Introduction
같은 소두증과 같은 인간의 신경 발달 장애는 단지 가난으로 인해 인간의 두뇌가 확장 된 대뇌 피질의 표면, 인간이 아닌 동물과는 다른 독특한 기능을 가지고 있다는 사실을 동물 모델에서 공부하실 수 있습니다.
이 측면은 인간의 두뇌 발달을 충분히 체외 세포 배양 시스템에서, 2 차원에서 연구 할 수없는 복잡한 과정을 수 있습니다. 신흥 3D 배양 기술은 유도 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)에서 조직 형 organoids의 생성을 허용한다. 차원 현탁 배양에서 다 능성 줄기 세포의 체외 분화 조직, 층상 조직의 1, 2, 3를 야기한, 적시 영역 특정 수단으로 각종 종류의 세포를 형성 할 수있다. 3D 문화 기술을 개척하고 줄기 세포에서 시작, 기관 형성의 복잡성을 신화화 실험실 덕분에,우리는 인간의 두뇌 발달의 초기 이벤트를 묘사하고 시험관 1, 2, 3 소두증을 모델링 뇌 organoids를 생성하는 강력한 방법을 개발했다. 우리가 랭카스터 동부 등에 의해 개발 된 일본어 방법을 채택하는 것이 주목된다. 대뇌 organoids 1을 생성한다. 이 방법은 우리의 실험 요구 사항에 따라 수정되었습니다.
가브리엘 등의 알에서 연구의 목적. 두뇌 개발하는 동안 신경 줄기 세포의 유지 보수의 세포 및 분자 메커니즘을 분석했다. 이를 위해, 기계 론적 연구는 소두증 환자 4에서 파생 된 3D 뇌 organoids에서 신경 전구 세포 (NPC들)을 분석하여 수행되었다. 이 환자는 CPAP, 중심체 생합성 5에 필요한 보존 centrosomal 단백질에 돌연변이를 실시했다. 널리 인정 저자논문 소두증는 NPC 풀의 고갈의 결과 인 것으로하고,이 중 세포 사멸 또는 분화 조기 1, 6, 7, 8, 9에 기인 할 수있다.
소두증 뇌 organoids의 심실 영역 (VZs)를 분석함으로써, NPC의 상당수는 건강한 공여체 (4)로부터 유도 뇌 organoids 달리 비대칭 세포 분열을 겪는 것으로 나타났다. 소두의 뇌 organoids의 광범위한 현미경 및 생화학 분석은 적절 섬모의 분해 4 CPAP에 대한 예기치 않은 역할을 한 것으로 밝혀졌습니다. 구체적으로는, 돌연변이가 CPAP NPC의 조기 (4)의 분화를 초래 지연 섬모 분해 지연 세포주기 재진입와 연관된다. 이러한 결과는 소두증과 일에 섬모의 역할을 제안신경과 뇌의 크기 제어 10시 EIR 참여.
이 프로토콜의 첫 번째 부분은 뇌 균질 organoids를 생성하는 세 단계 방법의 설명이다. 앞서 언급 한 바와 같이, 원래 랭커스터 프로토콜은 적응하고 우리의 목적 (1)에 맞게 수정되었습니다. 첫째, 인간 iPSCs는 Engelbreth-Holm이 - 스웜 (EHS) 행렬에 정의 된 장치가없는 상태에서 배양했다. 이 단계는 공급에 의존하는 만능 줄기 세포 배양의 변화를 방지 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 신경 분화 유도 신경 상피 iPSCs로부터 시작 형성한다. 배아 체 (EB)의 형성 공정, 및보다 제어 지시하게 신경 분화의 진행을 스킵함으로써. 이 방법은 중배엽 및 내배엽 다른 생식 세포 층의 자발적 무향 형성을 제한한다. 이 프로토콜을 적용하여, 신경 근엽을 포함 neurosphere를가 EH을 위해 5 일에 수확 할 수있다S 행렬 삽입 및 고정 현탁 배양. 우리 프로토콜의 세 번째 단계에 사용 된 배지는 유사 장기 dorsomorphin 및 SB431542로 보충된다. Dorsomorphin 뼈 형태 형성 단백질 (BMP)의 소분자 억제제 및 SB431542은 TGFβ / 티빈 / 절점 신호 전달 체계를 억제한다. 이러한 요인들의 조합은 신경 분화를 더 효율적으로 단독보다 11, 12, 13, 14, 레티노 산을 촉진 할 수있다.
요컨대, 이러한 수정은 organoids에서 최소한의 변화로, 뇌 organoids의 재현 세대 수 있습니다. 중요한 것은,이 방법은 견고 중심체와 세포주기 역학에 영향을 미치는 유전자 변이를 가지고 환자 iPSCs에서 소두의 뇌 organoids를 생성하기 위해 적용되었다.
이 프로토콜의 두 번째 부분은 BR을 준비하는 지침을 제공합니다아인은 분석 및 소두증의 세포 결함의 해석 organoids. 이것은 고정, 저온 절편, 면역 형광 염색법, 및 공 촛점 현미경 분석을 포함한다. 이 프로토콜은 예상 된 결과에 대한 자세한 설명과 해석에 대한 안내와 함께 독자를 제공 할 것입니다.
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Protocol
뇌 Organoids의 1 세대 (이십삼일)
- neuroectoderm의 개시 (5 일)
주 : 다음 사항이 분화를 시작하기 전에 고려되어야한다. 인간 iPSCs를 얻기 위해 프로그래밍 방법 (lentiviral- 센다이 바이러스에 episomal-, 또는 마이크로 RNA 기반 등)을 이상적으로 모든 환자에게 동일 및 IPSC 라인을 제어한다. 다양한 프로그래밍 키트 및 출판 프로토콜에 따라 지침은 15, 16, 17, 18 사용할 수 있습니다. 인간의 IPSC 라인의 품질은 최적의 차별화를 달성하는 열쇠입니다. 현미경 콜로니 및 세포 형태를 모니터링하고 Oct3 / 4, Nanog를하거나, TRA-1-60으로 마커의 발현을 검사하여 분화능을 확인.- Engelbreth-홀름 - 떼 코팅 접시에 매체 A의 공급이없는 조건에서 배양 인간 iPSCs(EHS) 행렬.
참고 : 인간 iPSCs 성장 피더 무료 무 혈청 정의 된 문화 상태를 유지하는 것이 차별화의 시작하기 전에 마우스 배아 피더 세포 (MEFs에)의 제거를위한 추가 단계를 피하기 위해. 인간 iPSCs위한 최적 경로 번호는 전체에 통로 (70)에 프로그래밍에 통로 (15)로부터 분화 범위를 시작한다. 계대 때 새로운 접시 응집체를 전송할 낮은 기계적 응력 적합한 세포 분리 용액 및 2 ㎖의 혈청 피펫을 사용하여 셀로 골재 hiPSC 콜로니를 분리. 이것은 대부분의 IPSC 라인의 분화와 세포 사멸을 유도 수로, 단일 세포로 분리하지 마십시오. 그것은 장기 단일 세포 계대 인간 iPSCs 19, 20 게놈 변경을 증가시킬 수 있다고보고되었다. 이 iPSCs의 전체 생존 능력을 감소시키기 때문에, 박리 액을 제거하기 위해 원심 분리 단계를 필요로 세포 분리 과정을 피한다. 테스트미생물 오염, 정기적으로, 특히 마이코 플라스마, 모든 문화는이하여 iPSCs의 품질과 분화 능력을 변경할 수 있기 때문이다.- 코트 제조업체의 지침에 따라 EHS 매트릭스와 60mm 조직 배양 접시.
- 1 × 106의 인간 iPSCs 분취 량을 해동. EHS 매트릭스에 코팅 매체 A 5 ㎖를 (재료 표 참조)를 함유하는 60-mm 조직 배양 접시에 iPSCs 종자. 세포 ~ 80 % 포화 상태에 도달했을 때 5 ~ 7 일 후 일상 매체와 경로를 변경합니다.
참고 : 통로 분화를 시작하기 전에 적어도 한 번 같은 식민지 (21)의 효소가없는 분리와 같은 표준 방법을 사용하여 80 %의 포화 상태에서 해동 iPSCs를. 제조자의 다음 iPSCs를 영양 혼합물 F12 (DMEM / F12) 및 배양 : 요약하면, 상기 IPSC 매체를 제거 예열 37 ° C 둘 베코 변형 이글 배지로 한번 세척 세포시약 A를 이용하여 설명은 (재료 표 참조). 단일 세포 분리를 방지하기 위해 권장되는 배양 시간을 초과하지 마십시오. 인간 iPSCs은 분리 및 응집과 같은 단일 세포로하지 부동한다. 그들은 다음 새 EHS 매트릭스 코팅 요리로 전송할 수 있습니다; 예를 들어, IPSC 한 60-mm 요리는 4 개의 새로운 60 mm 요리에 배포 할 수에서 집계합니다. - 제조업체의 지침에 따라 마이코 플라즈마 검출 키트와 함께 마이코 플라스마를 확인합니다. 마이코 플라스마가 iPSCs의 분화 능력을 변경할 수 만 마이코 플라스마없는 iPSCs를 사용합니다.
- iPSCs (80 % 융합)를 해리 B. 시약을 사용하여 단일 세포 현탁액을 제조
- 예열 (37 ° C) DMEM / F12와 iPSCs 번 씻는다.
- 37 ° C에서 5 분, 5 % CO 2의 iPSCs를 (a 60mm 접시에 예를 들면, 1 mL)을 예열 시약 B를 첨가하고 배양한다.
- 측면과 하단에 손가락으로 톡 20 배요리는 iPSCs를 분리합니다. 현미경으로 세포의 분리를 확인합니다.
- 1 mL를 마이크로 피펫으로 접시에 상하 5 회 세포 현탁액 피펫.
- 시약 B 1 mL로 희석하고 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 수집 매체 A의 3 mL를 넣고.
- 천천히 실온에서 4 분 동안 iPSCs (500 XG)를 스핀 다운.
- B 매질 1 ㎖의 세포 펠렛을 재현 탁하고, 혈구 세포 수를 계산.
참고 : 부유에만 매체 B를 사용하여 알고 있어야합니다. 이 분화를 억제 할 수의 bFGF의 너무 높은 농도를 포함으로, 매체 A를 사용하지 마십시오.
- 10 μM (ρ) - 관련 키나제 억제제 (Y-27632)로 보충 된 배지 B의 용액 당 4.5 × 105 세포에 세포 현탁액을 희석.
- 비 부착, V 바닥 96 웰 플레이트에 잘 당 100 μL를 추가합니다.
참고 : 확인 세포를 동등하게 SUS에 분포되어100 μL 부분을 인출하기 전에 튜브 매번 진탕 연금. 각각의 웰은 크기 및 형상 (원형, 정의 된 표면)에 neurosphere를 균일를 얻기 위하여 동등한 세포 수를 포함하는 것이 중요하다. - 부드럽게 3 분 동안 500 XG하고 실온에서 세포를 플레이트의 회전 속도, 37 ° C, 5 % CO 2에서 배양한다.
- 50 μL를 제거하고 다음 5 일 동안 각 우물에 신선한 매체 B의 50 μL를 추가하여 매일 매체를 변경합니다.
- Engelbreth-홀름 - 떼 코팅 접시에 매체 A의 공급이없는 조건에서 배양 인간 iPSCs(EHS) 행렬.
EHS 매트릭스 2. 임베딩 neurosphere를 (4 일)
- / W (않고 100 (v / v)로 보충 2 : 200 (v / v)로 보충 1, 1 : 1 : DMEM / F12 매체 C (V / V) 1 1 혼합물은 다음을 혼합하여 neurosphere 매체를 준비 O) 비타민 A, 1 : 100 L 글루타민, 0.05 mM 비 필수 아미노산 (MEM), 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ㎖의 스트렙토 마이신, 1.6 g / L 인슐린, 0.05 밀리미터 β 머 캅토 에탄올.
- neurosphere를 재치를 수집HA ~ 2mm 팁을 사용하여 200 μL 마이크로 피펫 미리 멸균 가위로 잘랐다.
- 빈 100mm 접시에 약 5mm 떨어진 파라핀 필름 (3 × 3cm 2)에 서로 neurosphere를 놓고 조심 가능한 남은 배지만큼 제거한다.
- 각 단일 neurosphere 상 EHS 행렬의 드롭 (7 μL)을 추가한다.
- EHS 매트릭스 인큐베이터에서 15 분 동안 인큐베이션 neurosphere를 가진 방울.
- neurosphere 매체를 세척하여 파라핀 필름에서 조심스럽게 neurosphere를 씻으십시오. 플러시, 1 mL의 마이크로 피펫과 neurosphere 배지 10 ㎖를 함유하는 새로운 100mm 페트리 접시를 사용한다.
- 다음 4 일 동안 neurosphere를 품어 하루 2 신선한 neurosphere 매체의 2 mL를 넣어.
주 : EHS 매트릭스 내장 neurosphere를가 접시 한쪽에 함께 응집되지 않도록 인큐베이터에있는 선반이 평평한 지 확인합니다.
로타리 정지 3. Organoids문화 (14 일)
- 200 (v / v)로 보충 1, 1 : 100 (v / v)로 보충 2 / O w 1 : DMEM / F12 매체 C (V / V) 1 1 혼합물은 다음을 혼합하여 뇌 유사 장기 매체를 준비 비타민 A, 1 : 100 L 글루타민, 0.05 mM의 MEM, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ㎖의 스트렙토 마이신, 1.6 g / L 인슐린, 0.5 μM dorsomorphin 5 μM SB431542, 0.05 밀리미터 β 머 캅토 에탄올.
- 측면 아암을 각각 스피너 플라스크 뇌 유사 장기 배지 100 ㎖를 첨가하고, 적어도 20 분 동안 사전 - 온난화 인큐베이터에 배치.
- 제조업체의 지침에 따라, 25 rpm에서 교반 프로그램을 설정합니다.
참고 : 스피너 플라스크에 EHS 매트릭스 내장 neurosphere를 전송하기 전에, 그들은 모두 분리되어 있는지 확인합니다. 두 개 이상이 EHS 매트릭스를 통해 연결된 경우, 메스 접속 행렬 절단으로 분리. - 조심 유사 장기 배지 100 ㎖을 함유하는 스피너 플라스크에 EHS 행렬 매립 neurosphere를 전송할 우리2 ㎖의 혈청 피펫을 보내고. 플라스크에 neurosphere를 전송하는 스피너 플라스크의 측면 팔을 사용합니다.
- 37 ℃ 및 5 % CO 2 인큐베이터에서 자기 교반 플랫폼 스피너 플라스크로; 이것은 유사 장기 문화의 날 0입니다.
- (또는 더 자주 색상의 변화가있을 때) 매체의 절반을 제거하고 신선한 매체의 동일한 금액을 추가하여 일주일에 한 번 매체를 변경합니다.
참고 : 인큐베이터에서 스피너 플라스크를 복용하는 경우, organoids는 플라스크의 아래로 가라 앉을 수 있도록 3-5 분을 기다립니다. 액체의 표면 (펌프에 연결된) 유리 피펫 팁을 배치하여 매체를 제거; 신중 일측 개구부 / 플라스크 아암 통해 매체 대기음. 이러한 조작은 층류 후드에서 수행해야합니다.
뇌 Organoids 4. 분석
- organoids의 고정
- 스피너 플라스크 문화 위스콘신의 14 일에 organoids를 수집절단 한 ML 마이크로 피펫 (컷 ~ 5mm)를 토륨. 60 밀리 접시에 이들 모두를 넣고 3 분 동안 따뜻한 DMEM / F12 5 ㎖로 한번 씻어.
- 따뜻한 4 % 파라 포름 알데하이드 500 μL (PFA)와 함께 1.5 ㎖의 튜브를 준비한다.
주의 : PFA의 정착액을 처리 할 때 안전 후드 아래에 피부와 눈 보호 작업을 착용 할 것. - 각각 개별적으로 각각의 관을 실온에서 적어도 30 분 동안이를 해결 유사 장기 놓는다. 이상 60 분 동안 organoids를 수정하지 마십시오. organoids를 이동하려면 접종 루프 또는 편리 다른 궁리를 사용합니다.
- PFA를 제거하고 PBS 1 ml로 10 분마다 두 고정 organoids 씻는다.
- 추가로 사용할 때까지, 최대 7 일 동안 4 ℃에서 PBS 1 ㎖에 organoids 보관.
- 냉동 절편의 organoids를 포함하기
- PBS를 제거하고이를 cryofreezing 전에 organoids을 탈수 튜브 당 증류수 용액에 30 % 수크로오스 1 mL를 넣고; sucro를 추가 한 후SE 용액은 organoids 표면에 부유한다. 4 ℃에서 자당 용액에 하룻밤 보관 organoids; 다음날함으로써 organoids는 튜브의 아래쪽으로 침몰한다.
주 : 필요한 경우 Organoids는 자당 용액에 4 ℃에서 최대 3 ~ 5 일 동안 저장 될 수있다. - 최적 절단 온도 촬영기 화합물 400 μL와 비닐 시편 금형을 채우고 몰드의 중앙에 배치 유사 장기를 접종 루프를 사용한다. 샘플 이름 몰드 림 라벨.
- 냉동 절편까지 -80 ° C에서 유사 장기 함유 주형 동결.
- 코트 된 유리 실온에서 5 분 동안 PBS에서 0.1 % 폴리 -L- 라이신 용액 (PLL)와 cryoslides하게 슬라이드하고 3 시간 동안 건조. 4 ° C에서 슬라이드를 저장하고 사용하기 전에 실내 온대로 따뜻하게.
참고 : 멀리 떠에서 유사 장기 조각을 차단하므로 PLL - 코팅, 중요한 단계입니다. 수집 최대 3 4 ℃에서 보관 PLL 용액달. 재사용 전에, 0.22 μm의 주사기 필터로 실온까지 따뜻해하자. - PLL 코팅 유리 20 내지 50 ㎛의 두께로 슬라이스 단면의 cryofrozen organoids는 22 cryoslides. 섹션과 슬라이드는 실온에서 1 시간 동안 건조 시키십시오. 추가 처리 될 때까지 -80 ℃에서 보관 섹션.
- PBS를 제거하고이를 cryofreezing 전에 organoids을 탈수 튜브 당 증류수 용액에 30 % 수크로오스 1 mL를 넣고; sucro를 추가 한 후SE 용액은 organoids 표면에 부유한다. 4 ℃에서 자당 용액에 하룻밤 보관 organoids; 다음날함으로써 organoids는 튜브의 아래쪽으로 침몰한다.
유사 장기 섹션 5. 면역 형광 염색법
참고 : 네 스틴, 신경 전구 마커 및 TUJ1, 범 신경 세포 마커 염색 organoids의 일반적인 특성, 내용은 좋습니다. 추가 예, 정단 분열 반경 교세포 라벨 포스 멘틴 (p-빔) 및 Arl13b과 면역 염색법으로, 섬모를 들어 설명한다. 세포 사멸을 테스트하려면, 터미널 데 옥시 뉴 클레오 타이 딜 트랜스퍼 (TDT) 된 dUTP 닉 엔드 라벨 (TUNEL) 분석을 사용합니다. 먼지로부터 보호하기 위해 배양시 플라스틱 박스에 슬라이드를 놓고 빛및 건조.
- 실온에서 30 분간 슬라이드를 해동.
- PFA 유도자가 형광을 켄칭 3 분간 PBS 글리신 200 μL (PBS에서 글리신 0.225 g)로 두 번 슬라이드를 세척한다.
- 0.5 % 트리톤 X100 200 μL / 실온에서 10 분 동안 PBS 용액 중 0.1 % 트윈으로 섹션 Permeabilize 하시려면.
- 3 분 동안 PBS-글리신 액 200 μL로 두 번을 씻으십시오.
- 비특이적 항원 결합을 차단 실온 또는 밤새 4 ℃에서 1 시간 동안 PBS에서 0.5 % 어류 젤라틴 200 μL / 0.1 % 트리톤 (Triton) X100로 부화.
참고 : TUNEL 분석이 필요한 경우, 제조사의 프로토콜에 따라 분석을 수행합니다. 이 이차 항체를 방해하고 나중에 사용할 때 형광을 해소 하듯, 면역 염색을 수행하기 전에 TUNEL 분석을 시작합니다. - 네 스틴, 1 : 다음의 농도로 용액으로 차단 항체를 희석 (200); P-빔, 1 : 500; TUJ1, 1 : 200;Arl13b 1:20; 및 이차 항체, 1 : 1,000.
- 실온 또는 밤새 4 ℃에서 1-2 시간 동안 제 차 항체 200 μL (예를 들어, 네 스틴)로 인큐베이션.
- 차단 용액 200 μL로 3 × 3 분 동안 세척 하였다.
- 차단 용액 1,000 실온에서 1-2 시간 동안 200 μL의 슬라이드를 배양 : 제 (항 - 마우스 488) 1 차 항체를 희석. 이제부터 항상 빛으로부터 슬라이드를 보호합니다.
- 차단 용액 200 μL로 3 × 3 분 동안 세척 하였다.
- 실온에서 1-2 시간 또는 밤새 39 ° C에 대해 (예 TUJ1) 다음에 일차 항체 200 μL와 인큐베이션.
- 차단 용액 200 μL로 3 × 3 분 동안 세척 하였다.
- 실온에서 1-2 시간 동안 다음 이차 항체 (항 - 토끼 647) 200 μL를 추가합니다.
- 3 × 3 분 동안 세척 하였다. 차단 용액 200 μL와.
- 30nm의 진한 4에 200 μL ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)을 추가핵 염색을 실온에서 15 분 동안 PBS에서 entration.
- 차단 용액 200 μL 2 × 3 분 동안 세척 하였다.
- 증류수 200 μL로 1 × 1 분 동안 세척하고 명백한 물방울이 더 이상 보이지 않을 때까지 섹션, 10-20 분 동안 건조하자.
- 매체를 내장으로 섹션을 탑재합니다. 그 몇 주까지 4 ° C에서 빛으로부터 보호 저장합니다.
- 이미지에 대한 현미경 분석 유사 장기 심실 영역 프리미티브 피질골 플레이트, 및 다른 관심 영역에 대한 개요를 진행.
- 1, 10을 사용하는 형광 색소 표지 된 이차 항체에 따라 선택된 오일 63X 대물 형광 필터와 공 촛점 현미경을 사용한다.
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Representative Results
뇌 organoids의 생성은 연속 배양 (그림 1A)의 적어도 세 주이 필요합니다. 재현 가능한 결과를 달성하기 위해, 우리는 연구자가 모든 단계를 문서화하고, 중요한 매체 구성 요소, 시점, 세포 처리에 관한 변경을 방지하는 것이 좋습니다. 여기서 우리는 중요한 이정표가 실험의 끝에서 충분한 품질의 organoids를 얻기 위해 도달하는 경우 평가하는 방법에 대한 요약을 제공합니다. 96- 웰 플레이트에서 neurosphere를 형성은 제 neurosphere를는 각 웰의 바닥 (도 1b, 단계 1)에서와 같은 잘 정의 된 분야를 인식 할 수있는 일로부터 명확히 볼 수 있어야한다.
5 일째, neurosphere를는 ~ 500 μm의 직경이어야 어두운 중심을 둘러싸는 밝은 테두리와, 평활 한 표면을 나타낸다. 이미 신경 장미 같은 확장 STRU을 관찰 할 수있을이 밝은 테두리 내의 ctures는 (도 1C는, 단계 (2)의 시작). neurosphere를 더 세포 집합체처럼 붕괴 또는 표시하는 경우, 차별화는 더 계속되어서는 안된다. 마지막 organoids 증가 및 스피너 플라스크 (도 1D, 단계 3)에서의 분화 과정에서 동일한 크기를 나타낼 것이다. 자세한 내용은 문제 해결 표 (표 1)를 참조하십시오.
하루 14 organoids의 품질은 광학 현미경으로 확인해야합니다. VZs는 선단 측의 방어벽 핵 형상 네 스틴 양성의 NPC / 반경 교세포의 두꺼운 층으로 구성된다. 한편, 프리미티브 피질골 플레이트는 선단 측 (도 1E)로부터 공간적으로 구별되는 기부 측 풍부한 TUJ1 양성 뉴런을 포함한다. 중요한 TUJ1 양성 뉴런의 VZ의 선단 측에서 볼 수없는 것이다.
(도 1F 및 G) (23, 24)의 초기 대칭 확장 필수적이다. ARG 충분한 확장에 도달하면, 신경은 시작 분할 세포 내강 향해 방향을 변경하고, 분할면이 수직 (비대칭) 4, 12, 24로 수평 (대칭)로부터 전환한다.
그림 1 : 인간 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 Organoids의 세대. 분화 프로토콜의 (A) 워크 플로우. 1 단계 : 차별화의 시작. 이 단계 동안, 96- 웰 플레이트에서 인간 iPSCs neurosphere를 형성이 일어난다. 지속 시간 5 일입니다. 2 단계 : EHS 매트릭스 방울 neurosphere를 임베드. EHS 행렬 neurosphere를 내장 한 고정식 현탁 배양 4 일의 지속 시간을 갖는다. 3 단계 : 스피너 플라스크에 Organoids. 스피너 플라스크하는 EHS 행렬 neurosphere를 매립하는 전송 일어난다. 시간의 기간은 14 일입니다. (B) 다중 - 웰 플레이트에 neurosphere. 1 단계 동안 96 웰 플레이트에서 4 일에 neurosphere의 대표 화상이 도시되어있다. 구는 부드럽고 둥근 표면 (빨간색 arro으로, 잘 하단에 명확하게 볼 수 있어야합니다w). neurosphere를 중 (C) 형태학 종래 EHS 매트릭스에 매립. 단계 1 5 일째에 수집 neurosphere를 크기가 균일하고 밝은 테두리 (브래킷 화살표)와 매끄러운 표면을 표시한다. (D) Organoids 스피너 플라스크있다. 단계 동안 뇌 organoids 3 (적색 화살표)를 스피너 플라스크 여기에 도시되어있다. 전형적인 VZ 원시적 피질골 플레이트를 저온 절단 표시 organoids의 (E) 면역 형광 촬상. 왼쪽 패널은 VZ에서 세포의 핵 염색을 보여줍니다. VZ는 기부 측 (황색 선)에 선단 측 (루멘 L)으로부터 걸쳐있다. VZ 표시 방어벽 같은 핵 내의 세포들은 방사형 교세포 것을 제시합니다. 오른쪽 패널은 VZ 및 프리미티브 피질골 플레이트 TUJ1 양성 뉴런 (마젠타) 내의 네 스틴 양성의 NPC (녹색)의 면역 형광 염색을 보여준다. 스케일 바는 50 μm의 =. 저온 절단 organoids의 (F) 면역 형광 촬상. 두 가지 예P-빔과 Arl13b 물들 VZs의 (I 및 III). 흰 사각형으로 표시된 영역은 각 이미지에 대한 삽입 오른쪽 확대 (II 및 IV)한다. anaphase (핵분열 말기) 꼭대기 반경 교세포 (인수)의 분할면. VZ의 선단 측에 정점 반경 교세포 분할은 P-빔 양성 (마젠타)이다. 대칭 분할 인수의 예로는 (흰색 사각형 및 세트)를 나타낸다. 분할면은 백색 라인으로 설명한다. anaphase (핵분열 말기) 셀의 분할면은 루멘면 라인 (황색 점선)에 수평이며 Arl13b 염색 (녹색)로 표시된다. 스케일 바는 50 μm의 =. (G)이 개략도는 루멘 anaphase (핵분열 말기)에 대하여 인수의 세로 또는 가로 방향을 제공한다. 14 일째 제어 organoids의 분할 셀은 주로 수평 VZ의 내강면 (0-30 °) 상대적으로 배향된다. 내강의 선단 측이 VZ (녹색 라인)의 내강면을 지정하는 인수의 일차 섬모, 줄 지어있다. 대조적으로, MOS에서소두증 organoids의 반경 교세포의 t는 수직 배향 (60-90 °) 분할면을 표시. 백색 라인은 분할면의 축을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 문제: | 가능한 원인 : | 제안 : |
| 단계 1.1.1.2 | 프로그래밍의 가난한 효율성 | 만능 마커에 대한 hiPSCs을 확인하십시오 품질이 낮은 경우 몇 구절은 만능의 식민지를 풍부하게하기 위해 수동으로 미분화 식민지를 선택 |
| 인간 iPSCs 차별화의 시작하기 전에 차별화 | ||
| 초기 계대 또는 passagi로 인한 스트레스NG로 하나의 세포 | 수행 80 % 자랄 전에 통과에 도달하지. 항로 집계, 단일하지 세포와 같은 | |
| 마이코 플라스마 오염 | 마이코 플라스마 오염에 대한 테스트 | |
| 2 단계 | hiPSCs의 품질 불량 | hiPSCs의 품질 향상 (위 참조) |
| neurosphere를 전혀 형성 또는 분화 시작 후 5 일째에 붕괴하지 않는다 | 물론 당 세포의 시작 번호가 너무 낮거나 너무 높으면 | 정확하게 세포의 수를 계산하고 각 웰에 똑같이 배포 |
| hiPSC 매체 대신 신경 분화 배지 사용한 | 신경 분화 매체를 사용하여 | |
| 원심 분리 단계가 너무 거칠거나 가벼운에 있었다 | 스핀 96- 웰 플레이트 (500) XG 3 분 동안 세포가 중앙에 축적되는지 확인각의 바닥 아니라 | |
| 차별화의 시작에 어떤 Y-27632 없습니다 | 세포의 생존을 향상시키기 위해 Y-27632를 사용하여 | |
| 세포 부착 판의 하부로 성장 | 비 부착 96 웰 V 바닥 플레이트를 사용하고 있는지 확인하십시오. | |
| 2 단계 | 아니 매일 매체 변화 없다 | 매체 하루의 절반 금액 변경 |
| neurosphere를 크기가 균일하지 않습니다 | 물론이 동일하지 않았다 당 세포의 수를 시작 | 마다 100 μL 세포 현탁액을 촬영하기 전에 단일 세포 현탁액과 혼합 관 |
| 중간 변경 사항은 각 웰 일상에 대해 수행되지 않았습니다 | 확인 모든 아니라 매일 매체 변화를 가져옵니다 | |
| 2 단계 | hiPSC는 INT 해리되지 않았다차별화의 시작하기 전에 O를 단일 세포 | hiPSC가 accutase 처리 한 후 하나의 셀을 분해하는 경우 현미경으로 확인합니다. 여전히 100 μL 마이크로 피펫과 함께 아래로 피펫 세포를 10 회가 집계하는 경우 다시 확인하거나 치료 accutase 반복 |
| neurosphere를 밝은 테두리 또는 원형 표면을 표시하지 않는다; 그들은 표면에서 큰 낭종을 형성 | 물론이 너무 높았다 당 세포의 수를 시작 | 정확하게 세포의 수를 계산하고 각 웰에 똑같이 배포 |
| 중간 변화는 각 웰 매일 수행되지 않았습니다 | 절반 매체 매일 변경 | |
| 단계 2.7 | hiPSCs의 품질 불량 | hiPSCs의 품질 향상 (위 참조) |
| EHS 매트릭스 임베디드 neurosphere를 스틱과 함께 덩어리 | 충분하지 않은 매체 (볼륨) | 제공100mm의 페트리 디쉬에 10 ㎖ 배지 최소 |
| 인큐베이터의 선반조차 | 더 표면에 접시를 놓고 | |
| neurosphere를 고르게 분산되도록 인큐베이터에 배치 한 후, 접시를 이동 |
표 1 : 문제 해결 표.
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Discussion
MCPH는 생체 내에서 또는 단순 인간의 세포 배양 시험관에 접근에서 동물 모델에서 효과적으로 요약 할 수없는 복잡한 인간의 신경 발달 장애이다. MCPH의 임상 양상은 초기 신경이 시작될 때 첫 번째 임신 동안 표시하기 시작합니다. 따라서, 3D 뇌 organoids는 MCPH 개발을 모델링하는 신뢰할 수있는 실험 시스템을 나타냅니다. 또한, 3D 인간 뇌 organoids는 중요한, ⅲ) 다양한 분화 I)들은 다양한 유전 적 배경을 가진 환자의 샘플들의 스펙트럼의 적응을 허용는 1, 2)가 다른 신경 세포 유형을 포함하는 편성 조직을 표시 때문에 이상적인 방법이며 이 체외 방법에서 신경 발달의 단계는 생체 대응 25, 26, 27에 연결되어 있습니다. 예를 들어, 신경 장미는 현상 신경에 등가 구조는튜브.
랭커스터는 등. 환자 organoids 생성에 성공하기 위해서는 iPSCs 대조군에 비해 환자 iPSCs 수의 두 배를 사용했다. 참고로, 기존의 방법을 수정하여 여기에 설명 된 프로토콜로, 우리는 제어와 같은 세포 수를 4부터 소두증 뇌 organoids를 생성 할 수 있습니다. 이는 iPSCs의 정의 배양 조건으로 인해 더욱 지향 분화 할 수 있었다. 이 프로토콜에서, 유사 장기 생성 iPSCs에서 직접 신경 분화를 개시함으로써 일반적으로 수행 EB 형성 공정을 대체함으로써 개선되었다. 둘째, 3 단계 dorsomorphin 및 SB431542에 배지 대신 단독 레티노 산에 첨가 하였다. 세포 배양 배지 (28)에 적용될 때 레티노 산 용이 이성화된다. 따라서, 그 생물학적 활성은 dorsomorphin 같은보다 안정적인 화합물보다 덜 정의되어있다. Dorsomorphin의 억제BMP4 신호 경로, 그리고 SB431542가 티빈 / 절점 신호 전달 경로의 억제제 (TGF-β1 ALK 억제제). 두 화합물의 조합, BMP의 억제 및 티빈 / 절점 신호 경로에 이르게 신경 분화를 유도하고, 유사한 효율 29 인간 ES 인간 만능 줄기 세포로부터 다양한 세포주 다른 계통으로의 분화를 감소시킨다. 화합물의 안정성 및 합성 보편적 세포 반응은 시험관 내에서 질병을 모델링 다른 환자 세포주에 적용 할 수있는 프로토콜을 설정하기위한 중요한 포인트이다. 따라서, 균일 한 뇌의 강력하고 효율적인 분화의 결과는 재현성 데이터, 결국 문화를 유사 장기합니다.
이러한 변형으로, 프로토콜 내에서 중요한 단계는이 시점에서 1 단계에서 분화의 개시를 최소화 그것을 부드럽게 단일 세포 현탁액 A를 내로 iPSCs를 해리하는 것이 중요ND 96 웰 플레이트의 각 웰에 정확하게 균등하게 분배한다. 그것은 하나의 세포에 해리 그들의 iPSCs의 생존을 지원하는 RHO 관련 키나제 억제제는 (Y-27632)은, 제 24 시간 동안 매체 B에 첨가되어야한다. 이 우물의 바닥을 아래로 회전시켜 밀착 세포를 가지고하는 것이 중요하다. neurosphere를 단계 (1)의 단부에 형성되면, 상기 실험 절차의 성공적인 완료를 기대할 수있다. 이 경우 neurosphere를 인간 iPSCs의 분화능을 형성하지 않는, 96 웰 플레이트에있는 세포, 및 원심 분리 조건의 비 부착이 확인되어야한다. 1 단계의 일 0에 모든 절차로 인해 인간의 iPSCs의 감도 더 이상 1 시간 이상 소요됩니다. 다음 일 동안 중간 변경은 세포 사이의 갓 형성 세포 연락처를 파괴하지 않기 위해, 전단력을 피하고, 신중하게 수행해야합니다.
그것은 그 centrosom 주목할 필요가있다알 돌연변이에 결함이있는 세포 증식 및 변경 세포주기 역학 있습니다. 따라서, MCPH를 모델링하는 것은 손상된 세포 기능을 견딜 수있는 강력한 프로토콜을 필요로한다. 따라서, 현재의 프로토콜은 높은 품질의 균일 organoids의 생성을 허용하고, VZ에서 줄기 세포의 항상성을 연구하는 독특한 도구 역할을합니다. 다른 프로토콜과 대조적으로,이 프로토콜은 동일한 셀 번호로 시작하는 제어 환자에서 iPSCs organoids의 생성을 가능하게한다. 체외 분화를 기반으로 연구를 들면, 다른 iPSCs에 대해 동일한 배양 조건은 질병 관련 변경을 파악하고 문화 조건 아티팩트를 피하기 위해 기본적인 요구 사항이다. 유전 적 기원 소두증을 모델링 외에도,이 프로토콜은 신경 바이러스 감염, 화학 물질, 또는 방사선에서 포함되지 않은 유전 적 기원 소두증에 적용 할 수 있습니다. 또한 30 일 같은 CRISPR 현대 분자 생물학 도구 / Cas9는 게놈 편집기술을 보내고, 체외 31, 32, 33에 인간의 두뇌 개발 패러다임의 특정 측면을 해부 3 차원 organoids에 적용 할 수 있습니다.
반면에, 지금까지 뇌 organoids의 생성은 여전히 인간 발달 (34)의 제 초기 임신 중기 넘어 갔다 않았습니다. 이 제한을 능가하고 파킨슨이나 알츠하이머 병 등의 나중 단계에서 명시 신경 퇴행성 질환을 모델링하는 새로운 길을 열 것 체외에서 성숙 뇌 organoids의 생성을 가능하게한다. 미래의 애플리케이션의 경우, 프로토콜은 전뇌 또는 중뇌와 같은보다 구체적인 지역에 차별화를 지시, 자폐증과 정신 분열증 35, 36, 37와 같은 복잡한 신경 질환을 연구하는 관심이있을 수 있습니다, 38까지.
유사 장기 연구에서 결론을 그릴 때 중요한 특정 측면이 고려되어야한다. 첫 번째 제한은 organoids의 명백한 혈관이 없다는 것입니다. 즉, 시험관 내에서 가스 교환 및 영양 공급은 생체 내 조건을 근사. 뇌 organoids 복잡한 기관 시스템에 연결되어 있지 않기 때문에 두 번째는 유사 장기 모델은 완전한 면역, 대사 및 호르몬 시스템이 부족하다. 그럼에도 불구하고, 이러한 측면의 부재는 때때로 이점을 제공한다. 뇌 질환의 발병 기전에 면역 체계의 영향을 주소 예를 들어, 여기에 설명 된 organoids은 생체 내 모델에서 면역 억제 대체 할 수 있습니다.
스피너 플라스크를 사용하여, organoids 많은 수의 생화학 실험, 전 사체 염기 서열 분석 및 높은 처리량 약물 검사에 대해 생성 할 수 있습니다. U에 의해, 함께이 현재의 프로토콜을 노래, 하나는 확실하게 앞으로 동물 실험을 대체하기 위해 다음 약물 테스트 플랫폼으로 질병 모델링에서, 다양한 응용 분야에 활용 될 수있는 인간 iPSCs 세포에서 뇌 organoids를 생성 할 수 있습니다.
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Acknowledgments
이 작품은 프리츠 티센 재단 (Az.10.14.2.152)에 의해 지원되었다. 우리는 조직 삽입 시설 및 CMMC의 현미경의 핵심 시설에 감사하고 있습니다. 우리는 중심체와 세포 뼈대 생물학 연구소의 회원들에 의해 제공되는 토론 및 기술 지원에 대한 감사합니다. 우리는 원고를 교정하기위한 이명 Gooi 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
| Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
| CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
| Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
| Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
| Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
| Inoculation loop with needle, disposable (1 µL) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
| Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
| L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
| Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
| Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
| Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
| Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
| PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
| Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
| pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
| Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
| Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
| Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
| Spinner flask 250 mL | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
| Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
| Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
| TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
| Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
| waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
| β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |
References
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