心脏类导线平台是一种 体外 通过结合三维细胞培养与电刺激，用于促进人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CM）成熟的实验方法。本文详细介绍了心脏类器官导线平台的构建步骤。
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本文内容
摘要
摘要
由人多能干细胞衍生的心肌细胞（hPSC-CMs）是一种极具前景的细胞来源，已推动其在心脏研究领域潜在应用的广泛探索，包括药物发现、疾病建模、组织工程和再生医学。然而，现有方案所产生的细胞与天然的成年心室心肌细胞相比，表现出不同程度的不成熟状态。尽管已开展大量促进hPSC-CMs成熟化的研究，但迄今为止所实现的成熟程度仍较为有限。因此，研究人员开发了一种名为“生物导线”（biowire）的工程化系统，通过提供物理和电学双重刺激，以促进hPSC-CMs在体外向更成熟的状态发展。该系统利用微加工平台，将hPSC-CMs接种于I型胶原凝胶中，并沿刚性缝合模板排列，从而组装成取向一致的心肌组织（即生物导线），随后对其进行频率逐步递增的电场刺激。与未受刺激的对照组相比，接受电刺激的生物导线心肌细胞在结构和电生理特性方面均表现出更显著的成熟化特征，且此类变化依赖于刺激频率。本文详细描述了生物导线系统的设计与构建过程。
引言
基于细胞的治疗是实现心脏修复/再生最有前景且研究最广泛的战略之一。该策略得到了心脏组织工程以及生物材料共递送技术的支持1,2。目前大多数可用的细胞来源已在动物模型中被研究，以评估其对受损、患病或衰老心脏可能产生的有益作用3。特别是，研究人员已投入大量努力，致力于将人多能干细胞（hPSC）来源的心肌细胞（hPSC-CM）应用于心脏组织工程，因其是一种潜在的无限自体细胞来源。hPSC-CM可通过多种已建立的方案进行制备4,5,6。然而，所获得的细胞表现出类似胎儿的表型，与成人心室心肌细胞相比具有一系列未成熟的特征7,8。这可能阻碍hPSC-CM在药物发现研究中作为成人心脏组织模型，以及在成人心脏疾病模型构建中的应用9。
为了克服心肌细胞表型不成熟这一局限性，研究人员已积极探究多种新方法以促进心肌细胞的成熟。早期研究表明，周期性机械10....
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方案
1. 主控设计与制备
注意：使用软光刻技术进行器件制备。制作双层 SU-8 模具用于聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制成型。
- 使用设计与制图软件设计该装置（图1A，左侧）。分别绘制母版的每一层。以20,000 dpi将器件设计分别打印到两张光刻掩模上，对应母版的两层。15将器件图案设置为透明，周围区域设置为暗色；这些掩模将作为模板，通过光刻技术将器件图案光学转移至SU-8上（方法如他人所述）15).
- 在4英寸硅片中心滴加约4 mL SU-8 50。使用匀胶机以2,000转/分钟（RPM）匀速旋转30秒，使SU-8 50在硅片表面均匀涂覆。将硅片置于95 °C热板上烘烤10分钟。用200 mJ/cm²的紫外（UV）光照射硅片2.
- 在晶圆中心倒入约 4 mL SU-8 2050，以 2,500 RPM 旋涂 30 秒。在 95 °C 热板上烘烤 15 分钟。冷却至室温（RT）。
- 重复步骤1.3两次。
- 将涂覆好的晶圆覆盖第一层透明光刻掩模，用270 mJ/cm²的紫外光照射晶圆2 制作第一层。在95 °C的加热板上烘烤15分钟。
- 通过重复步骤1.3两次，制备第二层SU-8 2050。 ....
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结果
在生物导线中使用缝合线的原理是作为三维结构形成的模板，使细胞沿单一轴向排列，并模拟心肌纤维的形态。我们发现，在生物导线中培养7天后，细胞重塑了缝合线周围的凝胶（图3A）。细胞沿缝合线轴向组装，形成有序排列的心肌组织（图3）。经过7天的预培养后，生物导线接受了为期7天的电场刺激，进一步表现出与心肌细胞结构和功能成熟相一致的特性。
在生物导线中培养的人多能干细胞来源的心肌细胞（PSC-CMs）表现出心脏收缩蛋白、肌节α-肌动蛋白和肌动蛋白的强烈表达（图4A）。我们观察到人PSC-CMs收缩装置呈现肌节条带结构，并且肌原纤维结构沿缝合线轴向排列，这种结构定性上类似于成人心脏组织（图4A）。其次，与拟胚体（EBs）来源的细胞相比，这些生物导线培养的hESC-CMs增殖率较低（图4B）。第三，生.......
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讨论
本文描述了工程化平台“生物导线”（biowire）的构建与实施方法，旨在促进人多能干细胞来源心肌细胞（hPSC-CMs）的成熟。该装置可在标准微加工设施中制备，生物导线的制备可结合常规细胞培养技术与电刺激仪完成。
据我们所知，目前尚无与生物导线（biowires）类似的方法被报道。该策略表明，心肌细胞成熟度的提升依赖于电刺激方案，这一点在采用较高刺激频率递增方案（6 Hz 对比 3 Hz）的生物导线中观察到更高的成熟水平得到了证实。与培养20天（EBd20）或40至44天（EBd44）的拟胚体（EBs）相比，生物导线中的心肌细胞表现出更低的自律性以及更高的hERG电流和IK1。EBd20心肌细胞代表了细胞在整合入生物导线前的特性，而EBd44心肌细胞的培养时间比生物导线培养时间长10天，这表明即使以拟胚体形式延长培养时间，心肌细胞也无法达到生物导线中通过电刺激所诱导的成熟程度。然而，通过生物导线获得的心肌细胞仍不及成年心肌细胞成熟。
有研究表明，机械刺激可有效诱导人多能干细胞来源的心肌细.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究得到了加拿大心脏与中风基金会资助（G-14-0006265）、加拿大卫生研究院运营基金（137352 和 143066）以及 J.P. Bickell 基金会资助（1013821）的支持，资助对象为 SSN。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| L-抗坏血酸 | Sigma | A-4544 | hPSC-CM 培养基成分 |
| AutoCAD | Autodesk, Inc | 设计设备的软件 | |
| 碳棒， Ø 3 mm | 电刺激器腔室组件 | ||
| I型胶原，大鼠尾部 | BD 生物科学 | 354249 | 胶原凝胶：2.1 mg/mL 大鼠尾部I型胶原，溶于24.9 mM葡萄糖、23.8 mM NaHCO₃314.3 mM NaOH，10 mM HEPES，溶于含10%生长因子减少型Matrigel的1x M199培养基中。 |
| I型胶原酶 | Sigma | C0130 | PBS（含Ca）中含0.2% I型胶原酶（w/v）和20%胎牛血清（v/v）2+ 和 Mg2+. 使用 0.22 微米滤器除菌 μm 滤膜过滤并分装为 12 mL 等份。于 -20 ℃ 保存 °C. |
| 脱氧核糖核酸酶 I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | 配制1 mg/mL DNase I储存液于水中。过滤除菌后，分装为0.5 mL每份，于－20°C保存 −20 °C |
| 钻孔 &和钻头（Ø 1 mm 和 2 mm | Dremel | 在聚碳酸酯框架上钻孔 | |
| 电刺激器 | 草 | s88x | |
| 胎牛血清（FBS） | WISENT 公司 | 080-450 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma | G5767 | 胶原凝胶组分 |
| L-谷氨酰胺 | 赛默飞世尔科技 | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ·cm 在 25 °C，超纯，用于配制所有溶液 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | 胶原凝胶组分 |
| 加热板 | 托里松树 | HS40 | |
| Iscove改良的Dulbecco培养基（IMDM） | 赛默飞世尔科技 | 12440053 | |
| 掩模对准器 | EVG | EVG 620 | |
| 基质胶，生长因子减量型 | 康宁 | 354230 | 胶原凝胶组分 |
| Medium 199 (M199) | 赛默飞世尔科技 | 11825015 | 胶原凝胶组分 |
| 单硫代甘油（MTG） | Sigma | M-6145 | hPSC-CM 培养基成分 |
| 轨道摇床 | VWR | 89032-088 | |
| 青霉素/链霉素（P/S） | 赛默飞世尔科技 | 15070063 | |
| 含钙磷酸盐缓冲液（PBS）2+ 和 Mg2+ | 赛默飞世尔科技 | 14040133 | |
| 6孔板 | 康宁 | 353046 | |
| 6 孔板，低吸附 | 康宁 | 3471 | |
| 铂丝，0.2 mm | 电刺激器腔室组件 | ||
| 聚二甲基硅氧烷（PDMS） | 道康宁 | Sylgard 184 | |
| 丙二醇单甲醚醋酸酯（PGMEA） | Doe & Ingalls 公司 | 开发晶圆 | |
| 袋装，可剥离开启 | 转换器 | 92308 | 用于蒸汽灭菌 |
| 硅晶圆，4 英寸 | UniversityWafer 公司 | ||
| 碳酸氢钠（NaHCO₃）3) | Sigma | S5761 | 胶原凝胶组分 |
| 氢氧化钠 | Sigma | S8045 | 胶原凝胶组分 |
| 旋涂仪 | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| StemPro-34 培养基 | 赛默飞世尔科技 | 10639011 | hPSC-CM 培养基。配制 50 mL 时，加入 1.3 mL 添加剂、500 μ100 L× L-谷氨酰胺，250 μ30 mg/mL 转铁蛋白的 L，500 μ5 mg/mL 抗坏血酸溶液，150 μL μ26 升 μl/2 mL 巯基甘油（MTG），以及 500 μL (1%) 青霉素/链霉素 |
| 停止培养基 | 洗涤液：FBS（1:1） | ||
| SU-8 50 | MicroChem 公司 | 光刻胶，母版组件 | |
| SU-8 2050 | MicroChem 公司 | 光刻胶，母版组件 | |
| 转铁蛋白 | 罗氏 | 10-652-202 | hPSC-CM 培养基成分 |
| 0.25% 胰蛋白酶/EDTA | 赛默飞世尔科技 | 25200056 | hPSC-CM 培养基成分 |
| 洗涤液 | 含1%青霉素/链霉素的IMDM |
参考文献
- Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005(2015).
- Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and t....
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