا، ينبغي اتباع بروتوكول الشركة المصنعة اقترح إضافة كميات متساوية من كاشف وسيفيراز (100 ميكرولتر) إلى كل بئر من أجل مقايسة لM. بقاء السل في الآبار التي تحتوي على مركبات سامة للخلايا.

وعلى النقيض من النظام يراعة luciferase، لا يتطلب نظام لوكس البكتيرية الكواشف الخارجية لتوليد إشارة 26. ومع ذلك،ويفضل النظام يراعة على النظام لوكس للأسباب التالية: أولا، النظام البكتيري قد تكون سامة في المتفطرات 26. ثانيا، نظام مراسل أكثر تعقيدا (5 جينات لوكس مقابل 1 جين اليراع) هي أكثر عرضة للإشارة إلى تثبيط من مركبات الاختبار. وأخيرا، الكواشف المتاحة تجاريا للمقايسة يراعة luciferase توفر الظروف اللازمة لتوليد إشارة الأمثل. من ناحية أخرى، يعتمد نظام وسيفيراز البكتيريا على إنتاج ATP والعوامل المساعدة الحالية داخل البكتيريا لتوليد إشارة. هذه يمكن أن تختلف بين العلاجات المختلفة وليست سهلة كما السيطرة عليها. ولذلك، فإن إضافة كاشف وسيفيراز لنظام يراعة توحد ظروف التفاعل وتوفر قياسات أكثر موثوقية من luciferase النشاط في جميع العلاجات.

وقد يكون تقرير CFU طويلة المعيار الذهبي لقياس كثافة البكتيرية. في العقد، bioluminescence، مثل معظم المراسلين، ليست مقياسا مباشرا من البكتيريا. بدلا من ذلك، RLU هي وظيفة كل من كفو والدولة التمثيل الغذائي للبكتيريا. وقد أثبتت الآخرين العلاقة معظمهم خطية بين RLU وكفو عن المتفطرات إضاءة الحيوية في ظل ظروف محددة 5. في أي حال، وانخفاض كبير في إشارة وسيفيراز الفحص، بغض النظر عن سبب الكامنة الأخرى من تثبيط انزيم الفعلي للوسيفيراز النشاط من شأنه أن يشير إلى وجود انخفاض في لياقة بدنية السل M. داخل الخلية المضيفة. ولذلك، فإن هذه المركبات تكون ذات فائدة من الناحية فحص المخدرات، وينبغي ألا تستبعد في تطوير الأسلوب.

بديل لبروتوكول فحص الخلايا القائم على وسيفيراز هو الآلية الفلورسنت القائم على الفحص المجهري نهج 11 و 27 و 28 و 29. ووسيفيرازيتم قياس الناتج فحص من قبل luminometer، والبيانات التي تم الحصول عليها هو الكمي، في حين المجهر الفلورسنت يولد الصور التي هي النوعية. ومع ذلك، من خلال برمجة الكمبيوتر ذكية، يمكن تحليل الصور لتوليد البيانات الكمية. وعلاوة على ذلك، يسمح المجهر الفلورسنت fluorophores متعددة لاستخدامها في وقت واحد، وهو أمر مفيد جدا لجمع المعلمات قيمة مثل بقاء الخلية، عدد الخلايا، والمعدل الفعلي للعدوى. كما يمكن للمرء أن يتنبأ، هذه الفوائد تأتي مع بعض النكسات. الاستثمار الأولي على المعدات المجهر الفلورسنت الآلي عدة مرات أكبر من تكلفة luminometer أو التألق وبالتالي فهي بعيدة عن متناول العديد من المعامل البحثية. بالنسبة لأولئك الذين لديهم إمكانية الوصول إلى المعدات، يجب النظر في تجهيز العينات قبل الحصول على الصور وتحليل البيانات. تؤثر هذه الخطوات اثنين من استثمار الوقت بشكل عام مع زيادة في حجم المكتبة. إدراج العلامات الفلورية إضافية في الخلايا المضيفة اشتراطاتوفاق خطوات تثبيت، وتلطيخ، والغسيل، مما يستلزم استثمارات إضافية تدخل المستخدم والوقت. وعلاوة على ذلك، فلوري جمع البيانات المجهري والتحليل، وعلى الرغم من أن المؤتمتة، لا يزال يتطلب مزيدا من الوقت والموارد من بسيطة قراءات وسيفيراز الفحص. ولذلك، فإن طريقة الفرز داخل الخلايا استنادا مراسل وسيفيراز هو أبسط وقادرة على أعلى إنتاجية.

طريقة فحص الخلايا القائم على وسيفيراز ديه الحد واحد كبير بالمقارنة مع طرق الفحص المعتمدة على المجهر الفلورسنت. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن فحص وسيفيراز يوفر أي بيانات عن الحالة الصحية للالضامة المضيف هذا. أن المركبات السامة للخلايا يسبب وفاة الضامة، ويمكن أن يتم الافراج بالتالي البكتيريا الحية في المتوسط ​​ولن تسهم في إشارة luciferase الفحص النهائي. ونتيجة لذلك، على ما يبدو المركبات السامة للخلايا أن يسبب وفاة السل M. داخل الخلايا وبالتالي generatعصام عدد كبير من ايجابيات كاذبة. ولمعالجة هذه المسألة، ونحن قد استكملت أسلوبنا مع فحص MTT لتقييم السمية الخلوية من المركبات على الضامة المضيف. هذه الوحدة طريقة الفحص يعطينا معلومات إضافية حول drugability من المركبات ذات الأهمية، ويسمح القضاء في وقت مبكر من المرشحين أقل من مثالية المخدرات.

بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن أيضا استخدام فحص الخلايا القائم على وسيفيراز قبل إجراء الفحص المجهري الفلورسنت الآلي. في شاشات المكتبات مجمع كبيرة، وهذا يسمح لتقييم سريعة وفعالة من فعالية مركب في نموذج العدوى بلعم. ونتيجة لذلك، المجهر الفلورسنت الآلي يمكن حجز للدراسات مفصلة عن أفضل المرشحين، كما يتضح من الدراسة التي نشرت سابقا 11.

تكلفة منخفضة وطبيعة بسيطة من داخل الخلايا مقايسة على أساس وسيفيراز أيضا تستفيد كثيرا من الباحثين الذين يرغبون في اختبار صغيرةإيه المكتبات الكيميائية. وعموما، أثبت فحص الخلايا القائم على وسيفيراز أن تكون أداة مرنة للغاية للمختبرات الأبحاث من جميع الكوادر ولفحص المشاريع من مختلف الأحجام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R5886
L-glutamine Sigma-Aldrich G7513
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 12483020
Middlebrook 7H9 Becton, Dickinson and Company 271210
Tween80 Fisher Scientific T164
Albumin, Bovine pH7 Affymetrix 10857
Dextrose Fisher Scientific BP350
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358
kanamycin sulfate Fisher Scientific BP906
PMA Sigma-Aldrich P8139
MTT Sigma-Aldrich M2128
N,N-Dimethylformamide (DMF) Fisher Scientific D131
1 M Hydrocholoric acid (HCl) Fisher Scientific 351279212
Acetic acid Fisher Scientific 351269
SDS Fisher Scientific BP166
Resazurin Alfa Aesar B21187
DMSO Sigma-Aldrich D5879
Glycerol Fisher Scientific BP229
THP-1 American Type Culture Collection TIB-202
M. tuberculosis H37Rv
96-well flat bottom white plate Corning 3917
95-well flat bottom clear plate Corning 3595
Transparent plate sealer Thermo Fisher Scientific AB-0580
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Biomate 3
Microplate spectrophotometer Biotek Epoch
luminometer Applied Biosystems Tropix TR717

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Global tuberculosis report 2015. , WHO. (2016).
  2. USFDA. FDA news realease. , Available from: http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm (2012).
  3. Yajko, D. M., et al. Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).
  4. Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).
  5. Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).
  6. Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).
  7. Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1, 57 (2010).
  8. Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis. Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).
  9. Ramon-Garcia, S., et al. Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen. Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).
  10. Lam, K. K., et al. Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog. 8, e1002691 (2012).
  11. Sorrentino, F., et al. Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).
  12. Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62, 158-165 (2009).
  13. ATCC. THP-1 (ATCC TIB-202). , Manassas. https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx (2016).
  14. Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).
  15. Invitrogen. AlamarBlue assay. , Invitrogen. (2008).
  16. Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction. Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).
  17. Riss, T. L., et al. Cell Viability Assays. , (2004).
  18. Meyer, M., et al. In vivo efficacy of apramycin in murine infection models. Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).
  19. Ballell, L., et al. Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis. ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).
  20. Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice. FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).
  21. Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).
  22. Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B. Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).
  23. Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , Springer International Publishing. 147-159 (2015).
  24. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. J Vis Exp. , e51960 (2014).
  25. Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid. Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).
  26. Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria. PLoS One. 5, e10777 (2010).
  27. Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. , e51114 (2014).
  28. Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5, e1000645 (2009).
  29. Pethe, K., et al. Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis. Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).

Tags

عدوى، العدد 122،
نظام لفعالية والسمسة فحص مثبطات استهداف بين الخلايا<em&gt; المتفطرة السلية</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zheng, X., Av-Gay, Y. System forMore

Zheng, X., Av-Gay, Y. System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (122), e55273, doi:10.3791/55273 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter