Summary
Organotypic hippocampus skive kulturer (OHSC) repræsenterer en in vitro- model, der simulerer i vivo situationen meget godt. Her beskriver vi en vibratome-baseret forbedret udskæring protokol for at opnå høj kvalitet skiver til brug ved vurderingen af neuroprotektive potentiale af nye stoffer eller den biologiske opførsel af tumorceller.
Abstract
I organotypic hippocampus skive kulturer (OHSC) er de morfologiske og funktionelle egenskaber af neuroner og gliaceller velbevaret. Denne model er velegnet til at håndtere forskellige forskningsspørgsmål, der involverer studier på neuroprotection, elektrofysiologiske eksperimenter på neuroner, neuronal netværk eller tumor invasion. Hippocampus arkitektur og neuronal aktivitet i multisynaptic kredsløb er godt bevaret i OHSC, selv om proceduren udskæring for sig selv i første omgang læsioner og fører til dannelsen af et glial ar. Ar-dannelse ændrer formentlig de mekaniske egenskaber og diffuserende opførsel af små molekyler, osv. Skiver tillader overvågning af tid brugerafhængige processer efter hjerneskade uden dyr operation, og studier på interaktioner mellem forskellige hjerne-afledte celletyper, nemlig astrocytter, mikroglia og neuroner under både fysiologiske og patologiske betingelser. En ambivalent aspekt af denne model er manglen på blodgennemstrømningen og blod immunceller. Under progression af neuronal skade, du overflytter immunceller fra blod spiller en vigtig rolle. Da disse celler er mangler i skiver, kan de iboende processer i kulturen ses uden indblanding udefra. Desuden i OHSC er sammensætning af medium-eksterne miljø netop kontrollerede. En yderligere fordel ved denne metode er det lavere antal ofrede dyr i forhold til standard præparater. Flere OHSC kan være fremstillet af et dyr at samtidige studier med flere behandlinger i ét dyr muligt. Af disse grunde OHSC er velegnede til at analysere virkningen af nye beskyttende therapeutics efter vævsskader eller under tumor invasion.
Protokollen præsenteret beskriver her præparationsmetode af OHSC, der tillader generere meget reproducerbar, velbevaret skiver, der kan bruges til en række forskellige eksperimentelle forskning, ligesom neuroprotection eller tumor invasion undersøgelser.
Introduction
OHSC er et godt karakteriseret i vitro model til at studere både fysiologiske og patologiske egenskaber af neuroner, astrocytter og mikroglia1. Det er let at kontrollere det ekstracellulære miljø og overvåge de cellulære og morfologiske forandringer efter forskellige stimuli. Organisation af hippocampus neuroner og deres forbindelser er velbevaret efter forberedelse2,3. Ud af flere fordele, OHSC giver mulighed for overvågning af hjernen skade og tumor invasion uden animalske kirurgi. Seks til otte OHSC kan fås fra en enkelt gnaver hjerne. OHSC derfor bidrage til at reducere antallet af dyr og tillade afprøvning flere stof koncentrationer, genetiske manipulationer og forskellige læsion modeller i de samme dyr. I Skive-baserede assays, kan forsøgsbetingelser styres nøjagtigt. Derudover tid afhænger af udviklingen af patologiske tilstande som sekundære skader kan nemt overvåges af time-lapse billeddannelse.
I den givne protokol, oprindeligt etableret af Stoppini et al. 4, Forberedelsestrinnene er beskrevet og vigtige morfologiske vartegn for udvælgelsen af relevante skiver er fremhævet. Vi anbefaler fremstilling af postnatal dag 7-9 rotter eller postnatal dag 4-5 mus. I disse perioder viser OHSC en robust resistens over for mekanisk traumer og et stort potentiale for reorganisering af neuronal kredsløb. Derimod præparater fra embryonale eller voksne rotter hurtigt ændre deres struktur og mister deres organotypic morfologi under dyrkning og er derfor mindre egnet til at studere langsigtede processer i grundforskning5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. et andet kritisk punkt for overlevelsesraten for OHSC er tykkelsen af udsnittet, selv som diffusion og dermed næringsstofforsyning er begrænset12,13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med politikken for etik og politik for brug af dyr i Neuroscience Research, som er godkendt af de Europæiske Fællesskabers Rådet direktiv 2010/63/EU af Europa-Parlamentet og af Rådet for den Europæiske Union om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål.
1. forberedelse af instrumenter og kultur medier
- til forberedelse af OHSC bruge følgende sæt af instrumenter: to lille saks, to buet pincet, en pincet med en fin spids, tre knive, (to af størrelse 11, en af størrelse 15), tre skalpel indehavere, runde papirfiltre (diameter: 35 mm), agar, et barberblad, en uændret Pasteur pipette, og et ændret Pasteur pipette uden et tip. Sterilisere alle materialer i en autoklave før forbrug ( figur 1).
- Afvejes 5 g agar og opløse den i 100 mL destilleret vand. Sterilisere løsning i 20 min. ved 121.7 ° C på 210.8 kPa i en autoklave. Distribuere 3 mL flydende agar løsning i 60-mm petriskåle med sterilt glas pipette, gør det muligt at størkne for 5 h, dække med plast paraffin film at undgå kontaminering, og opbevares ved 4 ° C indtil videre brug. Agar blokke er nødvendige for at stabilisere hjerner under proceduren udskæring.
- Media
- gøre 200 mL af forberedelse medium (pH 7,35) består af 198 mL minimal afgørende medium (MEM) og 2 mL L-glutamin løsning (slutkoncentration 2 mM). Forberede løsningen på dagen for media forberedelse og gemme det på 4 ° C.
- Forberede 100 mL af substratet består af 49 mL MEM, 25 mL Hanks ' balanced salt løsninger (HBSS), 25 mL (v/v) normal hest serum (NHS), 1 mL L-glutamin løsning (slutkoncentration 2 mM), 100 µg insulin, 120 mg glukose, 10 mg streptomycin , 10.000 U penicillin og 800 µg C-vitamin som rapporteret tidligere. Varme medium (37 ° C), justere pH-værdien til pH 7,4 og sterile filter (0,2 µm porestørrelse). Gentag proceduren (varmer op, justering af pH mv.) hver anden dag før du ændrer mediet. Bruge mellemlang højst en uge når den opbevares ved 4 ° C.
- Udfylde en 35-mm petriskål med forberedelse medium til lagring af hjernen. Placer to tomme petriskåle til indsamler væv på en afkøling pack i arbejdsområdet.
2. Forberedelse og udskæring med en Vibratome
- Brug brains fra 7-9 dage gamle rotter eller 4-5 dag gamle mus forberedelsen OHSC ifølge Stoppini mfl. 4 efter halshugning af dyr, Fjern skindet fra kraniet med saks.
- Indføre bladet af en fin saks i foramen magnum og åbne kraniet ved at skære langs den caudale (tilbage) rostralt (front) akse. Gøre to skærer vinkelret på til den første, således at saks pege i retning af den venstre og højre øre, henholdsvis (" T-snit ").
- Åbne kraniet omhyggeligt med fine pincet, betale opmærksom på ikke at skade hjernen. Bruge en skalpel (klinge størrelse 11) til at skære den mest rostralt del af den frontale pol og lillehjernen.
- Ved hjælp af en spatel, fjerne hjernen og placere det omhyggeligt i petriskålen fyldt med forberedelse medium ( figur 2). Placer hjernen på præparatholderen og ordne det med medicinsk ren lim.. Bruge stykker af agar til at forsikre mekaniske stabilisering.
- Dissekere vævet vandret i 350 µm tykt OHSC ved hjælp af en glidende vibratome.
- Evaluere skiver optisk ved hjælp af en kikkert mikroskop. Kassere OHSC af lav kvalitet straks. Det er vigtigt at tage kun skiver med intakt cytoarchitecture isoleret fra den midterste del af hippocampus (se figur 3 og 4) mellem den dorsale og den ventrale hippocampus.
- Separat regionen hippocampus og entorhinal cortex ved hjælp af en skalpel (runde blade størrelse 15; figur 3). Perforant pathway og entorhinal cortex skal bevares.
- Seks til otte OHSC er fremstillet af hver hjerne. Overføre 2-3 skiver til én celle kultur Indsæt (pore størrelse 0,4 µm) og placere den i et godt af en 6-godt kultur skål indeholdende 1 mL næringssubstratet pr. brønd.
- Ruger 6-godt retter ved 35 ° C i en fuldt befugtet atmosfære med 5% (v/v) CO 2 og ændre cellekulturmedium hver anden dag.
Bemærk: Udføre dine eksperimenter på 6 dag i vitro (div). Inflammatoriske reaktioner forbundet med udskæring proceduren forsvinde ved dag 6. På dette stadium, microglial celler viser en forgrenet morfologi igen og synaptiske forbindelser har modnet.
3. Evaluering af væv kvalitet
- fiksering, mærkning og visualisering af udarter neuroner i OHSC
- efter udførelse af eksperimenter, Ruger OHSC med 5 µg/mL propidium Iodid (PI) for 2 h før fiksering, i for at pletten kerner af udarter neuroner.
Forsigtig: PI er mistænkt kræftfremkaldende, altid bære personlige værnemidler (PPE) såsom handsker. - Vaske OHSC med 0,1 M fosfat buffer (pH 7,4) og lave dem med en 4% (v/v) opløsning af PARAFORMALDEHYD (PFA) for 24 h.
Forsigtig: PFA er giftige og formodede kræftfremkaldende. Arbejde i stinkskab og bære PPE. - Vaske OHSC i skær med 1 mL PBS og bruge en rigger pensel til at adskille udsnit fra membranen.
- Mærke OHSC med IB 4 farvestof i en 24-godt plade ( figur 5).
- efter udførelse af eksperimenter, Ruger OHSC med 5 µg/mL propidium Iodid (PI) for 2 h før fiksering, i for at pletten kerner af udarter neuroner.
- Overledning af tumor invasion eksperimenter ved hjælp af fluorescently mærket enkelt celler
- 24 timer før starten af et eksperiment, navngive tumorcellerne ved hjælp af fluorescerende farvestof Carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester (CFDA SE).
- Detach og tælle tumorceller ved hjælp af en Neubauer afdeling.
- Resuspend celler i medium, således at 10 µL af suspension indeholder den ønskede celle nummer (normalt 50.000 eller 100.000 celler).
- Anvend 10 µL af cellesuspension på skive kultur og tillade cellerne til at invadere for 3 dage.
- i slutningen af forsøget, lave skive kulturer ved hjælp af 4% (v/v) PFA i 24 timer og mærke Co kulturerne med PI i en anden 24 timer til at visualisere cytoarchitecture.
Forsigtig: PFA er giftige og formodede kræftfremkaldende. Arbejde i stinkskab og bære PPE. - Montere Co kulturer på et cover slip til videre analyse ved hjælp af montering media.
4. Evaluering af OHSC eksperimenter
analysere OHSC med en Konfokal laser scanning mikroskop (CLSM). Til påvisning af PI mærket, udarter neuroner eller PI mærket cytoarchitecture bruger monokromatiske lyset af bølgelængde λ = 543 nm og en emission band pass filter til bølgelængde λ = 585-615 nm. For CFDA mærket tumorceller eller IB 4 mikroglia, bruge en excitation bølgelængde på λ = 488 nm. For både eksperimentelle typer, registrere et z-stakken med 2 µm tykt optisk skiver og bruges til evaluering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neuroprotection studier: For at bestemme neuronal skade, antallet af PI positive atomkerner og IB4 positive mikroglia i hver tredje optiske del af granulet cellelag (GCL) af den dentate gyrus (GD) blev optalt. For tumor invasion eksperimenter, blev maksimal intensitet z-projektion af stakken brugt til beregning af området er omfattet af tumorceller, som en foranstaltning af invasionen og visualisere forskellige invasion mønstre (figur 6).
I ubehandlet kontrol OHSC (CTL) forblev neuroner velbevarede. I DILI GD blev næsten ingen PI positive neuronal kerner (figur 5A) observeret. I den molekylære lag, blev fleste af microglial celler forgrenet. I DILI GD, kun meget få IB4 positive microglial celler (figur 5A) blev påvist. Efter inkubering med 50 µM N-methyl-D-aspartinsyre (NMDA) en stærk stigning i antallet af PI positive neuronal kerner (figur 5B) og IB4 positive microglial celler (figur 5B) blev påvist i forhold til at styre OHSC. Pre beskadigede OHSC af ringere kvalitet kan identificeres ved højere antal amoeboid mikroglia og PI positive celler i GD (figur 5 c) kontrol betingelser. Behandling af pre beskadigede skiver med NMDA førte til ødelæggelse af Generaldirektoratet for cytoarchitecture og et meget stort antal PI positive dødsceller spredes til hilum og CA3 region (fig. 5 d).
Tumor invasion studier: Skiver blev behandlet med 50.000 celler i de to glioblastom cellelinjer U138 (fig. 6A) og LN229 (fig. 6B) for tre dage. I begge tilfælde cytoarchitecture skive kulturer forblev intakt og cornu ammonis og GD blev bevaret. Desuden cellelinjer både viste forskellige invasion adfærd. Mens U138 celler dannes runde, klart adskilte tumorer (figur 6A), LN229 celler bygget en tumor netværk inden for enkelt tumor spheroids og var ofte svært at skelne. Når man ser på størrelsen af tumor massen i Skive kulturer, fandtes en højere invasionsevne for LN229 celler, sammenlignet med U138 celler.
Figur 1: dissektion værktøjer og materialer. For forberedelse af skive kulturer kræves der et passende sæt af dissektion værktøjer og materialer som vist. Sættet indeholder tre skalpeller med små ombyttelige vinger, en spatel, to fine saks, tre pincet, en normal Pasteur pipette, én Pasteur pipette uden tip, agar, petriskåle, filtrerpapir, en kølende pack, forberedelse medium og medicinsk ren lim. Dissektion værktøjer skal være autoklaveres før brug og placeret i en plast pakke til at holde det i en steril atmosfære. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: placering af hippocampus dannelse i rat brain. Hippocampus dannelse, vist af den sorte stiplede linje er en bilateral struktur omsluttet af hjernebarken og thalamus. Hippocampus buler i det tidsmæssige horn af den laterale ventrikel. Hippocampus er bilaminar, bestående af cornu ammonis (hippocampus korrekt) og dentate gyrus (eller fascia dentate), med en lamina rullet op indeni den anden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: visualisering af rotte OHSC. En hele hjernen skive indeholdende OHSC er visualiseret ved en kikkert til at vurdere væv kvalitet. Skiver er holdt i en petriskål, fyldt med afkølet forberedelse medium (A, B). Forstørrelse af hjernen skive. Intakt hippocampus (HC) og entorhinal cortex er synligt på den venstre og højre side af billedet (C). OHSC er adskilt fra resten af hjernen. Granulet cellelag (GCL) GD, cornu ammonis subfelter CA1 og CA3, hilus region (HI), entorhinal cortex (EF) og den molekylære lag (ML) er klart adskiller (D). C, D: skalalinjen = 4 mm.
Figur 4: Tid afhænger af ændringer i OHSC.
Direkte efter tilberedning, mikroglia og astrocytter begynde at danne et glial ar. Fra 1-3 dage i vitro (div) gliosis og ødem dannelse er observeret. Stratificering af hippocampus dannelse og GD er ikke længere synlig. På cellulært niveau vises OHSC på 5 div en reduktion i antallet af aktiverede celler. Næsten ingen ødem er til stede på 6 div, Skive er tyndere, og de områder, der er inkluderet i de iboende neuronal kredsløb har overlevet. OHSC kan nu bruges til forsøgene. Skalalinjen = 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: vurdering af væv kvalitet af CLSM. Som det fremgår af CLSM, er en god neuronal bevarelse observeret i den ikke-lesioned kontrol OHSC (CTL). Stort set findes ingen PI positive neuronal kerner (rød) og kun et par IB4 positive microglial celler (grønne) i granulet cellelag (GCL) af GD (A). I modsætning til ikke-lesioned OHSC er en stærk stigning i antallet af PI og IB4 positive celler synlige i DILI af NMDA-lesioned OHSC (B). Bemærk morfologi af GD, aktiveret microglial celler og et stort antal PI positive kerner i pre beskadigede OHSC (C, D). Barer = 50 µM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: visualisering af tumor invasion af CLSM. PI (i rødt) anvendes efter fiksering etiketter cytoarchitecture af OHSC, mens CFDA (i grønt) illustrerer tumorcellerne invaderer skive. Invasion processen af U138 celler er visualiseret efter tre dage af invasionen tid. Enkelt tumor spheroidser tydeligt kan skelnes (A). Derimod dannes glioblastom cellelinie LN229 en tumor netværk (B). Barer = 400 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver forberedelse af OHSC. Denne model giver mulighed for afprøvning af iboende evner og reaktioner af hjernevæv efter anvendelse af fysiologiske og patologiske stimuli. Ud over analyser af elektrofysiologiske parametre, OHSC kan være lesioned og virkningerne af skader på alle celletyper kan bestemmes. Behandling med forskellige stoffer og den detaljerede beskrivelse af lesioning processer eller healing i mangel af makrofager og lymfocytter er muligt.
The most kritiske trin til en vellykket forberedelse og dyrkningsbaserede er at: 1) arbejde under sterile forhold, 2) forberede medier korrekt, i betragtning af temperatur og pH, og 3) udvikle det nødvendige håndelag under håndtering af OHSC.
Karakteristik af OHSC
På grund af den uforandret morfologi af neuronale celler og deres i vivo-som organisation, skiver kaldes organotypic. OHSC består af stratum pyramidale og stratum granulosum, sammensat af pyramide cornu ammonis (CA1, CA2, CA3) og GD kornede celler. Dele af hippocampus er yderst bestilt og afferente fibre fremskrivninger opsige i forskellige lag i et ikke-overlappende måde. Efferences mellem entorhinal cortex (perforant vej), GD, CA3 og CA1 neuroner forbliver intakte efter udarbejdelsen og opføre sig funktionelt svarer til disse in vivo. Som tidligere vist, udvikling af dendritiske træer, synapse dannelse og netværk aktiviteter af de kornede celler i OHSC er sammenlignelige med akut skiver fra tid matchede kontrol14,15,16.
Oligodendrocytes og astrocytter er blevet undersøgt i OHSC af både lys og elektronmikroskopi. Oligodendrocytes vise en organotypic geografiske fordeling, herunder morfologiske undertyperne17,18. Også, axoner blive myelinerede i løbet af de første to uger in vitro. Nogle forfattere postuleret at lag specifikke lokalisering af astrocytter er fraværende i Skive kulturer og mener at astrocytter ikke når en fuld modning i vitro. Dette aspekt kan ikke besvares fuldt ud, da specifikke markører for alle aktivering trin i astrocytter stadig mangler1,19,20.
I de første 3 dage efter forberedelsen, microglial celler reagerer med migration og spredning og ophobes på skive overfladen hvor de danner glial arret sammen med astrocytter. Alle celler synes at være i en stærkt aktiveret tilstand. Men i de indre lag af OHSC og mellem 3 og 6 div, microglial celler ændre deres amoeboid morfologi mod en forgrenet form, karakteriseret ved små cellulære organer og lange forgrening fine cytoplasmatisk fremspring udvides i alle retninger21 ,22.
Lignende udtryk og distribution af glutamat receptorer er blevet rapporteret i voksent væv og OHSC2,23. Hyppigheden af synaptic strømninger, miniature synaptic strømninger og hyppigheden af GABAergic strømninger i OHSC (7, 14 og 21 div) ikke er signifikant forskellig i forhold til akutte præparater på postnatal dage 14 eller 15 henholdsvis. Derimod er glutamatergic signalers frekvens højere i OHSC end i akut skiver15.
Sammenligning af forskellige præparationsmetoder
Forberedelse af embryonale og tidlige postnatal væv er ganske let, på grund af den gode celle overlevelse satser in vitro. Det bør overvejes, at på dette tidlige stadium, de neuronale celler er stadig vandrende og aktive fører til et tab af organotypic organisation i skiver1. Efter 7-9 postnatal dage etableret nogle synaptiske forbindelser i rotter. I løbet af de næste 2-3 uger i vitro modne synapser13. En af fordelene ved den præsenterede model er dets resistens over for mekanisk traume under forberedelsen og dens høj plasticitet på grund af alder for dyr (7-9 dage)1,14,24. Det skal nævnes, at skiverne er meget følsomme over for mekanisk manipulationer af instrumenter. Selv den forkerte vinkel af udskæring kan forårsage hældning skæring af neuronal fibre ansvarlig for anterograd eller retrograd neuronal død. Forberedelse af skive kulturer fra voksne dyr til langsigtet formål er udfordrende og stadig ikke fastlagt. Sådan OHSC viser en massiv degeneration kort efter forberedelse formentlig på grund af tabet af plasticitet1. Alligevel er der et stærkt behov for en forberedelse metode giver mulighed for arbejde med voksne skiver.
For flere præparationsmetoder, er frisk skåret væv skåret til en tykkelse på 300-400 µm, ved hjælp af en væv chopper for at skære den isolerede hippocampus. Denne hurtig metode kan ofte resultere i omfattende vævsskader. Kritiske faktorer for kvaliteten af OHSC er deres endelige tykkelse og den tid de er holdt i vitro. De bedste resultater med de højeste overlevelsesrater har opnået for 300-400 µm tykke skiver. I tykkere skiver degenerere de øverste lag under kultur tid på grund af diffusion begrænsninger1. Afhængigt af de videnskabelige spørgsmål, der OHSC bruges enten direkte efter tilberedning eller efter flere dage i kultur. Derfor, i år flere dyrkningsmetoder blev etableret, som rulle-Tube teknik1,13 eller statisk skive teknikker4.
Ud af forskellige præparationsmetoder er vi overbevist om, at bruge interface teknik sammen med en vibratome er den mest præcise og mindst skadelige procedure for at forberede OHSC til dato. Denne metode er yderligere forbedret ved hjælp af porøse membraner. OHSC holde deres 3D struktur, bo morfologisk og funktionelt intakt for måneder og kan visuelt evalueres under dyrkning perioden25.
Applikationer
OHSC kan fremstilles af både vildtype og transgene dyr14,26. De overleve i flere måneder og giver muligheder for langsigtet eksperimenter12,13. OHSC bruges til at behandle fysiologiske, farmakologiske, morfologiske og udviklingsmæssige spørgsmål14,27 under meget standardized betingelser såsom kronisk anvendelse af neurotherapeutics eller stamcelle terapi26,27,28. Undersøgelsen af udviklingsmæssige aspekter af neuronal tilslutningsmuligheder eller processer relateret til synaptisk transmission, synaptisk plasticitet, virkninger af kronisk epilepsi af dendritiske pigge af pyramideformet celler, eller neurogenese alle repræsenterer yderligere felter 29,30,31,32.
Glutamat, primære excitatoriske neurotransmitter og ionotropic glutamat receptorer spiller en central rolle i excitotoxicity. Excitotoxic læsioner opstår under neurologiske sygdomme som slagtilfælde, Alzheimers sygdom, HIV neurotoksicitet, traumatisk hjerneskade og reparation mekanismer14,24. Anvendelse af glutamat receptor agonister NMDA, α-amino-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazolepropionic syre (AMPA) eller kainic syre OHSC efterligner selektive og regionen specifikke neuronal celle død26,28,33 ,34. Derudover glial celle respons til neuronal skade fx, microglial migration og fagocytose i OHSC har tidligere været analyseret3,35. Indflydelse af mikroglia under læsion kan forudsiges af farmakologiske nedbrydningen af disse celler af bisfosfonat clodronate36.
Et yderligere vigtigt program opstår efterligner i vivo betingelser for undersøgelser af tumor invasion ved hjælp af OHSC. Spheroids dannet af gliom cellelinjer var i stand til at invadere skive kulturer, et fænomen, der var arter overlappende37. Diffuse infiltration mønster af cellelinjer bruges lignede observerede mønster i vivo37. Derudover primære glioblastom spheroids implanteret i OHSC holdt deres invasion potentielle og stamceller karakter over flere dage i vitro38. Således, modellen giver mulighed for observation af invasion mønstre og interaktioner mellem neuronal væv og tumorceller, der svarer til dem, der observeres i vivo37,38. I forhold til kollagen eller gel synes baseret modeller (f.eks.)39, brug af OHSC mere fordelagtigt for analyser på metastaser og tumor invasion i hjernen. Den fysiologiske milieu, herunder neuronal og glial celletyper og ekstracellulære matrix, forbliver intakt.
Desuden kan OHSC tillade at studere direkte interaktioner mellem enkelt tumorceller og hjernevæv under kontrollerede forhold. For eksempel, blev microglial celler fundet til at forbedre de kapaciteter af tumorceller at trænge ind i hjernen ved at danne vejledende strukturer for invasion35.
Desuden, kan effekten af forbigående og permanent cellulære ændringer på invasion processer analyseres. En stabil udtryk for metastaser forbundet kolon kræft gen 1 (MACC1) i gliom celler var forbundet med en øget spredning og efterfølgende invasion40. Forbigående ændring af celle stivhed i glioblastom cellelinjer var direkte korreleret med celle linjer41invasive egenskaber. OHSC og tumor celle Co kulturer kan således potentielt anvendes til drug test, reproduktion af kliniske observationer, og at model og billede tumor invasion under stærkt kontrollerede og standardiserede betingelser.
Efter studier i primære cellekulturer er OHSC det logiske næste valg for at udføre eksperimenter i et mere komplekst system at tilnærme i vivo betingelser. Et andet område af interesse i hjernen skiver er screening af potentielle terapeutiske lægemidler før test in vivo. Hjernen skiver tillader overvågning og efterligne af skader under observatør kontrol og uden animalske kirurgi. Op til 8 OHSC kan opnås og antallet af nødvendige dyr reduceres betydeligt. Det er muligt at opnå resultater i de samme dyr under lignende indstillinger men med forskellige eller flere betingelser. OHSC er således et kraftfuldt værktøj til at observere blandt andre morfologiske, cellulære og molekylære ændringer under læsion periode, udvikling af sekundære skader og spredning af svulsten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at videregive
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Christine Auste for hendes støtte med video-optagelse og Chalid Ghadban for hans fremragende teknisk bistand. Urszula Grabiec blev støttet af Roux Programm FKZ 29/18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
References
- Gähwiler, B. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20 (10), 471-477 (1997).
- Bahr, B. A. Long-Term Hippocampal Slices: A Model System for Investigating Synaptic Mechanisms and Pathologic Processes. J Neurosci Res. 42 (3), 294-305 (1995).
- Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protoc. 2013 (12), 1142-1148 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kleinberger-Doron, N., Schramm, M. Culture of mature hippocampus slices for 4 days in a newly developed medium: preservation of transmitter release and leucine incorporation into protein. Brain Res. 533 (2), 239-247 (1990).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Res Bull. 84 (1), 39-44 (2011).
- Gähwiler, B. H. Organotypic Monolayer Cultures of Nervous Tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
- Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11 (11), 484-489 (1988).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocamal slice culture from the adult mouse brain: A versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Xiang, Z., Hrabetova, S., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J Neurosci Methods. 98, 145-154 (2000).
- Adamchik, Y., Frantseva, M. V., Weisspapir, M., Carlen, P. L., Perez Velazquez, J. L. Methods to induce primary and secondary traumatic damage in organotypic hippocampal slice cultures. Brain rRes Brain Res Protoc. 5, 153-158 (2000).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., Poulsen, F. R., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 4 (4), 435-452 (2005).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. a Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550 (Pt 1), 135-147 (2003).
- Poindrom, P., Piguet, P., Förster, E. New Methods for Culturing Cells from Nervous Tissues. , BioValley Karger. Basel, Switzerland. (2005).
- Berger, T., Frotscher, M. Distribution and morphological characteristics of oligodendrocytes in the rat hippocampus in situ and in vitro: An immunocytochemical study with the monoclonal Rip antibody. J Neurocytol. 23 (1), 61-74 (1994).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bonde, C., Sarup, A., Schousboe, A., Gegelashvili, G., Zimmer, J., Noraberg, J. Neurotoxic and neuroprotective effects of the glutamate transporter inhibitor DL-threo-beta-benzyloxyaspartate (DL-TBOA) during physiological and ischemia-like conditions. Neurochem Int. 43 (4-5), 371-380 (2003).
- Derouiche, A., Heimrich, B., Frotscher, M. Loss of layer-specific astrocytic glutamine synthetase immunoreactivity in slice cultures of hippocampus. Eur J Neurosci. 5 (2), 122-127 (1993).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
- Hailer, N. P., Wirjatijasa, F., Roser, N., Hischebeth, G. T. R., Korf, H. W., Dehghani, F. Astrocytic factors protect neuronal integrity and reduce microglial activation in an in vitro model of N-methyl-D-aspartate-induced excitotoxic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 315-326 (2001).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: A model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochem Res. 30 (12), 1521-1528 (2005).
- Guy, Y., Rupert, A. E., Sandberg, M., Weber, S. G. A simple method for measuring organotypic tissue slice culture thickness. J Neurosci Methods. 199 (1), 78-81 (2011).
- Grabiec, U., Koch, M., et al. The endocannabinoid N-arachidonoyldopamine (NADA) exerts neuroprotective effects after excitotoxic neuronal damage via cannabinoid receptor 1 (CB 1). Neuropharmacology. 64 (4), 1797-1807 (2012).
- Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Exp Neurol. 248, 429-440 (2013).
- Ebrahimi, F., Hezel, M., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. Analyses of neuronal damage in excitotoxically lesioned organotypic hippocampal slice cultures. Ann Anat. 192 (4), 199-204 (2010).
- He, S., Shao, L. R., Wang, Y., Bausch, S. B. Synaptic and extrasynaptic plasticity in glutamatergic circuits involving dentate granule cells following chronic N-methyl-D-aspartate receptor inhibition. J Neurophysiol. 109 (6), 1535-1547 (2013).
- Kann, O., Taubenberger, N., et al. Muscarinic receptor activation determines the effects of store-operated Ca2+-entry on excitability and energy metabolism in pyramidal neurons. Cell Calcium. 51 (1), 40-50 (2012).
- Pérez-Gómez, A., Tasker, R. A. Enhanced neurogenesis in organotypic cultures of rat hippocampus after transient subfield-selective excitotoxic insult induced by domoic acid. Neuroscience. 208, 97-108 (2012).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gähwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosc. 26 (2), 241-250 (2004).
- Pozzo Miller, L. D., Mahanty, N. K., Connor, J. A., Landist, D. M. D. Pyramidal Cell Death in Slice Cultures From Rat Hippocampus Is Prevented By Glutamate Receptor Antagonists. Neuroscience. 63 (2), (1994).
- Koch, M., Kreutz, S., et al. The cannabinoid WIN 55,212-2-mediated protection of dentate gyrus granule cells is driven by CB 1 receptors and modulated by TRPA1 and Ca v2.2 channels. Hippocampus. 21 (5), 554-564 (2011).
- Pukrop, T., Dehghani, F., et al. Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way. Glia. 58 (12), 1477-1489 (2010).
- Kohl, A., Dehghani, F., Korf, H. W., Hailer, N. P. The bisphosphonate clodronate depletes microglial cells in excitotoxically injured organotypic hippocampal slice cultures. Exp Neurol. 181 (1), 1-11 (2003).
- Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochem Biophys Res Commun. 269 (2), 513-520 (2000).
- Aaberg-Jessen, C., Nørregaard, A., Christensen, K., Pedersen, C. B., Andersen, C., Kristensen, B. W. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. Int J Clin Exp Pathol. 6 (4), 546-560 (2013).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Hagemann, C., Fuchs, S., et al. Impact of MACC1 on human malignant glioma progression and patients ' unfavorable prognosis. Neuro Oncol. 15 (12), 1696-1709 (2013).
- Hohmann, T., Grabiec, U., Ghadban, C., Feese, K., Dehghani, F. The Influence of Biomechanical Properties and Cannabinoids on Tumor Invasion. Cell Adh Migr. 11 (1), 54-67 (2016).
