Summary
Мы разработали модульную систему скрининга с высокой пропускной способностью для обнаружения новых соединений в отношении микобактерий туберкулеза, нацеливание внутриклеточных и в-бульоне растущих бактерий, а также цитотоксичность против клетки - хозяина млекопитающего.
Introduction
Микобактерии туберкулеза, возбудитель туберкулеза (ТБ), является ведущей причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Drug-чувствительный туберкулез поддается лечение заболевания, которое требует несколько антибиотиков на срок от 6 месяцев. Несмотря на то , поддающееся лечению заболевание, смертность от туберкулеза, по оценкам, 1,5 миллиона в 2015 году 1. За последние 10 лет, увеличивались озабоченность по поводу распространенности лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза. С множественной лекарственной устойчивостью туберкулеза (МЛУ-ТБ) определяется как туберкулез, который устойчив к по меньшей мере, к изониазиду (изониазид) и рифампицин (РМП), а большинство штаммов МЛУ-ТБ также устойчивы, чтобы выбрать препараты второго ряда ТБ, ограничивая тем самым возможности лечения , Последствия лекарственной устойчивости создают большую проблему для лечения пациентов с сочетанной инфекцией вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ); 400000 пациентов по всему миру умерли от ВИЧ-ассоциированного туберкулеза в 2015 году 1. Disappointingly, пищевых продуктов и медикаментов США AdministРацион одобрил только один новый препарат против туберкулеза с МЛУ-ТБ, bedaquiline, в течение последних 40 лет 2. Прогресс в поиске более и более короткие терапии ТБ крайне необходимы для того, чтобы оставаться впереди в борьбе с ТБ и МЛУ-ТБ.
Традиционно, экраны наркотиков ТБ проводят в условиях , в пробирке роста в среде для роста, в результате чего соединения добавляют к растущей культуре , и их эффективность в уничтожении микроорганизмов , которые определяются путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) на твердой среде. Как КОИ отсчеты трудоемкие, занимает много времени, и дорого, различные косвенные методы были разработаны для решения этой проблемы. Такие способы включают в себя жизнеспособность анализа Alamar Blue 3, определение флуоресценции 4 из зеленого флуоресцентного белка (GFP) или люминесценции 5 из люциферазы-экспрессирующих бактерий, а также оценку общего аденозинтрифосфата (AТП) 6, 7.
Типичный ТБ характеризуются туберкулезной инфекцией M. легкого, где бактерии проживают и реплицировать внутри фагосом альвеолярных макрофагов 8. Простой экран фенотипического в бульоне может удовлетворить внеклеточные патогены; Однако, в исторической перспективе, ударил соединение против микобактерий туберкулеза , идентифицированное с помощью этого метода часто не оправдали ожидания во время последующих этапов проверки в моделях инфекции. Мы полагаем, что препарат ТБ лучше всего проводить в внутриклеточной модели инфекции клетки-хозяина. Тем не менее, внутриклеточные модели обладают многими технологическими и биологическими барьерами для скрининга (HTS) развития с высокими пропускной способностью. Большое препятствие является сложность инфекционного процесса, на примере многочисленных этапов и сложного удаления внеклеточных бактерий в промежутке между стиркой. Второе основное препятствие является длительным время повторноquirements, как обнаружение роста, обычно проводимой КОЕ в расчете на культуральных планшетах, это процесс, который занимает более 3 недель, чтобы закончить. Одно решение для замены счетчиков КОИХ было обеспечено автоматизированной флуоресцентной микроскопией в сочетании с люминесцентными бактериями. Однако это решение требует первоначальных инвестиций оборудования, которое вне досягаемости для многих научно-исследовательских лабораторий. Простой, недорогой и болезни соответствующего метода HTS бы значительно улучшить процесс обнаружения наркотиков.
В этом исследовании мы сообщаем о новой, модульной системе HTS, которая направлена на обеспечение быстрого и высоко масштабируемый, экономичный, анализа , пригодный для определения активности соединений против внутриклеточных микобактерий туберкулеза. Эта система состоит из трех модулей: (я) внутриклеточных, (II) цитотоксичность, и (III) в бульоне-анализах. В сочетании конечный результат обеспечивает полное описание составных свойств, с дополнительной информацией как с потенциальным механизмом действия. Это СБНreening системы были использовано в нескольких проектах с различными библиотеками соединений , которые способом действия цели, включая анализ наркотики синергии 9, стимуляция аутофагии 10, а также ингибирование микобактерий туберкулеза -secreted фактор вирулентности (неопубликованный). Соединения неизвестного способа действия также были изучены 11. Модифицированная версия этого метода была также принята нашим промышленным партнером в качестве основного метода скрининга для выявления новых соединений против внутриклеточных микобактерий туберкулеза 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Бактериальный штамм и рост среднего
- Сделать декстрозу альбумина и соли исходного раствора (ADS) путем солюбилизации 25 г бычьего сывороточного альбумина, 10,0 г декстрозы и 4,05 г хлорида натрия в 460 мл деионизированной воды. Фильтр-стерилизовать ADS и хранят при температуре 4 ° С.
- Сделать 7H9 бульон добавлением 4,7 г 7H9 порошка и 2 мл глицерина в 900 мл очищенной воды. Автоклав 7H9 бульона при 121 ° С в течение 10 мин и дать ему остыть до комнатной температуры, прежде чем продолжить. Сделать 7H9ADST добавлением 100 мл ADS и 0,5 мл Tween80 в 900 мл бульона 7H9. Хранить при 4 ° С.
- Взвешивают 50 мг сульфата канамицина и растворяют в 1 мл деионизованной воды; конечная концентрация составляет 50 мг / мл. Фильтр-стерилизовать и хранить при -20 ° С. Добавьте 0,5 мл канамицина исходного раствора на 1 л 7H9ADST.
Примечание: Эта среда должна быть свежей, так масштабировать объемы надлежащим образом в соответствии с размером культуры. - Grow микобактерии в 7H9ADST с добавлением канамицина в отстаивании культуры. Встряхнуть культуру ежедневно и разбавить его до того, как OD600 достигает 1,0, чтобы избежать образования комков.
Примечание: Этот штамм туберкулеза М. используется для разработки этого метода был H37Rv , трансформированные плазмидой pJAK2.A 12. pJAK2.A является интегративной плазмиду на основе вектора pMV361, что позволяет экспрессию на высоком уровне светлячка гена люциферазы из промотора hsp60 и может быть выбран с помощью канамицина.
2. THP-1 Средний и обслуживание
- Добавить 50 мл инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 5 мл 200 мМ L-глутамина до 500 мл среды RPMI 1640, чтобы сделать среду RPMI неполной (приблизительно 10% FBS и 2 мМ глутамина).
- Поддержание культуры клеток ТНР-1 согласно стандартному протоколу 13. Если коротко, то растут ТНР-1 клеток в RPMI неполной среды, сохраняя при этом плотность клеток 0,2 до 1 млн на мл среды между памудрецы.
3. Высокая пропускная способность внутриклеточного скрининга с использованием люциферазы-экспрессирующих М. туберкулеза H37Rv
- Измерьте оптическую плотность активно растущей бактериальной суспензии на спектрофотометре при длине волны 600 нм. Вычислить плотность бактериальной , используя коэффициент пересчета 0,1 OD 600 = 3 × 10 7 бактерий на мл.
- Пипетировать из бактерий достаточные для множественности инфекции (MOI) 10: 1 в новую пробирку центрифуги. Гранулы при 3000 мкг в течение 10 мин и отсасывает жидкость. Добавляют 50 мкл сыворотки крови человека до 450 мкл RPMI1640. Шкала громкости в соответствующие значения для эксперимента.
- Для того, чтобы opsonize бактерии, ресуспендируют осадок при плотности 1 × 10 8 бактерий на 500 мкл RPMI 1640 , содержащей 10% сыворотки человека. Разрешить смесь инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. Определить плотность клеток культуры ТНР-1 путем подсчета с помощью гемоцитометра и перевернутой microscoфизическое воспитание
- Гранулы клетки в стерильных центрифужных пробирках при 100 мкг и 37 ° С в течение 10 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в среде RPMI неполным при плотности 1 миллиона клеток на мл. Добавить форболовый-12-миристат-13-ацетата (PMA) в / мл конечной концентрации 40 нг.
Примечание: Это будет называться дифференциации смеси. - Зерноуборочный опсонизированным M. туберкулез с ТНР-1 дифференциации смеси при MOI 10: 1 и аликвоту окончательную смесь в количестве 100 мкл на лунку в 96-луночных плоскодонных белой тарелке. Регулярно смесь перемешивают, чтобы обеспечить однородность. Дайте дифференцировка и инфекции , чтобы продолжить в течение ночи при 37 ° С в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO 2.
- Промыть лунки дважды 100 мкл RPMI каждого. Добавьте соединения разводили до желаемой концентрации в RPMI неполной и инкубировать в течение 3-х дней.
- Аспирируйте среду из лунок. Добавьте 50 мкл реагента люциферазы анализа в каждую лунку. Уплотнение пластин с тransparent клеевые шпатлевки пластины. Разрешить 5 мин инкубации при 22 ° С, а затем получить отсчет в люминометре на 1 с на лунку.
4. Анализ цитотоксичности , используя 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразоли (МТТ) 14
- Дифференцирование клетки ТНР-1 в среде RPMI с добавлением неполного 40 нг / мл РМА в прозрачных 96-луночных планшетах. Поддержание плотности клеток 1 млн на мл и аликвоты 100 мкл на лунку. Разрешить дифференцировка продолжать в течение ночи при 37 ° С в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO 2.
- Аспирируйте среду из лунок и промыть их дважды RPMI 1640. Добавьте соединения разводили в среде RPMI неполных в лунки. Выдержите в течение 3-х дней.
- Растворить 0,5 г МТТ в 100 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), чтобы сделать исходный раствор 5 мг / мл. Стерильный фильтр и хранят при -20 ° С, в защищенном от света; то лучше сделать это решение свежим.
- 2,5 ч Beforе конец инкубационного периода 3-х дней, добавляют по 25 мкл раствора МТТ в каждую лунку и завершить инкубационный период.
- Готовят 50% N, N - диметилформамид (ДМФ) путем смешивания 250 мл ДМФ с 250 мл деионизированной воды.
- Подготовка буфера для экстракции МТТ следующим образом: Взвешивают 100 г SDS в бутылке 500 мл и добавляют 300 мл 50% ДМФ. Нанести низкотермичное, чтобы позволить SDS растворяться. Добавляют 10 мл чистой уксусной кислоты и 12,5 мл 1 М HCl. Заполните до отметки 500 мл с 50% ДМФ; окончательный состав буфера для экстракции составляет 50% ДМФ, 20% SDS, 2,5% уксусной кислоты и 2,5% 1 М соляной кислоты.
- В конце периода лечения, добавляют 100 мкл буфера для экстракции (подогретой до 45 ° С, чтобы растворить любые кристаллы) в каждую лунку. Разрешить смесь инкубируют в течение ночи при 37 ° C в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO 2. Измерить оптическую плотность при 570 нм.
Примечание: Анализ цитотоксичности лучше всего проводить параллельно с внутриклеточнойЭкран улар используя ту же партию-и возраст клеток ТНР-1.
5. В-бульоне активность анализ с помощью резазурин Assay 3
- Grow микобактерии в 7H9ADST к середины логарифмической фазы (~ 0,5 - 0,8 OD 600). Развести культуру с 7H9ADST до 0,01 OD 600. Развести соединений в 7H9ADST в 2 раза концентрации испытаний и аликвоты по 100 мкл каждого разведенного соединения в каждую лунку.
- Передача 100 мкл разбавленного бактериальной суспензии в каждую лунку. Разрешить планшеты инкубировали при 37 ° С в увлажненном инкубаторе в течение 5 дней. Растворяют 10 мг резазурин в 100 мл деионизированной воды и стерильный фильтр.
- Добавить 30 мкл раствора резазурин и следить за изменением цвета после 48 часов; бактериальный рост обозначается преобразование цвета от синего до розового.
Примечание: Количественный анализ также может быть выполнена путем измерения либо флуоресценции при длине волны 590 нм с возбуждением при 530 - 560нм или поглощение при 570 нм и 600 нм 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Высокая пропускная способность внутриклеточного скрининга с использованием микобактерии , выражающую ген люциферазы
Рисунок 2A и Таблица 1 содержит необработанные данные , собранные люминометра, выражены в относительных единицах люминесцентными (RLU), показывающий влияние возрастающей концентрации ТБ рифампицином препарата на микобактерии туберкулеза внутри клеток ТНР-1. Фигура 2А представляет собой график рассеяния сырой люминесценции , измеренную в RLU для различных концентраций рифампицина. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение от среднего (SEM). Фигура 2В показывают процентное снижение люминесценции в обработанных скважинах по сравнению с необработанными скважинами. Данные показывают , что рифампицин способен уменьшать> 99,9% РОС от внутриклеточных микобактерий туберкулеза в концентрации 0,1 мкг / мл. Это в соответствии с previouslу опубликованы MIC в пределах от 0,1 до 0,4 мкг / мл 16. Люминесцентный производится в каждой лунке является показателем общей люциферазы , выраженной микобактерий туберкулеза и , таким образом , является показателем метаболического статуса микобактерий туберкулеза внутри скважины. Это нормально для сырых уровней люминесцирующих варьировать между экспериментами. Таким образом, сравнение исходных данных будет генерировать недостоверные выводы. Таким образом, эти данные должны быть нормализованы в отношении определенного отрицательного контроля, который был бы образцы, обработанные только ДМСО. Полученные значения могут быть выражены как процентное снижение микобактерий туберкулеза в скважинах (рис 2В).
Анализ цитотоксичности с использованием анализа МТТ
Анализа МТТ является хорошо создана для анализа эукариотических цитотоксичности. Этот колориметрический анализ указывает на живые клетки путем преобразования МТТ (желтый) кфиолетовые цвета формазаны. Этот анализ проводит без инфекции M. туберкулеза , так как бактерии способны метаболизировать МТТА, что снижает наблюдаемую токсичность соединений. Общее предложение для МТТ - анализа заключается в использовании средств массовой информации без индикатора рН фенола красного из - за поглощения при 570 нм 17. Тем не менее, подкисляют экстракционный буфер описан в этом способе может свести к минимуму помехи , вызванной фенолом красного 17.
Рисунок 3 иллюстрирует цитотоксичность , вызванное увеличением концентрации тестируемого соединения кодированной G1-1H. Как правило, ингибирующая концентрация 50% (IC 50) используется для указания уровня цитотоксичности. В случае G1-1H, концентрации 10 мкМ и 3 мкМ, очевидно , ниже концентрации IC 50.
В-бульоне анализ деятельности насИНГ анализы резазуриной
Анализ ресазурина обычно используется для анализа цитотоксичности в эукариотических клетках, но он также может быть использован для мониторинга живых бактерий в бульоне 3. Анализ ресазурина представляет собой анализ окислительно-восстановительной основой похож на анализ МТТ. Он измеряет уровень НАДФА и НАДФНА дегидрогеназа путем преобразования резазуриных в ресоруфину, красную флуорофору. Самый простой и быстрый способ, чтобы определить эффективность препарата заключается в поиске самой низкой концентрации обработки, где лунки остаются синего цвета. На фиг.4 показана часть 96-луночного планшет , показывающего влияние различных концентраций антибиотика апрамицина имеют на резазурином преобразование М. туберкулеза. МИК в бульоне-было определено, что от 2,5 до 5 мкг / мл. Это чуть выше , чем ранее опубликованной величины 1,5 мкг / мл 18, но он по - прежнему хорошо в пределах acceptabДиапазон ля. Во многих случаях изменение цвета, а постепенно, так что трудно сделать уверенное определение. В этих условиях, то лучше для количественного определения фактического количества резазуриных преобразования с использованием либо поглощения или флуоресценции. Из - за подобные характеристики поглощения резазурина и ресоруфины, MIC с использованием определения оптической плотности требует измерений с использованием двух различных длинами волн и сложные вычислениями 15. Таким образом, лучший способ для измерения флуоресценции с использованием 530- до 560 нм длины волн возбуждения и длины волны излучения в 590 нм, как описано в литературе изготовителя 15.
Фиг.4 иллюстрирует потенциальный источник несоответствия , связанный с многодневным инкубированием , которые могли радикально изменить результаты скрининга. Из-за неправильное увлажнение 37 ° C инкубатор, используемое для этого эксперимента, скважины по краям р Lates пострадали значительно больше испарения. Все 15 ДМСО обработанные скважины должны быть идентичными, но лунки вдоль левых и верхних краев сократили объемы. Эти скважины также по всей видимости, имеют различные цвета по сравнению с другими ДМСО обработанных скважин в середине пластины. Же несоответствие также можно наблюдать в 2,5 мкг / мл апрамицином обработанных скважин. В этом случае уменьшение объема также приведет к количественному чтения с помощью спектрофотометра и флуорометре. Испарение становится существенным для всех экспериментов с более длительной инкубацией, поэтому необходимо соблюдать осторожность, чтобы сохранить инкубаторы хорошо увлажненные, чтобы избежать этого источника противоречивости.
Рисунок 1: Метод Схема. Схема с изображением схемы опробования на 3 отдельных модулей системы скрининга с высокой пропускной способностью. _upload / 55273 / 55273fig1large.jpg»целевых =„_blank“> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Представитель данные из внутриклеточного для изучения эффективности рифампицина в ликвидации туберкулеза M. внутри ТНР-1 клетки. (А) График средней люминесценции чтения (в относительных единицах люминесценции) для каждой обработки (рифампицин) концентрации. Столбики ошибок обозначают стандартную ошибку среднего значения для каждых трех экземпляров. (Б) график расчетных снижения процента в люминесценции , вызванной лечения рифампицином, где более высокие значения указывают на большую эффективность. Ингибирующая концентрация 90% (IC 90) в этом случае находится где - то между 0,01 и 0,1 мкг / мл.пк "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Представитель данные от цитотоксичности (МТТ) для изучения токсических эффектов соединения G1-1H на дифференцированных ТНР-1 клетки. График рассчитанной «процент контрольных» значений для каждой концентрации для обработки соединения G1-1H, где более высокие значения указывают на здоровые клетки ТНР-1. IC 50 в этом случае находится где - то между 10 и 30 мкМ. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Представительные данные из резазуриных Пробирных для изучения Effectiveness из апрамицина при ингибировании микобактерии В-бульоне. Только качественные данные собираются в этом случае из-за ограничения оборудования в 3 (BSL3) лаборатории уровня биологической безопасности. Фото показаны часть 96-луночный планшет, содержащих микобактерии обрабатывали либо ДМСА или различные количества апрамицина. ДМСЫ обработанные скважины показали конверсию резазурина в резоруфин, как показано преобразование цветов от синего до розового цвета. В апрамицину обработанных образцов прошли четко преобразование цвета ниже 5 мкг / мл. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| [Рифампицин] | Rep1 | Rep2 | Rep3 | Снижение% | |
| 4 мкг / мл | 184 | 190 | 210 | 195 | 100 |
| 1 мкг / мл | 244 | 215 | 159 | 206 | 100 |
| 0,1 мкг / мл | 1037 | 731 | +976 | 915 | 98 |
| 0,01 мкг / мл | 19200 | 24400 | 23919 | 22506 | 54 |
| 0 мкг / мл | 39877 | 49655 | 57728 | 49087 | 0 |
Таблица 1: Исходные данные из анализа люциферазы для определения внутриклеточного IC 90 рифампицина.
| [G1-1H] | Rep 1 A570 | Rep 2 A570 | Rep 3 A570 | Средняя A570 | % От необработанного |
| 30 мкМ | 0,056 | 0,056 | 0,055 | 0,056 | 7 |
| 10 мкМ | 0,518 | 0,488 | 0,492 | 0,499 | 62 |
| 3 мкМ | 0,652 | 0,638 | 0,656 | 0,649 | 80 |
| 0 мкМ | 0,822 | 0,782 | 0,815 | 0,806 | 100 |
Таблица 2: необработанные данные от МТТА для определения цитотоксичности испытуемого соединения G1-1H в Differeнт концентрации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Цель данного исследования состояла в том, чтобы создать простой и экономически эффективный метод HTS с использованием человеческой внутриклеточной модели инфекции для микобактерий туберкулеза. Туберкулез является человек заболевание , характеризующееся инфекции альвеолярных макрофагов микобактерий туберкулеза. Из-за проблем биологической безопасности, исследование с участием биологических моделей как бактерии и клетки-хозяева были использованы в прошлом. Тем не менее, было показано , что использование суррогатных бактерий и не-человеческих моделей являются плохими прогностическими факторами успеха хит-на-ведущую роль в разработке лекарственных средств, что свидетельствует о том , что скрининг лекарств лучше всего сделать с человеческими клетками , инфицированными микобактерий туберкулеза 19, 20, 21, 22.
В этом методе, мы продвинулись и адаптировать существующие протоколы скрининга государства в самом современном для человеческой макрофагального типа ТНР-1 клеточной линии. Для того, чтобы достичь высокогопропускная способность, мы ввели ряд технических усовершенствований протокола инфекции. В первую очередь, мы заменили все этапы определения КОЕГО и замещенные их люциферазы на основе системы репортера. Светлячок люциферазы был выбран из-за простой конечную точку анализа, быструю деградация с помощью клетки-хозяина, лизосомных ферментов, а также требование к минимальному оборудованию. Эта замена эффективно устранили инкубационный период 30-дневный, а также затраты на рабочую силу и расходные материалы, связанные с гальванических и колониестимулирующий подсчета шагов.
Второе основное усовершенствование, которое введены было пакетная обработка и инфекция, что дополнительно повышает пропускную способность и согласованность между скважинами с более простым протоколом инфекции. Объединив дифференциации и инфекции шаги в один шаг, мы смогли сократить протокол на один день. В то же время, мы смогли сократить три раунда умывания, которые обычно происходят между дифференциацией и infectioп, который является источником возможной потери ТНР-1 клеток из-за отрыв.
Этот протокол был разработан для скрининга внутри клеточной линии ТНР-1, которое дает несколько преимуществ. ТНР-1, в качестве иммортализованной клеточной линии, может быть надежно культивировали в пробирке в течение более 20 проходов 23. Это особенно важно для больших скрининговых кампаний, где она может быть сложной задачей, чтобы поддерживать достаточное количество клеток, чтобы поставить установку высокой пропускной способностью. Кроме того, тестирование в ТНР-1 обеспечивает однородный генетический фон, который сводит к минимуму вариабельность результатов. Это очень полезно для тестирования соединений , которые влияют на ответы 10 клеток - хозяев. В качестве дополнительного бонуса, экспрессия гена в клеточной линии ТНР-1 может быть вниз регулируется с помощью малых интерферирующих РНК (киРНК) 24. Это обеспечивает ценный инструмент для последующих исследований в режим действия хитовых соединений. Хотя этот метод был разработан с использованием линии клеток ТНР-1, егоможет быть легко адаптирована для первичных клеток человека, таких , как мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), как было показано ранее 10.
Для того, чтобы лучше имитировать фактическое взаимодействие между альвеолярными макрофагами и микобактерий туберкулезом, внутриклеточный Протокол анализа включает в себя этап , чтобы opsonize бактерии. Опсонизация с сывороткой человека пальто микобактерий туберкулеза и облегчает проникновение клеток через рецептор комплемента 3 (CR3) 25. Голые бактерии, более вероятно , чтобы ввести макрофаги через лектин рецептор 8. Принимая во внимание , что бронхоальвеолярный жидкости , как известно, содержат компоненты человеческой сыворотки, 25 опсонизации, или их отсутствие, могут иметь существенное влияние на результат скрининга. Тем не менее, некоторые из них могут выбрать , чтобы пропустить этот шаг для того , чтобы дополнительно упростить процесс 16 - инфекции, или оно не может быть возможным , чтобы получить достаточное количество сыворотки человека из - за размера Library экранируется 11.
Внутриклеточный анализ включает в себя этап, чтобы удалить всю жидкость, содержащую незакрепленный материал из лунок перед добавлением реагента люциферазы. Этот шаг предназначен для увеличения отношения сигнал-шум при одновременном снижении количества реагента, используемого на лунку. Однако включение этого шага может генерировать ложноположительных данные для соединений , которые убивают ТНР-1 , но не микобактерий туберкулеза, так как отдельные и лизируют ТНР-1 и свободно плавающие микобактерии туберкулеза будут удалены. Таким образом, предложенный протокол изготовителя добавления равных количеств реагента люциферазы (100 мкл) в каждую лунку необходимо следовать, чтобы анализ на выживаемость туберкулеза M. в лунках , содержащих цитотоксические соединения.
В отличии от светлячка системы люциферазы, бактериальная система освещенности не требует внешних реагентов для генерации сигнала 26. Однако,светлячка система является предпочтительным по сравнению с системой люкс по следующим причинам: во- первых, бактериальная система может быть токсичен в микобактерий 26. Во- вторых, более сложная система репортер (5 гены лк по сравнению с 1 гена светлячка) более восприимчивы к ингибированию сигнала испытуемых соединений. Наконец, коммерчески доступные реагенты для светлячка анализа люциферазы обеспечивают необходимые условия для генерации оптимального сигнала. С другой стороны, система бактериальной люциферазы зависит от производства АТФ и кофакторов, присутствующих внутри бактерий для генерации сигнала. Они могут варьироваться в зависимости от различных методов лечения и не так легко контролировать. Таким образом, добавление реагента люциферазы светлячка к системе стандартизирует условия реакции и обеспечивает более надежные измерения активности люциферазы во всех процедурах.
определение CFU уже давно является золотым стандартом для количественной оценки бактериальной плотности. В договоре, bioluminгалоидная, как и большинство репортеров, не является прямой мера бактерий. Вместо этого, РОС является функцией как КОЕ и метаболического состояния бактерий. Другие продемонстрировали преимущественно линейную зависимость между РОС и КОИМ для биолюминесцентных микобактерий в конкретных условиях 5. В любом случае, значительное снижение сигнала для анализа люциферазы, независимо от того , основной причины, кроме фактического ингибирования активности фермента люциферазы-указывал бы к уменьшению туберкулеза пригодности M. внутри клетки - хозяина. Таким образом, эти соединения будут иметь интерес с точки зрения скрининга лекарственных препаратов и не должны быть исключены в разработке метода.
Альтернативой люциферазы на основе протокола внутриклеточного скрининга является автоматизированной флуоресцентной микроскопии подход , основанный на 11, 27, 28, 29. люциферазыАнализ выход измеряется с помощью люминометра, а также данные, полученные количественное, тогда как люминесцентная микроскопия формирует изображения, которые являются качественными. Тем не менее, через умное компьютерное программирование, изображения могут быть проанализированы, чтобы генерировать количественные данные. Кроме того, флуоресцентная микроскопия позволяет несколько флуорофоры, которые будут использоваться одновременно, что является очень полезной для сбора ценных параметров, таких как жизнеспособность клеток, кровяные клеток, и фактической скорость инфекции. Как можно было бы предсказать, эти преимущества приходят с некоторыми неудачами. Первоначальные инвестиции на автоматизированной флуоресцентной микроскопии оборудования во много раз больше, чем стоимость люминометра или флуорометра и, следовательно, вне досягаемости для многих научно-исследовательских лабораторий. Для тех, у кого есть доступ к оборудованию, обработка образца должна быть рассмотрена до получения изображений и анализа данных. Эти два шага влияют на общий объем инвестиций времени с увеличением размера библиотеки. Включение дополнительных флуоресцентных меток в клетках-хозяевах RequirES шаги фиксации, окрашивания, и промывки, таким образом, требующие дополнительного вмешательства пользователя и время инвестиций. Кроме того, флуоресцентный сбор и анализ данных микроскопии, хотя автоматизированный, по-прежнему требуют значительно больше времени и ресурсов, чем простое для анализа люциферазы считывания. Таким образом, люциферазы репортер на основе метода внутриклеточного скрининга является более простым и способен более высокой пропускной способности.
Метод внутриклеточного скрининга на основе люциферазы имеет одно существенное ограничение по сравнению с люминесцентными методами скрининга микроскопа на основе. Это связано с тем, что анализ люциферазы не дает никаких данных о состоянии здоровья принимающих макрофагов. Цитотоксические соединения могли бы привести к гибели макрофагов, и, таким образом живые бактерии могут быть выпущены в среду, и больше не будет вносить свой вклад в конечный сигнал для анализа люциферазы. В результате цитотоксические соединения , как представляется, является причиной гибели внутриклеточных микобактерий туберкулеза и , таким образом Generatеа большое количество ложных срабатываний. Для решения этой проблемы, мы дополнили наш метод с помощью анализа МТТ для оценки цитотоксичности соединений на хозяин макрофагов. Этот модуль скринингового метода дает нам дополнительную информацию о как лекарственные препараты соединений, представляющих интерес и позволяет раннюю ликвидацию менее чем идеальных кандидатов наркотиков.
В качестве альтернативы, можно также использовать люциферазы на основе внутриклеточного анализа до выполнения автоматизированной флуоресцентной микроскопии. В экранах больших библиотек соединений, это позволяет быстро и эффективно оценки эффективности соединения в макрофаги модели инфекции. В результате автоматизированной флуоресцентной микроскопии может быть зарезервирован для детальных исследований на лучших кандидатов, как показано ранее опубликованного исследования 11.
Низкая стоимость и простота природы люциферазы на основе внутриклеточного анализа также значительно преимущество исследователей, которые желают испытать небольшимиэр химические библиотеки. В целом, люциферазы на основе внутриклеточный анализа, оказался чрезвычайно гибким инструмент для научно-исследовательских лабораторий всех калибров и для скрининга проектов различных размеров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
| Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
| Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
| kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
| 1 M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
| Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| M. tuberculosis H37Rv | |||
| 96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
| 95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
| Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
| Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
| luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |
References
- WHO. Global tuberculosis report 2015. , WHO. (2016).
- USFDA. FDA news realease. , Available from: http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm (2012).
- Yajko, D. M., et al. Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).
- Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).
- Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).
- Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1, 57 (2010).
- Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis. Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).
- Ramon-Garcia, S., et al. Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen. Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).
- Lam, K. K., et al. Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog. 8, e1002691 (2012).
- Sorrentino, F., et al. Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62, 158-165 (2009).
- ATCC. THP-1 (ATCC TIB-202). , Manassas. https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx (2016).
- Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).
- Invitrogen. AlamarBlue assay. , Invitrogen. (2008).
- Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction. Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).
- Riss, T. L., et al. Cell Viability Assays. , (2004).
- Meyer, M., et al. In vivo efficacy of apramycin in murine infection models. Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).
- Ballell, L., et al. Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis. ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).
- Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice. FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).
- Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).
- Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B. Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).
- Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , Springer International Publishing. 147-159 (2015).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. J Vis Exp. , e51960 (2014).
- Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid. Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).
- Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria. PLoS One. 5, e10777 (2010).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. , e51114 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5, e1000645 (2009).
- Pethe, K., et al. Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis. Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).
