Uma vez removido do corpo, tecido neuronal é muito afectado pelas condições ambientais, conduz a uma eventual degradação do tecido após 6-8 h. Usando um método de incubação único, que acompanha de perto e regula o ambiente extracelular do tecido, a viabilidade do tecido pode ser significativamente prolongada por> 24 h.
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Artigo de método
A incubação prolongada de aguda Neuronal Tissue de Eletrofisiologia e cálcio-imaging
Neste artigo
Resumo
Resumo
Aguda preparações de tecidos neuronais, fatias de cérebro e da retina wholemount, normalmente só pode ser mantida durante 6-8 h após a dissecação. Isto limita o tempo experimental, e aumenta o número de animais que são utilizados por cada estudo. Esta limitação especificamente impactos protocolos como imagem de cálcio que exigem prolongada pré-incubação com corantes aplicados-banho. exponencial do crescimento bacteriano dentro de 3 - 4 h após o corte é fortemente correlacionada com uma diminuição na saúde dos tecidos. Este estudo descreve um método para limitar a proliferação de bactérias em preparações agudas, para manter o tecido neuronal viável durante períodos de tempo prolongados (> 24 h) sem a necessidade de antibióticos, procedimentos de esterilização, ou meios de cultura de tecidos contendo factores de crescimento. E ligando o fluido extracelular por meio de irradiação UV e manter o tecido numa câmara de retenção costume em 15-16 ° C, o tecido não mostra nenhuma diferença de propriedades electrofisiológicas, ou Si cálciognaling através corantes de cálcio intracelular em> 24 h postdissection. Estes métodos não só irá aumentar o tempo experimental para aqueles que utilizam tecido neuronal aguda, mas irá reduzir o número de animais necessários para completar objectivos experimentais, e irá definir um padrão de ouro para a incubação do tecido neuronal aguda.
Introdução
Eletrofisiologia e imagens funcionais (cálcio, tensão corantes sensíveis) são duas das técnicas experimentais mais comumente usados em neurociência. preparações fatia do cérebro e da retina wholemount, que será analisada aqui, fornecer um meio de examinar propriedades eletrofisiológicas e conectividade sináptica sem contaminação de anestésicos e relaxantes musculares. Fatias de cérebro e da retina Wholemount manter a sua integridade estrutural, ao contrário de culturas ou homogeneizados celulares, permitindo o estudo de circuitos específicos e redes cerebrais 1. Gravações de tecido isolado têm vantagens sobre em gravações vivo
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Protocolo
O protocolo que se segue descreve a preparação de ratinhos C57BL / 6 e C3H / He (retinally degenerar) tecido neuronal de rato, mas técnicas semelhantes podem ser aplicados a outras espécies. Todos os animais eram saudáveis e manipulados com as condições padrão de temperatura, humidade, 12 h ciclo claro / escuro, livre acesso a comida e água, e sem quaisquer estímulos de estresse pretendidos. Todos os experimentos foram aprovados e realizados de acordo com o comitê Animal Care Universidade Western Sydney e Ética e de acordo com o uso de animais e orientações de cuidados (Animal Research Autoridade # A9452, # A10396 e # A8967).
1. Cérebro Slice Preparação
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Resultados
regulação apertada da carga bacteriana e a temperatura do aCSF durante a incubação é essencial para manter a viabilidade do tecido neuronal. Isto pode ser optimizado por meio de irradiação com luz UVC e mantendo a temperatura do aCSF a 15-16 ° C (Figura 1). Além disso, o aCSF os parâmetros de selo (APS; Figura 1C) fornece o experimentador com um registro das condições ambientais (pH e temperatura.), Oferecendo assim um padrão de ouro para os parâmetros q.......
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Discussão
Este artigo descreve um método de incubação para estender a viabilidade do tecido neuronal aguda para geração de imagens e eletrofisiológicos experimentos, reduzindo assim o número de animais necessários para completar objetivos experimentais. Dois processos principais governam a deterioração do tecido neuronal ao longo do tempo: i) aumento dos níveis de bactérias, eo aumento de acompanhamento endotoxina bacteriana lançado, e ii) excitotoxicidade que segue o procedimento de corte traumática 10. C.......
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Divulgações
Yossi Buskila e Paul Breen declaram que são co-proprietários da PAYO Scientific Pty Ltd, uma empresa especializada na construção de sistemas de incubação para tecido neural agudo. Todos os outros autores não relatam interesses financeiros ou potenciais conflitos de interesse relacionados ao presente estudo.
Agradecimentos
Agradecemos a Colin Symons e James Wright pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de financiamento inicial (WSU) para Y.B. e o escritório de inovação da Western Sydney University. MC é apoiado pela bolsa ARC (DECRA).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cloreto de Sódio | Sigma Aldrich VETEC | V800372 | |
| Cloreto de potássio | Sigma Aldrich | P9333 | |
| N-Metil-D-glucamina | Sigma Aldrich | M2004 | |
| D-glicose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Bicarbonato de sódio | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Fosfato de sódio monobásico | Sigma Aldrich | S2554 | |
| Cloreto de magnésio | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Cloreto de cálcio | Sigma Aldrich | 223506 | |
| Papaína | Worthington | ||
| Dimetilsulfóxido anidro | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Pluronic F-127 Baixa absorção de UV* | Life technologies | P-6867 | Solução a 20% em DMSO |
| Fura-2 AM | Anaspec | 84017 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F23917 | |
| Fluo-8 AM | Abcam | Ab142773 | |
| Micrótomo de lâmina vibratória | Leica Biosystem | VT1200 S | equipado com Leica' s Vibrocheck™ dispositivo de medição |
| Mesa antivibração | Kinetic Systems Vibraplane | Vibraplane 9100/9200 | |
| Microscópio Vertical de Platina Fixa | Olympus | BX51WI | |
| Objetiva de Microscópio | Olympus | XLUMPlanFLN 20x/1.00w | 20X |
| Objetiva de Microscópio | Olympus | LUMPlanFLN 60x/1.00w | 60X |
| Câmera CCD | Andor | Ixon + | |
| Comutador de comprimento de onda de alta velocidade | Instrumento | Sutter Lambda DG-4 | |
| Amplificador de patch clamp | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Sistema de aquisição de dados | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® Sistema |
| Capilares de vidro borossilicato | Sutter Instrument Co | BF150-86-10 | |
| Extrator de microeletrodos | Sutter Instrument Co | P-97 | Extrator de micropipeta tipo flamejante/marrom |
| Câmara de gravação/perfusão | Warner Instruments | RC-40LP | Câmaras de banho abertas de baixo perfil |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Software de imagem de células vivas Andor iQ | Andor Andor | iQ3 | |
| Braincubator | Payo Scientific | BR26021976 | www.braincubator.com.au |
| Peltier-Termoelétrico Resfriador de placa fria | Tecnologia TE Controlador | de temperatura CP-121 | |
| Tecnologia TE | TC-36-25 RS232 |
Referências
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Meth mol biol. 337, Clifton, N.J. 117-125 (2006).
- Gibb, A., Edwards, F. Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelect Techniq. , 255-274 (1994).
- Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R.
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Reimpressões e permissões
