Summary
Vi har udviklet en modulær højkapacitetsscreening system til at opdage hidtil ukendte forbindelser mod Mycobacterium tuberculosis, målretning intracellulære og i-bouillon voksende bakterier samt cytotoksicitet mod pattedyrværtscelle.
Introduction
Mycobacterium tuberculosis, det forårsagende middel af tuberkulose (TB), er en førende årsag til sygelighed og dødelighed i hele verden. Medikamentfølsomme TB er en behandlelige sygdom, der kræver flere antibiotika i en periode på 6 måneder. Trods en behandlelige sygdom, blev TB dødelighed anslået til 1,5 millioner i 2015 en. I de seneste 10 år har der været stigende bekymring over forekomsten af resistente M. tuberculosis. Multiresistent tuberkulose (MDR-TB) er defineret som TB der er resistent overfor mindst Isoniazid (INH) og Rifampicin (RMP), og de fleste MDR-TB-stammer er også modstandsdygtige over for vælge second-line TB lægemidler, hvilket begrænser behandlingsmuligheder . Virkningerne af lægemiddelresistens skabe en større udfordring til behandling af patienter med samtidig infektion med humant immundefekt virus (HIV); 400.000 patienter på verdensplan døde af HIV-associeret tuberkulose i 2015 1. Skuffende, USA Food and Drug Administration har godkendt kun én ny TB lægemiddel mod MDR-TB, bedaquiline, i de seneste 40 år 2. Fremskridt i at finde bedre og kortere TB terapier er et presserende behov for at være på forkant i kampen mod tuberkulose og multiresistent tuberkulose.
Traditionelt er TB lægemiddelscreeninger udført under in vitro vækstbetingelser i vækstmedium, hvorved forbindelser tilsættes til en voksende kultur og deres effektivitet til udryddelse mikroorganismerne bestemmes ved at tælle kolonidannende enheder (CFU) på fast medium. Da CFU tæller er arbejdskrævende, tidskrævende, og kostbar, har forskellige indirekte metoder blevet udviklet til at afhjælpe dette problem. Sådanne fremgangsmåder indbefatter Alamar Blue levedygtighedsassay 3, bestemmelse af fluorescens 4 fra grønt fluorescerende protein (GFP) eller luminescens 5 fra luciferase-udtrykkende bakterier, og skønnet over den samlede adenosintriphosphat (ATP) 6, 7.
Typisk TB er kendetegnet ved en M. tuberculosis-infektion i lungen, hvor bakterierne opholde sig og replikere inde i fagosomer af alveolære makrofager 8. Den enkle i-bouillon fænotypisk skærm kan passe ekstracellulære patogener; men i historisk perspektiv, ramte forbindelser mod M. tuberculosis identificeret ved anvendelse af denne fremgangsmåde ofte undlader at leve op til forventningerne i nedstrøms valideringsrutiner infektionsmodeller. Vi foreslår, at TB medicin er bedst udføres i en intracellulær værtscelle infektion model. Ikke desto mindre er intracellulære modeller besidder mange teknologiske og biologiske barrierer for high-throughput screening (HTS) udvikling. En stor hindring er kompleksiteten af infektionsprocessen, eksemplificeret ved talrige trin og den omfattende fjernelse af ekstracellulære bakterier ved i-mellem vask. En anden stor forhindring er den lange tid retingelserne, som vækst detektion, normalt ved CFU regner dyrkningsplader, er en proces der tager over 3 uger at gennemføre. En løsning til at erstatte CFU tællinger er blevet tilvejebragt ved automatiseret fluorescerende mikroskopi i kombination med fluorescerende bakterier. Men denne løsning kræver en indledende udstyr investering, der er uden for rækkevidde for mange forskningslaboratorier,. En enkel, billig, og sygdom-relevant HTS metode ville i høj grad øge lægemiddelopdagelsesprocessen.
I denne undersøgelse rapporterer vi en ny, modulært HTS-system, der har til formål at give en hurtig og yderst skalerbar, men økonomisk, assay egnet til bestemmelse af aktiviteten af forbindelser mod intracellulær M. tuberculosis. Dette system består af tre moduler: (i) intracellulære, (ii) cytotoksicitet, og (iii) i-bouillon assays. Det kombinerede endelige resultat giver en omfattende beskrivelse af de sammensatte egenskaber, med yderligere information med hensyn til den potentielle virkemåde. Denne screening system er blevet anvendt i flere projekter med forskellige forbindelsesbiblioteker, der er målrettet virkemåde, herunder analyse af lægemiddelsynergi 9, stimulering af autophagy 10, og inhiberingen af M. tuberculosis -secreted virulensfaktor (ikke offentliggjort). Forbindelser med ukendt virkningsmekanisme er også blevet undersøgt 11. En modificeret version af denne metode blev også vedtaget af vores industrielle partner som den primære screeningsmetode til at identificere nye forbindelser mod intracellulær M. tuberculosis 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bakteriestamme og Vækst Medium
- Gøre albumin dextrose og salt stamopløsning (ADS) ved at opløse 25 g bovint serumalbumin, 10,0 g dextrose og 4,05 g natriumchlorid i 460 ml deioniseret vand. Filter-sterilisere ADS og opbevares ved 4 ° C.
- Gøre 7H9 bouillon ved tilsætning af 4,7 g af 7H9 pulver og 2 ml af glycerol til 900 ml renset vand. Autoklaver 7H9 bouillon ved 121 ° C i 10 min og lad den afkøle til stuetemperatur, før der fortsættes. Gøre 7H9ADST ved tilsætning af 100 ml ADS og 0,5 ml Tween80 til 900 ml af 7H9 bouillon. Opbevares ved 4 ° C.
- Afvejes 50 mg kanamycinsulfat og opløses i 1 ml deioniseret vand; slutkoncentrationen er 50 mg / ml. Filtersteriliser og opbevares ved -20 ° C. Tilsæt 0,5 ml kanamycin stamopløsning pr 1 L 7H9ADST.
BEMÆRK: Dette medium bør gøres frisk, så skalere volumener passende ifølge kultur størrelse. - Grow M. tuberculosis i 7H9ADST suppleret med kanamycin i stillestående kultur. Ryst kultur dagligt og fortynde det før OD600 når 1,0 for at undgå klumpning.
BEMÆRK: M. tuberculosis-stamme anvendes til udvikling af denne metode blev H37Rv transformeret med pJAK2.A plasmid 12. pJAK2.A er en integrativ plasmid baseret på pMV361-vektoren, hvilket muliggør ekspression på højt niveau af ildflue-luciferasegenet fra hsp60 promotor og kan vælges ved hjælp kanamycin.
2. THP-1 medium og vedligeholdelse
- Tilsæt 50 ml varmeinaktiveret kalvefosterserum (FBS) og 5 ml 200 mM L-glutamin til 500 ml RPMI 1640 at gøre RPMI ufuldstændig medium (ca. 10% FBS og 2 mM glutamin).
- Opretholde en THP-1-cellekultur ifølge standardprotokol 13. Kort beskrevet vokse THP-1-celler i RPMI ufuldstændig medium samtidig opretholde en celledensitet på 0,2 til 1 million pr ml medium mellem pasvismænd.
3. Højkapacitetsforskning Intracellulær Screening Brug Luciferase-udtrykkende M. tuberculosis H37Rv
- Mål den optiske densitet af en aktivt voksende bakteriesuspension i et spektrofotometer ved en bølgelængde på 600 nm. Beregne bakterietætheden anvendelse af omregningsfaktor på 0,1 OD600 = 3 x 10 7 bakterier per ml.
- Pipette ud tilstrækkelige bakterier for en infektionsmultiplicitet (MOI) på 10: 1 i en ny centrifugerør. Pellet ved 3000 xg i 10 minutter og indsuge væsken. Tilsættes 50 pi humant serum til 450 pi af RPMI1640. Skalere volumenet til passende værdier til eksperimentet.
- At opsonisere bakterierne, resuspender pellet ved en densitet på 1 x 10 8 bakterier pr 500 pi af RPMI1640 indeholdende 10% humant serum. Lad blandingen inkubere ved 37 ° C i 30 minutter. Bestemme THP-1-cellekultur tæthed ved tælling med et hæmocytometer og et inverteret microscope.
- Pelletere cellerne i sterile centrifugerør ved 100 xg og 37 ° C i 10 minutter. Aspirere supernatanten og resuspender cellerne i RPMI ufuldstændig ved en densitet på 1 million celler pr ml. Tilføj phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) til en 40 ng / ml slutkoncentration.
BEMÆRK: Dette vil blive omtalt som differentiering mix. - Kombiner opsoniseret M. tuberculosis med THP-1 differentiation blanding ved en MOI på 10: 1 og udportionerer slutblandingen ved 100 pi per brønd i en 96-brønds fladbundet hvid plade. Regelmæssigt omrøre blandingen for at sikre ensartethed. Tillade differentiering og infektionen forløbe natten over ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO2.
- Brøndene vaskes to gange med 100 pi RPMI hver. Tilføje forbindelser fortyndet til de ønskede koncentrationer i RPMI ufuldstændig og inkuberes i 3 dage.
- Aspirer mediet fra brøndene. Der tilsættes 50 pi luciferaseanalysereagens til hver brønd. Forsegl pladerne med transparent klæbende pladeforseglere. Tillad 5 minutters inkubation ved 22 ° C og derefter opnå en udlæsning i et luminometer ved 1 s pr.
4. Cytotoksicitet analyse ved hjælp af et 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay 14
- Differentiere THP-1-celler i RPMI ufuldstændig suppleret med 40 ng / ml PMA i klare plader med 96 brønde. Opretholde en celledensitet på 1 million pr ml og alikvot 100 pi per brønd. Tillad differentiering at forløbe natten over ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO2.
- Aspirer mediet fra brøndene og vaskes to gange med RPMI 1640. Tilføj forbindelser fortyndet i RPMI ufuldstændige til brøndene. Der inkuberes i 3 dage.
- Opløs 0,5 g MTT i 100 ml phosphatbufret saltvand (PBS) for at lave en stamopløsning af 5 mg / ml. Sterilt filter og opbevares ved -20 ° C, væk fra lys; er det bedst at gøre denne løsning frisk.
- 2,5 timer before udgangen af den 3-dages inkubationsperiode, tilsættes 25 pi MTT-opløsning til hver brønd og fuldføre inkubationsperioden.
- Forbered 50% N, N-dimethyl formamid (DMF) ved blanding af 250 ml DMF med 250 ml deioniseret vand.
- Forberede MTT ekstraktionsbuffer som følger: Afvej 100 g SDS i en 500 ml flaske og tilsæt 300 ml 50% DMF. Anvende lav varme til at tillade SDS at opløses. Der tilsættes 10 ml ren eddikesyre og 12,5 ml 1 M HCI. Fyld op til 500 ml mærket med 50% DMF; den endelige sammensætning af ekstraktionspuffer er 50% DMF, 20% SDS, 2,5% eddikesyre og 2,5% 1 M saltsyre.
- Ved afslutningen af behandlingsperioden, tilsættes 100 pi ekstraktionsbuffer (opvarmet til 45 ° C for at opløse eventuelle krystaller) til hver brønd. Lad blandingen inkuberes natten over ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO2. Læse absorbansen ved 570 nm.
BEMÆRK: Cytotoksicitetsassay'et er bedst udføres parallelt med en intracellulærskærm ular anvendelse af samme parti og alder af THP-1-celler.
5. I-bouillon Activity Analysis Ved hjælp af en Resazurin Assay 3
- Grow M. tuberculosis i 7H9ADST til midt-log-fase (-0,5 - 0,8 OD 600). Fortynd kulturen med 7H9ADST til 0,01 OD600. Fortynd forbindelserne i 7H9ADST til 2x koncentrationerne forsøg og aliquot 100 pi af hver fortyndede forbindelse i hver brønd.
- Overføre 100 pi af den fortyndede bakteriesuspension i hver brønd. Tillad pladerne til at inkubere ved 37 ° C i en fugtig inkubator i 5 dage. Opløs 10 mg resazurin i 100 ml deioniseret vand og sterilt filter.
- Tilsæt 30 uL resazurin løsning og overvåge farveskift efter 48 timer; bakterievækst angives med en farve konvertering fra blå til pink.
BEMÆRK: En kvantitativ analyse kan også udføres ved at måle enten fluorescensen ved 590 nm med excitation ved 530 - 560nm eller absorbansen ved 570 nm og 600 nm 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
High-throughput intracellulær screening under anvendelse af M. tuberculosis, der udtrykker luciferasegenet
Figur 2A og Tabel 1 indeholder de rå data indsamlet af luminometeret, udtrykt i relative luminescerende enheder (RLU), der viser virkningen af en stigende koncentration af TB lægemiddel rifampicin på M. tuberculosis inde THP-1-celler. Figur 2A er et scatter plot af rå luminescens målt i RLU for forskellige koncentrationer af rifampicin. De fejl søjler indikerer standardfejlen af middelværdien (SEM). Figur 2B viser reduktion procent i luminescens i behandlede brønde i sammenligning med de ubehandlede brønde. Dataene viser, at rifampicin er stand til at reducere> 99,9% af RLU fra intracellulære M. tuberculosis i en koncentration på 0,1 pg / ml. Dette er i overensstemmelse med den previously offentliggjort MIC mellem 0,1 og 0,4 pg / ml 16. Producerede luminescens i hver brønd er en indikation af den samlede luciferase udtrykt af M. tuberculosis og er således en indikator for den metaboliske status M. tuberculosis inde i brønden. Det er normalt for rå luminescerende niveauer til at variere mellem forsøgene. Som sådan ville en sammenligning af rådata generere upålidelige konklusioner. Således bør dataene normaliseret mod et defineret negativ kontrol, hvilket ville være prøverne behandlet med DMSO alene. De resulterende værdier kan udtrykkes som den procentvise reduktion i M. tuberculosis i brøndene (figur 2B).
Cytotoksicitet analyse under anvendelse af MTT-analysen
MTT assayet er en veletableret assay for eukaryot cytotoksicitet. Denne kolorimetriske analyse indikerer levende celler ved konvertering af MTT (gult)lilla-farvet formazan. Dette assay udføres uden et M. tuberculosis-infektion, fordi bakterierne er i stand til at metabolisere MTT, hvilket reducerer den observerede toksicitet af forbindelserne. En fælles forslag for MTT-assayet er at anvende medier uden pH-indikator phenolrødt grund af absorptionen ved 570 nm 17. Men det syrnede ekstraktionsbuffer beskrevet i denne metode er i stand til at minimere interferens forårsaget af phenolrødt 17.
Figur 3 illustrerer cytotoksicitet forårsaget af en stigende koncentration af en testforbindelse kodet G1-1H. Normalt er en 50% inhiberende koncentration (IC50) anvendes til at indikere niveauet af cytotoksicitet. I tilfælde af G1-1H, koncentrationer på 10 uM og 3 uM ligger klart under IC50 koncentrationen.
I-bouillon aktivitet analyse osing af resazurin assay
Den resazurin assayet er almindeligt anvendt til analyse af cytotoksicitet i eukaryote celler, men den kan også anvendes til at overvåge levende bakterier i bouillon 3. Den resazurin assay er en redox-baseret assay svarende til MTT-assayet. Den måler NADPH niveauer og NADPH dehydrogenaseaktivitet ved konvertering af resazurin i resorufin, en rød fluorofor. Den nemmeste og hurtigste måde at afgøre narkotika effekt er at kigge efter den laveste behandling koncentration, hvor brøndene forblive blå i farven. Figur 4 viser en del af en 96-brønds plade, der viser virkningerne af forskellige koncentrationer af de antibiotiske apramycin har på resazurin omdannelse af M. tuberculosis. I-bouillon MIC blev bestemt til at være mellem 2,5 og 5 ug / ml. Dette er lidt højere end den tidligere offentliggjorte værdi på 1,5 ug / mL 18, men det er stadig godt inden for acceptable rækkevidde. I mange tilfælde farveskiftet er temmelig gradvis, så det er vanskeligt at foretage en sikker bestemmelse. Under disse betingelser, er det bedre at kvantificere faktiske mængde af resazurin omdannelse ved hjælp af enten absorbans eller fluorescens. På grund af de tilsvarende absorbanskarakteristika af resazurin og resorufin, bestemmelse af MIC anvendelse absorbans kræver målinger under anvendelse af to forskellige bølgelængder og komplekse beregninger 15. Derfor er den bedste metode er at måle fluorescens under anvendelse af 530- til 560-nm excitationsbølgelængder og en 590-nm emissionsbølgelængde, som beskrevet i fabrikantens litteratur 15.
Figur 4 illustrerer en potentiel kilde til uoverensstemmelse forbundet med multiday inkubationer, der kunne drastisk ændrer screening resultater. På grund af forkert befugtning af 37 ° C inkubator, der anvendes til dette forsøg, brønde på kanterne af p sidste udkald lidt betydeligt mere fordampning. Alle 15 DMSO-behandlede brønde formodes at være identiske, men brøndene langs venstre og topkanter havde reduceret mængder. Disse brønde synes også at have forskellige farver end de andre DMSO-behandlede brønde i midten af pladen. Den samme uoverensstemmelse kan også iagttages i 2,5 ug / ml apramycin-behandlede brønde. I dette tilfælde ville den reducerede mængde også føre til en kvantitativ aflæsning med et spektrofotometer og fluorometer. Fordampning bliver signifikant for alle eksperimenter med længere inkuberingstider, så skal man være omhyggelig for at holde inkubatorer godt befugtet at undgå denne kilde til uoverensstemmelse.
Figur 1: Metode Skema. Diagram, der viser assay skemaer for 3 separate moduler af højkapacitetsscreening system. _upload / 55.273 / 55273fig1large.jpg" target = '_ blank'> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative data fra en Intracellulær at undersøge effektiviteten af Rifampicin i Eliminering M. tuberculosis inde THP-1 celler. (A) Graf over den gennemsnitlige luminescens læsning (i relative luminescensenheder) for hver (rifampicin) koncentration behandling. Fejlsøjlerne angiver standardfejlen på middelværdien for hver triplikat. (B) Graf over den beregnede procentvise reduktion i luminescens forårsaget af en behandling af rifampicin, hvor højere værdier indikerer større effektivitet. 90% inhiberende koncentration (IC90) i dette tilfælde er et sted mellem 0,01 og 0,1 ug / ml.nk "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative data fra en cytotoksicitet (MTT) assay til at undersøge de giftige virkninger af forbindelse G1-1H på Differentierede THP-1 celler. Graf over den beregnede "procent af kontrol" værdier for hver koncentration af behandlingsforbindelsen G1-1H, hvor højere værdier indikerer sundere THP-1-celler. IC50 i dette tilfælde er et sted mellem 10 og 30 uM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative data fra en Resazurin assay til at undersøge Eeffekti- viteten af AMP til inhibering M. tuberculosis In-bouillon. Kun kvalitative data er indsamlet i dette tilfælde på grund af udstyr begrænsninger i biosikkerhed niveau 3 (BSL3) lab. Billedet viser en del af en 96-brønds plade indeholdende M. tuberculosis behandlet med enten DMSO eller varierende mængder af apramycin. De DMSO-behandlede brønde udviste en omdannelse af resazurin til resorufin, som fremgår af farven konvertering fra blå til pink. De apramycin-behandlede prøver klart undergik farvekonverteringen under 5 pg / ml. Klik her for at se en større version af dette tal.
| [Rifampicin] | Rep1 | Rep2 | Rep3 | % Reduktion | |
| 4 ug / ml | 184 | 190 | 210 | 195 | 100 |
| 1 pg / ml | 244 | 215 | 159 | 206 | 100 |
| 0,1 ug / ml | 1037 | 731 | 976 | 915 | 98 |
| 0,01 ug / ml | 19200 | 24400 | 23.919 | 22506 | 54 |
| 0 pg / ml | 39.877 | 49.655 | 57.728 | 49.087 | 0 |
Tabel 1: Rådata fra luciferase assay til bestemmelse af den intracellulære IC90 af rifampicin.
| [G1-1H] | Rep 1 A570 | Rep 2 A570 | Rep 3 A570 | Gennemsnitlig A570 | % Af ubehandlede |
| 30 uM | 0,056 | 0,056 | 0,055 | 0,056 | 7 |
| 10 uM | 0,518 | 0,488 | 0,492 | 0,499 | 62 |
| 3 uM | 0,652 | 0,638 | 0,656 | 0,649 | 80 |
| 0 uM | 0,822 | 0,782 | 0,815 | 0,806 | 100 |
Tabel 2: Rådata fra MTT Assay til bestemmelse af Cytotoksicitet af Testforbindelse G1-1H på different Koncentrationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denne undersøgelse var at skabe en enkel og omkostningseffektiv HTS fremgangsmåde under anvendelse af en human intracellulær infektion model for M. tuberculosis. Tuberkulose er en human sygdom karakteriseret ved infektion af alveolære makrofager af M. tuberculosis. På grund af biosikkerhed spørgsmål, har forskning med biologiske modeller af både bakterien og værten cellerne blevet anvendt i fortiden. Det har imidlertid vist sig, at brugen af surrogat bakterier og ikke-menneskelige modeller er dårlige prædiktorer for hit-til-bly succes i lægemiddeludvikling, hvilket indikerer, at screening stof gøres bedst med humane celler inficeret med M. tuberculosis 19, 20, 21, 22.
Ved denne fremgangsmåde har vi avanceret og tilpasset aktuelle state-of-the-art screeningsprotokoller for den humane makrofag-lignende THP-1-celle-linje. For at opnå højgennemløb, vi indført flere tekniske forbedringer af infektionen protokol. Først og fremmest, erstattet vi alle trin, der er involveret i CFU beslutsomhed og erstattet dem med en luciferase-baserede reporter-system. Ildflueluciferase blev valgt på grund af den enkle endepunkt-assay, den hurtige nedbrydning af værtscelle lysosom-enzymer, og de minimale krav til udstyr. Denne substitution effektivt elimineret en 30-dages inkubationsperiode samt arbejds- og hjælpematerialer omkostninger forbundet med plating og koloni-tælle trin.
En anden væsentlig forbedring introducerede vi var batchbehandling og infektion, som yderligere forbedrer gennemløb og sammenhængen mellem brøndene med en enklere infektion protokol. Ved at kombinere differentierings- og infektion trin til et enkelt trin, var vi i stand til at forkorte protokollen ved én dag. Samtidig var vi i stand til at reducere de tre runder af vask, der normalt ville opstå mellem differentiering og infection, hvilket er en kilde til mulig THP-1-tab på grund af frigørelse.
Denne protokol blev udviklet til screening inde i THP-1-cellelinien, som giver flere fordele. THP-1, som en immortaliseret cellelinie, kan være pålideligt dyrket in vitro i mere end 20 passager 23. Dette er især vigtigt for store screening kampagner, hvor det kan være en udfordring at opretholde nok celler til at levere en høj-throughput setup. Derudover, afprøvning i THP-1 tilvejebringer en homogen genetisk baggrund, der minimerer variation i resultaterne. Dette er yderst gavnlig for testforbindelserne, der påvirker værtens cellereaktioner 10. Som en ekstra bonus, kan genekspression i THP-1-cellelinien nedreguleres af små interfererende RNA'er (siRNA'er) 24. Dette tilvejebringer et værdifuldt redskab for downstream undersøgelser af virkningsmekanismen af hit-forbindelser. Selv om denne fremgangsmåde er designet ved anvendelse af THP-1-cellelinien, detkan let tilpasses til humane primære celler, såsom mononukleære celler fra perifert blod (PBMC), som tidligere blev vist 10.
For bedst at efterligne den faktiske interaktion mellem alveolære makrofager og M. tuberculosis, det intracellulære assay protokol indbefatter et trin til opsonisere bakterierne. Opsonisering med humane serum frakker M. tuberculosis og letter adgangen cellen via komplement receptor 3 (CR3) 25. Nøgne bakterier er mere tilbøjelige til at indtaste makrofager via lectin receptor 8. Eftersom bronkoalveolær væske vides at indeholde komponenter af human serum 25, opsonisering, eller mangel på samme, kan have en afgørende indflydelse på screening resultat. Imidlertid kan nogle vælger at springe dette trin for yderligere at forenkle infektionsprocessen 16, eller det kan ikke være muligt at opnå tilstrækkelig humant serum på grund af størrelsen af library screenes 11.
Den intracellulære assay indbefatter et trin til fjernelse af al væske indeholdende ikke fastgjort materiale fra brøndene inden tilsætning af luciferase-reagenset. Dette trin er designet til at øge signal-støj-forholdet samtidig reducere mængden reagens, der anvendes pr. Optagelsen af dette trin kan dog generere falske positive data for forbindelser, der dræber THP-1, men ikke M. tuberculosis, da fritliggende og lyseret THP-1 og frit flydende M. tuberculosis ville blive fjernet. Derfor bør producentens foreslåede protokol med tilsætning lige mængder af luciferase-reagens (100 pi) til hver brønd skal følges for at analysere for M. tuberculosis overlevelse i brønde indeholdende cytotoksiske forbindelser.
I modsætning til den ildflue-luciferase-systemet, er det bakterielle lux-systemet ikke kræver eksterne reagenser til signalgenerering 26. Imidlertid,ildflue-systemet foretrækkes i forhold til lux-system af følgende grunde: For det første kan den bakterielle systemet være toksisk i mycobakterier 26. Sekund, en mere kompleks reportersystem (5 gener for lux versus 1 genet for ildflue) er mere modtagelig for signalere inhibering med testforbindelser. Endelig kommercielt tilgængelige reagenser til ildflue-luciferaseassayet tilvejebringe de nødvendige betingelser for optimal signal generation. På den anden side, det bakterielle luciferase system er baseret på ATP-produktion og cofaktorerne stede inde bakterierne for signal generation. Disse kan variere mellem forskellige behandlinger og er ikke så let at kontrollere. Tilsætning af luciferase-reagens til ildflue systemet standardiserer reaktionsbetingelserne og giver mere pålidelige målinger af luciferaseaktivitet på tværs af alle behandlinger.
CFU bestemmelse har længe være den gyldne standard for at kvantificere bakteriel densitet. I kontrakt, Bioluminescence, ligesom de fleste journalister, er ikke et direkte mål for bakterier. I stedet RLU er en funktion af både CFU og metaboliske tilstand af bakterierne. Andre har vist det meste lineære forhold mellem RLU og CFU for bioluminescerende mycobakterier under specifikke betingelser 5. Under alle omstændigheder, en signifikant reduktion i luciferase assaysignalet, uanset den underliggende årsag-anden end den faktiske inhibering af luciferaseenzymaktiviteten-ville indikere en reduktion af M. tuberculosis egnethed inde i værtscellen. Derfor ville disse forbindelser være af interesse fra en medikamentscreeningsanalyse synspunkt og bør ikke udelukkes i udvikling metode.
Et alternativ til den luciferase-baserede intracellulær screeningsprotokol er den automatiserede fluorescensmikroskopi tilgang 11, 27, 28, 29. den luciferaseassay produktion måles ved et luminometer, og de opnåede data er kvantitativ, hvorimod fluorescensmikroskopi genererer billeder, der er kvalitative. Men gennem klog computer programmering, billeder kan analyseres for at generere kvantitative data. Endvidere fluorescensmikroskopi tillader, flere fluoroforer, der skal anvendes samtidig, hvilket er meget nyttigt for indsamling værdifulde parametre såsom cellelevedygtighed, celletal, og faktiske sats for infektion. Som man kunne forudsige, disse fordele kommer med nogle tilbageslag. Den indledende investering på automatiseret fluorescerende mikroskopi udstyr er mange gange større end prisen på et luminometer eller fluorometer, og er derfor uden for rækkevidde for mange forskningslaboratorier. For dem, der har adgang til det udstyr, skal den prøve behandling overvejes før erhvervelse billede og dataanalyse. Disse to trin påvirke den samlede tid investering med stigninger i biblioteket størrelse. Medtagelse af yderligere fluorescerende mærker i værtsceller requires fastsættelse farvning, og vasketrin, hvilket nødvendiggør yderligere brugerinput og tid investeringer. Endvidere fluorescerende indsamling mikroskopi data og analyse, selvom automatiseret, kræver stadig betydeligt mere tid og ressourcer end den simple luciferaseassay udlæsning. Derfor luciferasereporteren-baserede intracellulær screening metode er enklere og i stand til højere gennemløb.
Luciferase-baserede intracellulær screening metode har en betydelig begrænsning i forhold til fluorescerende mikroskop-baserede screeningsmetoder. Dette skyldes det faktum, at luciferaseanalyse giver ingen data vedrørende sundhedsstatus vært makrofager. Cytotoksiske forbindelser ville forårsage døden for makrofager, og dermed levende bakterier kan frigives i mediet, og ville ikke længere bidrager til det endelige luciferaseassay signal. Som følge heraf ville cytotoksiske forbindelser synes at forårsage døden for intracellulære M. tuberculosis og dermed generatea stort antal falske positiver. For at løse dette problem, har vi suppleret vores metode med en MTT-analyse for at vurdere cytotoksicitet af forbindelser på værten makrofager. Dette modul af screeningen metode giver os yderligere oplysninger om drugability af forbindelser af interesse og giver mulighed for tidlig fjernelse af mindre-end-ideal lægemiddelkandidater.
Alternativt kan man også anvende luciferase-baserede intracellulær assay før udførelse af automatiseret fluorescensmikroskopi. I skærme af store sammensatte biblioteker, dette giver mulighed for en hurtig og effektiv vurdering af forbindelsen effektivitet i makrofaginfektion model. Som et resultat, kan automatiseret fluorescensmikroskopi reserveres til detaljerede undersøgelser af bedre kandidater, som illustreret ved en tidligere offentliggjort undersøgelse 11.
De lave omkostninger og enkel karakter af luciferase-baserede intracellulære assay også i høj grad gavner forskere, der ønsker at teste småare kemiske biblioteker. Samlet set har luciferase-baserede intracellulær analyse vist sig at være et yderst fleksibelt værktøj til forskningslaboratorier i alle kalibre og til screening af projekter i forskellige størrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
| Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
| Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
| kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
| 1 M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
| Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| M. tuberculosis H37Rv | |||
| 96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
| 95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
| Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
| Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
| luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |
References
- WHO. Global tuberculosis report 2015. , WHO. (2016).
- USFDA. FDA news realease. , Available from: http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm (2012).
- Yajko, D. M., et al. Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).
- Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).
- Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).
- Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1, 57 (2010).
- Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis. Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).
- Ramon-Garcia, S., et al. Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen. Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).
- Lam, K. K., et al. Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog. 8, e1002691 (2012).
- Sorrentino, F., et al. Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62, 158-165 (2009).
- ATCC. THP-1 (ATCC TIB-202). , Manassas. https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx (2016).
- Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).
- Invitrogen. AlamarBlue assay. , Invitrogen. (2008).
- Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction. Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).
- Riss, T. L., et al. Cell Viability Assays. , (2004).
- Meyer, M., et al. In vivo efficacy of apramycin in murine infection models. Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).
- Ballell, L., et al. Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis. ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).
- Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice. FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).
- Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).
- Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B. Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).
- Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , Springer International Publishing. 147-159 (2015).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. J Vis Exp. , e51960 (2014).
- Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid. Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).
- Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria. PLoS One. 5, e10777 (2010).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. , e51114 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5, e1000645 (2009).
- Pethe, K., et al. Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis. Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).
