Summary
我々は、細胞内および細胞内のブロス増殖する細菌、ならびに哺乳動物宿主細胞に対する細胞毒性を標的、 結核菌に対する新規化合物を発見するためのモジュラーハイスループットスクリーニングシステムを開発しました。
Introduction
結核菌 、結核（TB）の原因物質は、世界中の罹患率と死亡率の主要な原因です。薬物感受性TBは、6ヶ月の期間にわたって複数の抗生物質を必要とする治療可能な疾患です。治療可能な疾患であるにもかかわらず、結核死亡率は、2015年1における150万と推定されました。過去10年間で、薬剤耐性結核の有病率に対する懸念が高まっています。多剤耐性結核（MDR-TB）は、少なくともイソニアジド（INH）、及びリファンピシン（RMP）、最もMDR-TB株は、このように治療の選択肢を制限する、第二のラインTB薬を選択することも耐性があるに耐性のあるTBのように定義されます。薬剤耐性の効果は、患者のヒト免疫不全ウイルス（HIV）で同時感染を治療するために大きな課題を作成します。 40万患者は世界中で2015 1でHIV関連結核で死亡しました。残念なことに、米国食品医薬品Administ配給は、過去40年間2に、MDR-TB、bedaquilineに対する唯一の新しい結核治療薬を承認しました。より良いと短いTBの治療法を見つけるの進歩が緊急TBとMDR-TBとの戦いに先に滞在するために必要とされています。
伝統的に、TB薬物スクリーニングは、化合物が成長している培養物に添加し、微生物を根絶におけるそれらの有効性は、固体培地上のコロニー形成単位（CFU）をカウントすることによって決定されることにより、増殖培地中でインビトロ増殖条件下で行われます。 CFU数は労働集約的、時間がかかり、かつ高価であるように、様々な間接的な方法は、この問題を軽減するために開発されています。そのような方法は、アラマーブルー生存率アッセイ3、緑色蛍光タンパク質（GFP）またはルシフェラーゼを発現する細菌からの発光5からの蛍光4の決意、および全アデノシン三リン酸の推定（Aを含みますTP）6、7。
典型的なTBは、細菌は肺胞マクロファージ8のファゴソーム内部に存在し、複製肺の結核菌の感染によって特徴付けられます。シンプルな中ブロス表現型の画面は、細胞外病原体に合うこと。しかし、歴史的な観点では、この方法を用いて同定された結核菌に対する化合物は、多くの場合、感染モデルにおける下流の検証ステップの間、期待に応えるに失敗ヒット。私たちは、結核治療薬は、最高の細胞内宿主細胞の感染モデルで実行されていることを提案します。それにも関わらず、細胞内のモデルは、ハイスループットスクリーニング（HTS）の開発に多くの技術および生物学的障壁を保有します。大きなハードルは多くの工程と洗浄の間で-による細胞外細菌の精巧な除去によって例示される、感染プロセスの複雑さです。第二の主要なハードルは、長い時間の再ですquirementsは、通常CFU培養プレート上でカウントすることによって行わ増殖検出として、完了するまでに3週間以上を要するプロセスです。 CFUカウントを交換する1つの解決策は、蛍光細菌との組み合わせで自動化された蛍光顕微鏡によって提供されています。しかし、この解決策は、多くの研究室のための手の届かないところにある初期の設備投資が必要となります。シンプル、低コスト、および疾患関連HTS方法を大幅に創薬プロセスを高めるであろう。
本研究では、細胞内の結核菌に対する化合物の活性を決定するのに適した、迅速、かつ拡張性の高い、まだ経済的、アッセイを提供することを目的とする新しい、モジュラーHTSシステムを報告しています。 （I）細胞内、（ii）の細胞毒性、および（iii）中のブロスアッセイ：このシステムは、三つのモジュールから構成されています。合わせた最終的な結果は、作用の潜在的なモードなどの追加情報と、化合物の特性の包括的な説明を提供します。このSCreeningシステムは、薬物相乗作用9の分析、オートファジー10の刺激、および結核菌 -secreted毒性因子（未発表）の阻害を含む作用機序を標的とする様々な化合物ライブラリー、といくつかのプロジェクトで使用されてきました。アクションの未知のモードの化合物はまた、11を研究されています。この方法の修正版は、細胞内結核菌 11に対して新規な化合物を同定するための一次スクリーニング法としての産業パートナーによって採択されました。
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Protocol
1.菌株および増殖培地
- ウシ血清アルブミン、デキストロース10.0gを、脱イオン水の460 mLの塩化ナトリウムの4.05グラムの25グラムを溶解することによってアルブミンデキストロースおよび塩のストック溶液（ADS）を作ります。 4℃でのADS及びストアをフィルター滅菌します。
- 7H9粉末4.7gの精製水900 mLでのグリセロールの2ミリリットルを添加することにより、7H9ブロスを作ります。 10分間121℃で7H9ブロスをオートクレーブし、それが進行する前に、室温まで冷却することを可能にします。 ADS 100mLおよび7H9ブロス900mLのにTween80を0.5ミリリットルを添加することによって7H9ADSTを作ります。 4°Cで保存。
- 硫酸カナマイシン50mgを秤量し、脱イオン水1mLに溶解します。最終濃度は50mg / mLです。フィルター滅菌し、-20℃で保存。 7H9ADSTの1リットル当たりのカナマイシンストック溶液0.5mlを加えます。
注：この培地はとてもボリュームを拡張適切培養サイズに応じて、新鮮されるべきです。 - 7Hに結核菌を育てます9ADSTは文化を立っ中でカナマイシンを補いました。毎日文化を振ると、OD600が凝集を避けるために、1.0に到達する前にそれを希釈します。
注：この方法の開発のために使用されるヒト結核菌株は、菌H37Rv pJAK2.Aプラスミド12で形質転換しました。 pJAK2.Aは、HSP60プロモーターからホタルルシフェラーゼ遺伝子の高レベル発現を可能にし、カナマイシンを使用して選択することができるpMV361ベクターに基づく組込みプラスミドです。
2. THP-1培地とメンテナンス
- （FBSおよび2mMグルタミン約10％）RPMI不完全培地を作製するために、熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）の50 mLおよびRPMI 1640を500mLの200mMのL-グルタミンを5mLを加えます。
- 標準的プロトコール13に従ってTHP-1細胞の培養を維持します。 PASの間に0.2培地1mL当たり100万の細胞密度を維持しながら簡単に説明すると、RPMI不完全培地中のTHP-1細胞を増殖させます賢人。
ルシフェラーゼ発現ヒト結核菌H37Rvを用い3.ハイスループット細胞内スクリーニング
- 波長600nmで分光光度計で活発に増殖する細菌懸濁液の光学密度を測定します。ミリリットル当たり0.1 OD 600 = 3×10 7細菌の換算係数を使用して、細菌密度を計算します。
- 新しい遠心管に10：1の感染の多重度のために十分な細菌（MOI）を行うピペット。 10分間3,000×gでペレット化し、液体を吸引。 RPMI1640の450μLにヒト血清の50μLを追加します。実験の値を適切にするボリュームをスケール。
- 細菌をオプソニン化するために、10％ヒト血清を含有するRPMI1640 500μLあたり1×10 8の細菌の密度でペレットを再懸濁します。混合物を30分間37℃でインキュベートすることを可能にします。血球計および反転microscoで計数することによりTHP-1細胞の培養密度を決定PE。
- 100×gでの滅菌遠心管中の細胞をペレット化し、10分間37°C。上清を吸引し、ミリリットル当たり100万個の細胞の密度で、不完全RPMI中に細胞を再懸濁。 40 / mlの最終濃度までホルボール-12-ミリステート-13-アセテート（PMA）を加えます。
注：これは分化ミックスと呼ぶことにします。 - オプソニン化結核菌は、10のMOIでのTHP-1分化混合物と結合：1、96ウェル平底白色プレートにウェル当たり100μLの最終ミックスのアリコート。定期的に均一性を確保するために、混合物を攪拌。分化および感染は5％CO 2を含む加湿インキュベーター中で37℃で一晩進行させます。
- RPMI各100μLでウェルを2回洗浄します。不完全RPMI中で所望の濃度に希釈した化合物を添加し、3日間インキュベートします。
- ウェルから培地を吸引除去します。各ウェルにルシフェラーゼアッセイ試薬の50μLを追加します。 Tでプレートをシールransparent接着プレートシーラー。 22℃でのインキュベーションの5分を許可した後、ウェルあたり1秒でルミノメーターで読み出しを得ます。
3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイ14を使用4.細胞毒性分析
- 不完全な透明な96ウェルプレートにPMAの40 / mlのを補充したRPMI中でTHP-1細胞に分化します。ウェル当たりミリリットル当たり100万、アリコート100μLの細胞密度を維持します。分化は、5％のCO 2を含む加湿インキュベーター中で37℃で一晩進行させます。
- ウェルに不完全なRPMIで希釈した化合物を加えるウェルから培地を吸引除去し、RPMI 1640で二回洗って。 3日間インキュベートします。
- 5mg / mlのストック溶液を作製するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）100mLにMTT 0.5gを溶かします。離れた光から-20℃で滅菌フィルターとストア、。それは、このソリューションは、新鮮な作るのがベストです。
- 2.5時間beforE 3日間の潜伏期間の終わりには、各ウェルにMTT溶液25μLを追加し、潜伏期間を完了します。
- 50％のNを準備し、N個のジメチルホルムアミド（DMF）250mLの脱イオン水とDMFの250ミリリットルを混合することによって。
- 次のようにMTT抽出緩衝液を調製：500mLの瓶にSDSを100gを秤量し、50％のDMF 300 mLを加え。 SDSを溶解させるために、低熱を適用します。純粋な酢酸10mlおよび1MのHCl 12.5 mLを加え。 50％のDMFと500mLのマークに埋めます。抽出緩衝液の最終組成は、50％DMF、20％SDS、2.5％酢酸、2.5％1 M塩酸です。
- 処置期間の終わりに、各ウェルに（任意の結晶を溶解するために45℃に加温し）抽出緩衝液100μLを加えます。混合物を37で一晩インキュベートすることを許可します 5％CO 2を含む加湿インキュベーター内℃です。 570 nmの吸光度を読みます。
注：細胞毒性アッセイは、最良のセル内と並行して行われますウラル画面THP-1細胞の同じバッチと年齢を使用しました。
レサズリンアッセイ3を使用して、ブロス活性分析5.
- （ - 0.8 OD 600〜0.5）対数中期に7H9ADSTに結核菌を成長させます。 0.01 OD 600に7H9ADSTと文化を希釈します。各ウェルに各希釈した化合物の試験濃度及びアリコート100μLを2倍する7H9ADSTで化合物を希釈します。
- 各ウェルに希釈した細菌懸濁液100μLを移します。プレートを5日間、加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートすることを可能にします。脱イオン水および滅菌フィルタ100mLにレサズリン10mgを溶解します。
- レサズリン溶液を30μLを加え、48時間後に色の変化を監視します。細菌増殖はピンクに青から色変換によって示されます。
注：定量分析もまた530での励起と共に、590nmでの蛍光のいずれかを測定することによって行うことができる - 560nMもしくは570 nmの吸光度と600nmで15。
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Representative Results
ルシフェラーゼ遺伝子を発現結核菌を用いた高スループットの細胞内スクリーニング
図2Aと表1はルミノメーターによって収集された生データを含む、THP-1細胞内の結核菌に対するTB薬物リファンピシンの濃度の増加の効果を示し、相対発光単位（RLU）で表しました。 図2Aは、リファンピシンの様々な濃度のためRLUで測定された生の発光の散布図です。エラーバーは平均の標準誤差（SEM）を示します。 図2Bは 、未処理ウェルと比較して、処理したウェルにおける蛍光のパーセント減少を示します。データは、リファンピシンは0.1μgの/ mLの濃度で細胞内結核菌からのRLUの> 99.9％を低減することが可能であることを示しています。これはpreviouslに従ったものですyは0.1と0.4 / mlの16との間にMICを発表しました。各ウェルにおいて産生さ発光は、 結核菌によって発現される総ルシフェラーゼの指標であり、従って、ウェル内の結核菌の代謝状態の指標です。生の発光レベルは、実験の間で変動するのは正常です。そのため、生データの比較は、信頼性のない結論を生成します。したがって、データは、DMSOのみで処理した試料であろう定義された陰性対照に対して正規化されるべきです。結果の値は、ウェル中の結核菌の減少率（ 図2B）のように表すことができます。
MTTアッセイを用いて細胞毒性分析
MTTアッセイは、真核生物の細胞毒性のために十分に確立アッセイです。この比色アッセイは、MTT（黄色）の変換に至る生細胞を示します紫色のホルマザン。細菌は、化合物の観察された毒性を低減MTTを代謝することが可能であるので、このアッセイは、 結核菌感染なしで行われます。 MTTアッセイのための一般的な提案は、570 nmの17で吸収によるpH指示薬フェノールレッドを含まない培地を使用することです。しかし、この方法に記載酸性化抽出緩衝液は、フェノールレッド17による干渉を最小化することができます。
図3は、試験化合物符号化G1-1H濃度の増加によって引き起こされる細胞毒性を示します。通常、50％阻害濃度（IC 50）は、細胞毒性のレベルを示すために使用されます。 G1-1Hの場合には、10μM及び3μMの濃度は、IC 50濃度未満明らかです。
ではブロス活性分析たちレサズリンアッセイをINGの
レサズリンアッセイは、一般に、真核細胞における細胞毒性の分析のために使用されるが、また、培養液3で生菌を監視するために使用することができます。レサズリンアッセイは、MTTアッセイと同様の酸化還元に基づくアッセイです。それはレゾルフィン、赤の蛍光団にレサズリンの変換によりNADPHレベルとNADPHデヒドロゲナーゼ活性を測定します。薬の有効性を決定する最も簡単かつ最速の方法は、ウェルが青色で残る最低の処理濃度を探すことです。 図4は、抗生物質アプラマイシンの効果様々な濃度は、 結核菌によるレサズリン変換に与える示す96ウェルプレートの一部を示しています。インブロスMICは2.5および5μg/ mLの間であると決定されました。これは、1.5μgの/ mLの18の以前に公表された値よりも若干高いですが、それはうまくacceptab内にありますル範囲。多くの場合、色の変化はかなり緩やかなので、自信を持って決意をすることは困難です。これらの条件下では、吸光度または蛍光のいずれかを使用してレサズリン変換の実際の量を定量化することをお勧めします。レサズリン及びレゾルフィン、MIC決意吸光度を用いて同様の吸収特性に二つの異なる波長および複雑な計算15を用いた測定を必要とします。したがって、最善の方法は、製造業者の文献15に記載されているように、530- 560-nmの励起波長および590 nmの発光波長を用いて蛍光を測定することです。
図4は、大幅スクリーニング結果を変化させることができる複数日のインキュベーションに関連付けられた矛盾の潜在的な供給源を示します。これ実験に用い、37℃のインキュベーターの不適切な加湿、Pの縁上のウェルに latesは、かなり多くの蒸発を負いました。全15 DMSO処理したウェルは、同一であることが想定されるが、左と上縁に沿ってウェルをボリュームを減少させました。これらのウェルは、プレートの中央に他のDMSOで処理したウェルとは異なる色を有するように見えます。同じ矛盾はまた、2.5 / mlのアプラマイシンで処理したウェルで観察することができます。この場合には、減少量はまた、分光光度計および蛍光光度計により定量的読み取りをもたらします。ケアは、矛盾のこのソースを回避するために、十分に加湿インキュベーターを維持するために取られなければならないので、蒸発は、長時間のインキュベーション時間を持つすべての実験のために重要になります。
図1： メソッドの回路図。ハイスループットスクリーニングシステムの3つの別々のモジュールのためのアッセイの概略図を示す図。 _upload / 55273 / 55273fig1large.jpg」ターゲット= 『_空白』>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：細胞内からの代表的なデータは、THP-1細胞内結核菌の排除におけるリファンピシンの効果を調べました。各処理（リファンピシン）濃度についての（相対的発光単位）読み出し平均発光の（A）のグラフ。エラーバーは、各三連の平均の標準誤差を示します。 （B）より高い値はより大きな有効性を示してリファンピシンの処理による発光で計算されたパーセント減少のグラフ。この場合の90％阻害濃度（IC 90）は、どこ0.01及び0.1 / mlの間です。NK ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 細胞毒性（MTT）アッセイからの代表的なデータは、分化したTHP-1細胞に対する化合物G1-1Hの毒性効果を検討します。より高い値は、健康THP-1細胞を示す治療化合物G1-1H、各濃度についての値を算出した「対照のパーセント」のグラフ。この場合のIC 50は、どこかに10〜30μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： レサズリンアッセイからの代表的なデータは、Eを検査しますインブロス 結核菌を阻害することアプラマイシンffectiveness。唯一の定性的データが起因バイオセーフティーレベル3（BSL3）ラボにおける機器の制限により、この場合に収集されます。写真はDMSO又はアプラマイシン様々な量のいずれかで処理した結核菌を含有する96ウェルプレートの一部を示しています。ピンクの青から色変換によって示されるようにDMSOで処理したウェルは、レゾルフィンするレサズリンの変換を示しました。アプラマイシンで処理したサンプルは、明らかに5μg/ mlの以下の色変換を行いました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| [リファンピシン】 | REP1 | REP2 | REP3 | ％削減 | |
| 4 / mlの | 184 | 190 | 210 | 195 | 100 |
| 1μg/ mLの | 244 | 215 | 159 | 206 | 100 |
| 0.1μg/ mLの | 1037 | 731 | 976 | 915 | 98 |
| 0.01 / mlの | 19200 | 24400 | 23919 | 22506 | 54 |
| 0 / mlの | 39877 | 49655 | 57728 | 49087 | 0 |
表1： リファンピシンの 細胞内のIC 90 の決意のためにルシフェラーゼアッセイからの生データ 。
| [G1-1H] | 担当者1機のA570 | 担当者2 A570 | 担当者3 A570 | 平均A570 | 未処理の％ |
| 30μM | 0.056 | 0.056 | 0.055 | 0.056 | 7 |
| 10μM | 0.518 | 0.488 | 0.492 | 0.499 | 62 |
| 3μM | 0.652 | 0.638 | 0.656 | 0.649 | 80 |
| 0μM | 0.822 | 0.782 | 0.815 | 0.806 | 100 |
表2：Differeにおける細胞毒性試験の化合物G1-1Hの決意するためのMTTアッセイからの生データNT濃度。
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Discussion
本研究の目標は、 結核菌のための人間の細胞内感染モデルを使用して、シンプルでコスト効率のHTS方法を作成することでした。結核は、 結核菌によって肺胞マクロファージの感染によって特徴付けられるヒト疾患です。バイオセーフティ問題に、細菌と宿主細胞の両方の生物学的モデルを含む研究は過去に使用されてきました。しかし、サロゲート細菌および非ヒトモデルの使用は、薬物スクリーニングは、最高の結核菌 19、20に感染したヒト細胞を用いて行われていることを示す、医薬品開発におけるヒット・ツー・リード、成功の貧しい予測因子であることが示されています21、22。
この方法では、我々は前進し、ヒトマクロファージ様THP-1細胞株のための現在の最先端のスクリーニングプロトコルを適応しています。高達成するためにスループット、我々は感染プロトコルにいくつかの技術的改良を導入しました。まず第一に、私たちは、CFUの決意に関わるすべてのステップを交換し、ルシフェラーゼベースのレポーターシステムでそれらを置換しました。ホタルルシフェラーゼによる単純なエンドポイントアッセイは、宿主細胞のリソソーム酵素、及び最小の機器の要件によって急速な分解に選択しました。この置換は、効果的に30日間の潜伏期間と同様に、メッキおよびコロニーカウントの手順に関連した人件費や消耗品のコストを排除しました。
我々が導入された第2の主要な改善はさらに単純感染プロトコルとウェル間のスループットと一貫性を向上バッチ処理および感染でした。単一のステップに分化し、感染症のステップを組み合わせることで、私たちは一日でプロトコルを短縮することができました。同時に、我々は正常に分化し、infectioの間で発生する洗濯の3ラウンドを削減することができました剥離が可能THP-1細胞の損失の源であるN、。
このプロトコルは、いくつかの利点を付与するTHP-1細胞株、内部にスクリーニングするために開発されました。 THP-1は、不死化細胞株として、20以上の継代23 インビトロで確実に培養することができます。高スループットのセットアップを供給するために十分な細胞を維持するために挑戦することができます大規模なスクリーニングキャンペーン、特に重要です。さらに、THP-1における試験結果の変動を最小限に均一な遺伝的背景を提供します。これは、ホスト細胞応答10に影響を与える化合物を試験するために非常に有益です。追加ボーナスとして、THP-1細胞株における遺伝子発現は、低分子干渉RNA（siRNA）24によってダウンレギュレートすることができます。これは、ヒット化合物の作用のモードに下流の調査のための貴重なツールを提供します。この方法は、THP-1細胞株を用いて設計されたが、それを以前に10を示されたように、容易に、そのような末梢血単核細胞（PBMC）のようなヒト初代細胞、に適合させることができます。
最良肺胞マクロファージおよび結核菌の間の実際の相互作用を模倣するために、細胞内アッセイプロトコルは、細菌をオプソニン化する工程を含みます。ヒト血清コート結核菌とのオプソニン化、補体受容体3（CR3）25を介して、細胞侵入を容易にします。裸の細菌は、レクチン受容体8を介してマクロファージに入る可能性が高くなります。気管支流体がヒト血清25、オプソニン作用、又はその欠如の成分を含有することが知られていることを考えると、スクリーニング結果に根本的な影響を有していてもよいです。しかし、いくつかはさらに、感染プロセス16を簡単にするために、このステップをスキップすることを選択したり、原因のLiの大きさに十分なヒト血清を得ることは可能ではないかもしれませんbraryは11をスクリーニングされます。
細胞内アッセイは、前にルシフェラーゼ試薬を添加するウェルから未結合物質を含むすべての液体を除去する工程を含みます。このステップは、ウェル当たりの使用量の試薬を低減しつつ、信号対雑音比を増加させるために設計されています。しかし、このステップを含めることは、剥離及びTHP-1を溶解し、自由に浮動結核菌が除去されるので、THP-1はなく、 結核菌を死滅させる化合物についての偽陽性データを生成してもよいです。したがって、各ウェルにルシフェラーゼ試薬の等量（100μL）を添加し、製造業者の提案プロトコールは、細胞毒性化合物を含むウェルに結核菌の生存率についてアッセイするために従うべきです。
ホタルルシフェラーゼのシステムとは対照的に、細菌ルクスシステムは、信号生成26のための外部の試薬を必要としません。しかしながら、ホタルシステムは、次の理由ルクスシステムよりも好まれる。まず、細菌系は、マイコバクテリア26に毒性であり得ます。第二に、より複雑なレポーター系（蛍1つの遺伝子対ルクスのための5つの遺伝子）を、試験化合物による阻害を知らせるために、より感受性です。最後に、ホタルルシフェラーゼアッセイのために商業的に入手可能な試薬は、最適な信号を生成するために必要な条件を提供します。一方、細菌ルシフェラーゼ系は、ATP産生およびシグナル生成のための細菌の内部に存在する補因子に依存しています。これらは、異なる処理の間で変動し、制御するように簡単ではありませんすることができます。したがって、ホタルシステムにルシフェラーゼ試薬の添加は、反応条件を標準化し、全ての処理を横切ってルシフェラーゼ活性のより信頼性の高い測定結果を提供します。
CFUの決意は長い細菌密度を定量化するためのゴールドスタンダードもいます。契約には、bioluminescenceは、ほとんどの記者のように、細菌の直接の尺度ではありません。その代わりに、RLUは、CFUおよび細菌の代謝状態の両方の関数です。他のものは特定の条件5下で生物発光マイコバクテリアのためのRLUとCFUの間にほとんど線形関係を実証しました。いずれの場合においても、ルシフェラーゼアッセイシグナルの有意な減少に関係なく、根底にある原因、他のルシフェラーゼ酵素の実際の阻害よりも、宿主細胞内の結核菌のフィットネスの減少を示す活性は、あろう。したがって、これらの化合物は、薬物スクリーニングの観点から興味があるでしょうし、メソッド開発では除外すべきではありません。
ルシフェラーゼベースの細胞内スクリーニングプロトコルの代わりに、自動化蛍光顕微鏡ベースのアプローチ11、27、28、29です。ルシフェラーゼアッセイ出力をルミノメーターにより測定し、蛍光顕微鏡は定性的である画像を生成する一方、得られたデータは、定量的です。しかし、巧妙なコンピュータプログラミングを通じて、画像が定量的データを生成するために分析することができます。さらに、蛍光顕微鏡は、細胞生存率、細胞数、および感染の実際の速度として価値のパラメータを収集するために非常に有用である、複数のフルオロフォアを同時に使用することを可能にします。 1を予測可能性があるように、これらの利点は、いくつかの挫折が付属しています。自動蛍光顕微鏡設備の初期投資は、ルミノメーターまたは蛍光光度計のコストよりも何倍も大きいと、多くの研究室のための手の届かないところにあるので。機器へのアクセス権を持っている人のために、サンプル処理は、画像取得およびデータ分析の前に考慮されなければなりません。これらの2つのステップは、ライブラリサイズが増加して全体的な時間の投資に影響を与えます。 requir宿主細胞における追加の蛍光標識の包含このように追加のユーザー介入と時間投資を必要ES固定、染色、及び洗浄工程、。さらに、蛍光顕微鏡データの収集と分析、自動化されたものの、まだ簡単なルシフェラーゼアッセイ読み出しよりも有意に多くの時間とリソースが必要です。したがって、ルシフェラーゼレポーターベースの細胞内スクリーニング方法は簡単で、より高いスループットが可能です。
ルシフェラーゼベースの細胞内スクリーニング方法は、蛍光顕微鏡ベースのスクリーニング方法と比較して、1つの重大な制限を有します。これは、ルシフェラーゼアッセイは、ホストマクロファージの健康状態に関する一切のデータを提供しないという事実によるものです。細胞毒性化合物は、マクロファージの死を引き起こすため、生きた細菌を培地中に放出されると、もはや最後のルシフェラーゼアッセイ信号に寄与しないでしょう。その結果、細胞毒性化合物は、このように細胞内の結核菌とgeneratの死を引き起こすように見えます偽陽性のEA多く。この問題に対処するために、我々は、ホストマクロファージ上の化合物の細胞毒性を評価するためのMTTアッセイを用いて本手法を補完しています。スクリーニング方法のこのモジュールは、私たちに興味のある化合物のdrugabilityに関する追加情報を提供し、より少なくより理想的な薬剤候補を早期に解消することができます。
あるいは、また、前自動蛍光顕微鏡を実行するルシフェラーゼベースの細胞内アッセイを使用してもよいです。大規模な化合物ライブラリーの画面では、これはマクロファージ感染モデルにおける化合物の有効性の迅速かつ効率的な評価を可能にします。以前に発表された研究11で示すように、結果として、自動化された蛍光顕微鏡は、より良い候補者に詳細な研究のために確保することができます。
ルシフェラーゼベースの細胞内アッセイの低コストかつシンプルな性質も大幅に小さなテストしたい研究者に利益をもたらします化学ライブラリーえー。全体的に、ルシフェラーゼベースの細胞内アッセイは、すべての口径の研究室のための様々なサイズのプロジェクトをスクリーニングするための非常に柔軟なツールであることが証明されています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
| Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
| Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
| kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
| 1 M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
| Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| M. tuberculosis H37Rv | |||
| 96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
| 95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
| Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
| Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
| luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |
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