Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Resumo

Nós desenvolvemos um sistema de rastreio de alto rendimento modular para descobrir novos compostos contra o Mycobacterium tuberculosis, direccionamento intracelular e em caldo de crescimento de bactérias, bem como a citotoxicidade contra a célula hospedeira de mamífero.

Resumo

Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose (TB), é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Com o aumento da disseminação da TB multirresistente (TB-MDR), há uma urgência real de desenvolver novas estratégias terapêuticas contra infecções por M. tuberculosis. Tradicionalmente, os compostos são avaliados com base em sua atividade antibacteriana em condições de crescimento in vitro em caldo; no entanto, os resultados são frequentemente enganosos para patógenos intracelulares como M. tuberculosis, uma vez que as condições de triagem fenotípica em caldo são significativamente diferentes das condições reais da doença no corpo humano. A triagem de inibidores que atuam dentro de macrófagos tem sido tradicionalmente difícil devido à complexidade, variabilidade na infecção e lenta taxa de replicação de M. tuberculosis. Neste estudo, relatamos uma nova abordagem para avaliar rapidamente a eficácia dos compostos na viabilidade de M. tuberculosis em um modelo de infecção por macrófagos. Usando uma combinação de um ensaio de citotoxicidade e um ensaio de viabilidade de M. tuberculosis em caldo, fomos capazes de criar um sistema de triagem que gera uma análise abrangente dos compostos de interesse. Este sistema é capaz de produzir dados quantitativos a um baixo custo que está ao alcance da maioria dos laboratórios e, no entanto, é altamente escalável para se adequar a grandes ambientes industriais.

Introdução

Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose (TB), é uma das principais causas de morbilidade e mortalidade em todo o mundo. TB sensível a drogas é uma doença tratável que requer múltiplos antibióticos durante um período de 6 meses. Apesar de ser uma doença tratável da taxa de mortalidade foi estimada em 1,5 milhões em 2015 ^um. Nos últimos 10 anos, tem vindo a aumentar as preocupações com a prevalência de fármaco-resistentes de M. tuberculosis. Multirresistente tuberculose (TB-MR) é definida como a tuberculose que é resistente a pelo menos isoniazida (INH) e Rifampicina (RMP), e a maioria das estirpes de MDR-T....

Protocolo

1. Estirpe bacteriana e Meio de Crescimento

1. Adicione de dextrose e albumina de solução de estoque de sal (ADS) por solubilização de 25 g de albumina de soro bovino, 10,0 g de dextrose, e 4,05 g de cloreto de sódio em 460 mL de água desionizada. Filtro-esterilizar a ADS e armazenar a 4 ° C.
2. Adicione 7H9 pela adição de 4,7 g de 7H9 em pó e 2 ml de glicerol a 900 mL de água purificada. Autoclave o 7H9 a 121 ° C durante 10 min e permita que arrefeça para a temperatura ambiente antes de continuar. Adicione 7H9ADST por adição de 100 mL de ADS e 0,5 ml de Tween 80 a 900 mL de caldo 7H9. Armazenar a 4 ° C.
3. Pesar 50 mg de sulfato de canamicina e....

Resultados

Rastreio intracelular de alto rendimento usando M. tuberculosis expressando o gene da luciferase

A Figura 2A e na Tabela 1 contém os dados brutos recolhidos pelo luminómetro, expressa em unidades luminescentes relativas (RLU), mostrando o efeito de uma concentração crescente da droga rifampicina em M. tuberculosis TB no interior das células THP-1. A Figura 2A é .......

Discussão

O objetivo deste estudo foi o de criar um método HTS simples e de baixo custo utilizando um modelo de infecção intracelular humano para o M. tuberculosis. A tuberculose é uma doença humana caracterizado pela infecção de macrófagos alveolares por M. tuberculosis. Devido a questões de biossegurança, pesquisa envolvendo modelos biológicos, tanto da bactéria e as células hospedeiras tem sido usado no passado. No entanto, foi demonstrado que o uso de bactérias substitutos e modelos não-humanos são pobres pr.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R5886
L-glutamina	Sigma-Aldrich	G7513
Soro fetal bovino (FBS)	Thermo Fisher Scientific	12483020
Middlebrook 7H9	Becton, Dickinson and Company	271210
Tween80	Fisher Scientific	T164
Albumina, Bovino pH7	Affymetrix	10857
Dextrose	Fisher Scientific	BP350
Cloreto de Sódio	Fisher Scientific	BP358
sulfato de canamicina	Fisher Scientific	BP906
PMA	Sigma-Aldrich	P8139
	MTT Sigma-Aldrich	M2128
N,N- Dimetilformamida (DMF)	Fisher Scientific	D131
1 M Ácido hidroclorídrico (HCl)	Fisher Scientific	351279212
Ácido acético	Fisher Scientific	351269
SDS	Fisher Scientific	BP166
Resazurin	Alfa Aesar	B21187
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879
Glicerol	Fisher Scientific	BP229
THP-1	Type Culture Collection	TIB-202
M. tuberculosis H37Rv
Placa branca de fundo plano de 96 poços	Corning	3917
Placa transparente de fundo plano de 95 poços	Corning	3595
Selador de placa transparente	Espectrofotômetro Thermo Fisher Scientific	AB-0580
	Thermo Fisher Scientific	Biomate 3
Microplate espectrofotômetro	Biotek	Epoch
	luminômetro Applied Biosystems	Tropix TR717

American