Summary
הוסר לאחר מהגוף, רקמה עצבית היא השפיעה מאוד על ידי תנאים סביבתיים, המוביל השפלה הסופי של רקמות לאחר 6 - 8 שעות. באמצעות שיטת דגירה ייחודית, אשר מקיימים מעקב קפדני אחרת ומסדירה את הסביבה התאית של הרקמות, כדאיויות רקמות ניתן להאריך באופן משמעותי עבור> 24 שעות.
Abstract
חריפת הכנות רקמות עצביות, פרוסות מוח wholemount רשתית, בדרך כלל יכול להישמר רק 6 - 8 שעות לאחר ניתוח. עובדה זו מגבילה את זמן הניסוי, ומגדיל את מספר בעלי החיים בהם נעשה שימוש לכל מחקר. מגבלה זו משפיעה באופן ספציפי פרוטוקולים כגון הדמית סידן הדורשים דגירה מראש ממושך עם צבעים להחיל אמבטיה. גידול מעריכי חיידקים תוך 3 - 4 שעות לאחר החיתוך מתואם היטב עם ירידת בריאות רקמות. מחקר זה מתאר שיטה להגביל את ההתפשטות של חיידקים בהכנות חריפות לשמור רקמות עצביות קיימא עבור פרק הזמן ממושך (> 24 ח) ללא הצורך באנטיביוטיקה, נהלים סטרילית, או תקשורת ותרבות רקמה המכילה גורמי גדילה. ידי רכיבה על אופני נוזל החוץ-התאים באמצעות קרינת UV ו לשמור על שלמות הרקמה בתא חזק מותאם אישית ב 15 - 16 מעלות צלזיוס, הרקמה מראה שום הבדל תכונות אלקטרו, או סי סידןgnaling באמצעות צבעים סידן תאיים ב> 24 שעות postdissection. שיטות אלה לא רק להרחיב את זמן הניסוי עבור אלה באמצעות רקמה עצבית חריפה, אך תפחית את מספר בעלי החיים הנדרשים כדי להשלים מטרות הניסוי, ותציב סטנדרט הזהב הדגירה רקמה עצבית חריפה.
Introduction
Electrophysiology והדמיה תפקודית (סידן, מתח צבעים רגישים) הם שתיים ניסיונותיי בטכניקות הנפוצות ביותר במדעי המוח. מוח הכנות פרוסות wholemount ברשתית, אשר תיבחן כאן, לספק אמצעי לבחון תכונות אלקטרו וקישוריות הסינפטי ללא זיהום הרדמה או מרפי שרירים. פרוסות רשתית המוח wholemount לשמור על שלמות מבנית שלהם, בניגוד תרבויות או homogenates התא, וכך מתאפשר לחקר מעגלים ספציפיים ורשתות המוח 1. הקלטות מרקמות מבודדות יש יתרונות על פני הקלטות vivo כתנועות הקשורים פעילות הלב והנשימה בוטלו. יתר על כן, להדמיה ישירה מאפשרת שיעורים ספציפיים של תאים להיות ממוקד, יישום מקומי של כלי התרופתי 2, 3.
הקלטות תיקון מהדק ו Calcium צבען טעינת wholemount רשתית הוא מסובך בשל הקיום של Inner הגבלת ממברנה (ILM), אשר מכסה את תא גנגליון רשתית (RGC) השכבה ומונעת גישה ישירה אל התאים. בדרך כלל, קרום זה שגירד עם טפטפת זכוכית כדי לאפשר יישום ישיר של תיקון פיפטה היווצרות חותם gigaohm על תא בודד. בנוסף, צבעי סידן מיושם אמבטיה לא לחצות את ILM ואו חייב להיות מוזרק מתחת קרום זה 4, retrogradely מועברים ההזרקה הבאה עצב הראייה 5 או electroporated דרך הרקמה 6. יתר על כן, כאשר ניצול מודל מכרסם של רטיניטיס פיגמנטוזה, עכבר rd / rd, את ILM הוא עבה יותר חדיר. כאן, אנו משתמשים בטכניקה כדי להסיר את ILM עם עיכול אנזימטי 7, כדי לאפשר הן סידן נמצא בכל מקום טעינת צבע, וגישה ישירה לתאי הגנגליון ברשתית עבור recordi תיקון- clampNGS 8.
הקלטות מוצלחות מ פרוס או מוח או wholemount רשתית תלויות לנתיחת דגירה של רקמה עצבית קיימא. בדרך כלל, רקמה מופקת בבוקרו של הניסוי וטופחה בנוזל מלאכותי השדרתי (aCSF) עד שהוא משמש להקלטות. בדרך כלל, רקמה נשארת קיימא עבור 6 - 8 שעות, עם השפלה משמעותית הבאים חלון זמן זה. עם זאת, הן פרוסות המוח והכנות רשתיות wholemount בדרך כלל לייצר יותר רקמות מאשר ניתן להקליט בתוך פרק זמן קצר זה. כתוצאה מכך, רקמה נמחקת לעתים קרובות בסוף היום לנתיחה תושלם שוב בימים שלאחר מכן. משמעות דבר היא חיה אחרת מנוצלת ו ~ 2 שעות של התקנה לנתיחה / מכתים חזר. הפרוטוקול הבא מתאר שיטה עבור הארכת החיים של רקמות עצביות במשך יותר מ -24 שעות, כלומר פחות בעלי חיים מנוצלים, ועוד זמן ניסוי זמין. הכדאיות רקמות wכפי שהוערך באמצעות רישום תכונות אלקטרו ודינמיקה סידן, ומאפיינים אלה אי אפשר היה להבחין בין <ג 4 ו> 24 שעות postdissection.
תוצאות אלו מצביעות כי לא רק הם המאפיינים תא בודד ללא פגע ופונקציונלי לאחר דגירה ממושכת, אך פעילות הרשת, כפי שהוערך על ידי סידן הדמיה הקלטות אלקטרו, הוא ללא שינוי> 24 שעות postdissection. יתר על כן, אנו מראים כי צבעי סידן יכולים להישאר בתאים לתקופות ממושכות מבלי לגרום השפעות מזיקות. יישום של פרוטוקול זה מוכיח כי הפעילות התפקודית של נוירונים ברקמה עצבית חריפה יכולה להישמר במשך תקופות ארוכות, פעם הסביבה החיצונית היא פיקוח הדוק. יתר על כן, כפי כדאיויות רקמות משתנות במידה רבה בין מעבדות עקב פרוטוקולי דגירה שונים, שיטה זו קובעת סטנדרט זהב הפרמטרים האידיאליים כי יש להחיל להפחית השתנות בבריאות neu החריפהרקמת רונאל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול להלן מתאר את הכנת C57BL / 6 ו C3H / הוא (retinally מנוונת) עכבר רקמות עצביות, אך בטכניקות דומות ניתן ליישם מינים אחרים. כל בעלי החיים היו בריאים מטופלים עם תנאים סטנדרטיים של טמפרטורה, לחות, 12 שעות אור / חושך מחזור, גישה חופשית למזון ומים, וללא גירויי מתח מיועדים. כל הניסויים אושרו ובוצעו בהתאם טיפול בבעלי חיים באוניברסיטת מערב סידני ואתיקה הוועדה ועל פי השימוש בבעלי חיים והנחיות טיפול (A9452 # רשות המחקר בבעלי חיים, # A10396 ו A8967 #).
1. הכנת פרוסת המוח
- להרדים את החיה על ידי שאיפה של isoflurane (5%) לערוף באמצעות גיליוטינה מכרסם. הסר את המוח במהירות, כפי שתואר לעיל 9 ולמקם אותו לתוך פתרון פיזיולוגי קר כקרח (aCSF) המכיל (מ"מ): 125 NaCl, KCl 2.5, 1 MgCl 2, 1.25 לאא 2 PO 4, 2 CaCl 2, 253 NaHCO, 25 דקסטרוז, ורווי carbogen (95% O 2/5% תערובת CO 2; 310 mOsm; pH 7.4).
- חותכים פרוסות המוח, באזור של עניין, 300 מיקרומטר עבה עם microtome רוטט.
- עבר פרוסות למערכת דגירה שהותקנה מנטרת מקרוב ושולט רמות pH (pH 7.2 - 7.4), זרימת carbogen, וטמפרטורה כפי שתואר לעיל 10, 11.
- גדר טמפרטורה בתא ראשונית עד 35 מעלות צלזיוס במשך 15 - 30 דקות, ולאחר מכן להפחית לאט עד 15 - 16 מעלות צלזיוס כפי שמוצג באיור 1C. ואז דגירה פרוסה במערכת הדגירה עד צורך, גם עבור electrophysiology או הדמיה.
הערה: אם פרוס לשמש הדמית סידן, בצע את השלבים הבאים לפני קירור רקמות מתחת RT.
2. רשתית Wholemount כן פנימי להסרת ממברנה הגבלה
- כן wholemounts רשתית תחת ל'רגילבתנאי תאורה במעבדה או אור אדום / אינפרא-אדום עמום.
- להרדים בעלי חיים על ידי נקע בצוואר הרחם ועיניים enucleate מיד. ביצוע חתך קטן לאורך serrata אורה, ומניחים מדיה או איימס, או aCSF המכיל (מ"מ): 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 3 KCl, 2 2 CaCl, 1 2 MgCl, 10 גלוקוז, 0.5 L- גלוטמין, ו להרוות עם carbogen (95% O 2/5% CO 2 תערובת; ~ 300 mOsm; pH 7.4), ב RT.
- מיד להסיר את הקרנית, העדשה זגוגי על ידי חיתוך לאורך serrata אורה עם מספריים קטנים הסרת העדשה זגוגי עם מלקחיים. מניחים רקמות במערכת הדגירה ב RT.
הערה: רקמת רשתית יכולה להישמר כוס העין, לאחר הפחתת טמפרטורה איטית עד 15 - 16 מעלות צלזיוס, עבור> 24 שעות במערכת הדגירה עד הצורך. - כדי להסיר את ILM, להעביר את כוס העין שמכילה את הרשתית צנצנת זכוכית קטנה שהכילה 30 פפאין U / mL, 1 מ"מ L- ציסטין, 0.5 mM EDTA ו 0.005% DNase ב Earl's-תמיסת מלח מאוזנת (BSS) על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. החל 95% O 2/5% CO 2 לפתרון דרך המכסה אבל לא בועה. אם אתה משתמש רקמות מחיות צעירות (<6 שבועות), לדלל את תמיסת לחץ הכח.
- עצור עיכול אנזימטי, בעצם הצבתה של רקמות בתוך ovomucoid (10 מ"ג / מ"ל) ו BSA (10 מ"ג / מ"ל) פתרון עבור 10 דקות ב BSS של ארל. רקמות לשטוף ביסודיות עם aCSF לפני ההעברה למערכת הדגירה ולהפחית טמפרטורה עד 15 - 16 מעלות צלזיוס.
- לשמור על רקמת הרשתית ב-כוס העין עד הצורך. להעברה המיקרוסקופ, לבודד את הרשתית מהגביע-העין וחותך ל -4 חתיכות עם סכיני גילוח. אם הרשתית כולה נדרשת, לעשות ארבעה חתכים קטנים בפריפריה של הרשתית כדי לאפשר לו לשכב.
הערה: בניסויי הדמיה, עומס עם סידן צבע לפני ההעברה למערכת הדגירה, ראה להלן.
3. שמירה על רקמות בחממה
- הפץ aCSF באמצעות בתא שני (תא UVC, בנויה כפי שתוארו לעיל 12) מבודד מהאולם הראשי חשוף 1.1 W אור UVC (254 ננומטר, 5W / 2P מעקר מנורת UV) על מנת eradiate חיידקים צפים הפתרון (איור 1A). בקרת UVC עיתוי אור באמצעות טיימר לתכנות באמצעות תכונה אקראית המפעילה בזמנים משתנים בין 15 ל 26 דקות כל 15 - 30 דקות כדי למנוע חימום יתר של aCSF.
- הגדר את קצב הזרימה בתא UVC ל -12 mL / min כפי שדווח בעבר 12. מכסה את תא UVC עם רדיד אלומיניום על מנת למנוע תאורת UVC מחוץ לתא, אשר עלול לגרום ניזק לרקמות עצביות.
הערה: לקבלת רקמת רשתית כהה מותאם, חל כיסוי מחוייט לתא הראשי להוציא לאור. - השתמש משאבת peristaltic כדי circulate הפתרון (aCSF) דרך השני תאי צלחת קרה ותרמית פלטייה קרירה משני מגניבים או לחמם את החדר הראשי הטמפרטורה הרצויה בטווח של 0 - 50 ° C. לאינקובטורים רקמה אופטימליים, להשתמש 15 - 16 מעלות צלזיוס למשך כדאיות לטווח ארוכה.
טוען 4. סידן דיי
- בחר צבעי סידן על בסיס ההעדפה של חוקר הפרט. כאן אנו משתמשים פורעה-02:00, Fluo-08:00 או Fluo-04:00. עם זאת, ניתן ליישם שיטה זו כדי צבעים אחרים כמו גם: לפזר צבעים סידן ב DMSO פתרון 1 מ"מ ו 1% קופולימרים לחסום (למשל, חומצה-127 pluronic) לנפח סופי של 50 μL sonicate במשך 10 דקות.
- הוספת פתרון aCSF לריכוז סופי של 10 מיקרומטר, קופולימרים לחסום 0.01% עבור פרוסות מוח, ו -20 מיקרומטר (רשתית), קופולימרים לחסום 0.02% עבור הרשתית. בשנת רשתיות (פפאין מטופלים) ופרוסות המוח מפני בעלי חיים צעירים, עומס באמבטיה במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (פורעה -2 AM) או ב RT (Fluo-4 בבוקר; Fלואו-8 בבוקר).
- עבור בעלי חיים בוגרים, (> 12 שבועות) פיפטה הצבעים (50 μL) ישירות על גבי פרוסות המוח, ולשמור למשך 75 דקות כדי לאפשר חדירה טובה יותר של הצבע לתוך השכבות העמוקות.
- כדי להבטיח חמצון נאותה של הפרוסה שקוע במהלך הדגירה לצבוע, להכין קאמרית טעינת זכוכית עם מכסה סגור (כד עגול בקוטר 2.5 ס"מ, 3.5 ס"מ גובה) עם צבעים סידן מדולל 2.5 מ"ל של aCSF. חמצן ברציפות עם 95% O 2/5% CO 2. האם לא בועה.
- בעקבות טעינת צבע, לשטוף את הרקמה עם aCSF והעביר למערכת הדגירה, לאט להפחית את הטמפרטורה ל 15 - 16 מעלות צלזיוס עד לשימוש ניסיוני.
5. הקלטות אלקטרו והדמיה
- מניח רקמות בתא הקלטה שקועה תחת מיקרוסקופ, ו perfuse עם aCSF מחומצן בקצב זרימה של 4 - 5 מיליליטר / דקה או ב RT (~ 22 ° C) או טמפרטורה פיזיולוגית (~ 35 ° C). חולד הרקמה במקום באמצעות מנהג עשה '' נבל '', עשוי חוטי ניילון או זהב נמתחו ומודבקים על פני פיסה בצורת U זהב או חוט פלטינה.
- לקבלת אלקטרופיזיולוגיה:
- כן טפטפות הקלטה מ -1.5 מ"מ (1.19 מזהה מ"מ) הזכוכית בורוסיליקט באמצעות חולץ micropipette להשיג התנגדות סופית של 5-6 MΩ.
- מלאו את פיפטה עם 3 - 4 μL של פתרון פנימי כפי שתואר לעיל 13 ולדמיין התאים תחת התערבות ההפרש לעומת אינפרא אדום (IR-DIC) באמצעות מצלמת CCD. הפתרון התאי צריך להיות מותאם בקפידה כל ניסוי כדי להשיג תוצאות ניסוי.
- פיפטה עמדה, תוך שמירה על לחץ חיובי להחיל דרך יציאת יניקה על בעל פיפטה, על קרומית התא באמצעות micromanipulator. מאז ILM הוסר מהרשתית, לא גירוד קרום לפני נדרש. ברגע פיפטה הוא על התא, להחיל שלילי עדיןלחץ פיפטה להשיג חותם gigaohm. ואז לקרוע את קרום התא עם כמות קצרה של לחץ שלילי.
- הפוך כל תא קלטות שוטפות או מתח- clamp באמצעות טכניקות סטנדרטיות על פי צורך.
- סידן הדמיה:
- עבור הדמיה ratiometric של פורעה -2, השתמש במחליף גל מהירות גבוהה במיוחד כדי לספק אורכי גל עירור של 340 ננומטר ו -380 ננומטר. Pass אור נפלט תאים בודדים באמצעות מסנן פליטה של 510 ± 20 ננומטר, וללכוד עם מצלמה דיגיטלית, במהירות גבוהה רגישות גבוהה.
- עבור גל עירור יחיד של Fluo-4, אור עירור מסנן דרך 460 - לעבור סינון 490 ננומטר להקת אור נפלט דרך 515 - מסנן מעביר פס 550 ננומטר. עבור ההקלטה המהירה הרגישה ביותר להשתמש במצלמה דיגיטלית במהירות גבוהה כל כך. לרכוש תמונות כנדרש.
- מדוד שינויי קרינה כפונקציה של זמן או בכל אורך גל יחיד (Fluo-4) או באמצעות יחס אורך הגלשיטה (פורעה-2), כמתואר 8 בעבר, 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
רגולציה הדוקה של העומס חום חיידקים של aCSF במהלך הדגירה היא חיונית כדי לשמור על כדאיות רקמות עצבית. זה יכול להיות מותאם באמצעות הקרנת אור UVC ושמירה על הטמפרטורה של aCSF ב 15 - 16 ° C (איור 1). יתר על כן, aCSF פרמטרים החותם (APS; איור 1 ג) מספק הנסיין עם רקורד של התנאים הסביבתיים (pH ואת זמנים.), ובכך להציע סטנדרט זהב פרמטרים כאשר דוגר רקמה עצבית, אשר, אם בעקבותיו, תפחית השתנות בין ניסויים.
איור 1. מערכת דגירה המאפשרת תקנה צמודה של סביבת רקמות. A, תרשים סכמטי של מערכת הדגירה מורכבת צלחת קירור פלטייה, לאולם המרכזי, משאבת peristaltic קאמרית UVC. B,מבט צד של החדר הראשי מראה את נקודות הכניסה והיציאה של aCSF, כמו גם כניסת carbogen, בדיקות טמפרטורה ו- pH. רקמות מושמות על הרשת כמצוין. כל הבדיקות למדידת מחוברים המכסים כדי לאפשר יציבות מבנית. C, aCSF פרמטרים בול המתאר את טמפרטורה ו- pH של aCSF במהלך הדגירה. D, נוף העליון של החדר הראשי מראה את החורים לתלייה על בדיקות המדידה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הכדאיות רקמות ניתן למדוד באמצעות פעילות הרשת (איור 2), כמו גם שיטות הדמיה שונות, ובהן התייחסות סידן (תרשים 2B, C). כדי לפקח על פעילות הרשת, אנחנו מוחלים aCSF המכיל ריכוז גבוה של אשלגן כלורי (KCl; 30 מ"מ) מקומית, מה שהוביל שלילת קוטביות של נוירונים גליה בתוך בקרבת להחיל K +. שלילת קוטביות זו יכולה להיות שנצפו על ידי הגידול הארעיים סידן (תרשים 2B, C) ופעילות עם העליה (איור 2 ד), אשר משמש גם אינדיקטור פיזיולוגיים עבור כדאיות התא. התוצאות שלנו מראות כי תוקעי פעילות פרוסות הודגרו במשך> 24 שעות במערכת הדגירה היה דומה "טריות" פרוסות מודגרות לתקופות קצרות (> 4 שעות; איור 2 ד). יתר על כן, כדאיות נוירון יחיד, אשר נוטרה באמצעות הקלטות אלקטרו תאיות הם תכונות הממברנה פסיביות ואקטיביות, כוללים פוטנציאל הממברנה במנוחה, התנגדות קלט, זמן קבוע, ואת פוטנציאל פעולה הייתה להשוות פרמטרים ממדווחים בספרות 15 (האיור 2E, F ).
class = "jove_content"> 
מאפייני איור 2. אלקטרו סידן של המוח פרוס לאחר דגירה ממושכת. A, תמונה של פרוסת מוח נלקחה 28 שעות לאחר חיתוך עם שתי אלקטרודות הקלטה תאיות המשמשות למדידת פעילות הרשת. אלקטרודה שלישית (מסומן בכוכבית) משמשת כדי נשיפת 30 מ"מ של KCl. B, תמונות זמן לשגות של פרוסות עמוסות Fluo-04:00 עבור> 24 שעות, המתאר עלייה הארעית סידן תאיים הבאים אמבטית יישום של KCl. C, הארעיים סידן תאיים הבאים יישום קצר של KCl (30 מ"מ; 1 ים). אות ממוצע, גריי - - אדום עקבות סידן תאים בודדים כפי שמוצג ב. D, הקלטה פיזיולוגית תאית של פעילות הרשת לפני ואחרי היישום של KCl (חצים אדומים) נותרה ללא שינוי מהותי בין פרוסות "טריות" (<4 שעות postdissection) ואלה הודגרו במשך> 24 שעות בחממה. הערת הגידול spiking פעילות מייד לאחר יישום KCl המציין נוירונים קיימא המגיבים להגדיל ב [K +] עם שלילת קוטביות. E & F, פסיבי (E), ופעילה (F) תכונות הממברנה של נוירון פירמידלי הבא 2 h (עקבות כחולות) או 26 שעות (עקבות שחורות) של דגירה במערכת הדגירה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
כדי לספק גישה ישירה אל התאים של שכבת תא גנגליון רשתית wholemount של עכברי retinally מנוונים rd / rd, את ILM היה מתעכל על ידי פפאין האנזים 7, 8. לאחר העיכול, RGCs ותאי amacrine העקורים ניתן דמיינו בבירור undאה תאורה DIC (איור 3 א), ותאי יכול להיות ממוקד להקלטות תיקון- clamp ללא כל גירוד מראש של ILM. ההקלטות הנוכחי מהדק נציג מתוך RGC מוצגים באיור 3 ב. שלילת קוטביות של התא באמצעות פיפטה את התיקון שנגרמה דור פוטנציאל פעולה תלוי במינון, המציין את הכדאיות של התאים בעקבות טיפול פפאין.
הסרת ILM גם מותר מכתים בכל מקום של שכבת תא גנגליון (GCL) עם פורעה-02:00 (איור 3D) ותאי הגיבו 30 מ"מ KCl יישום עם עלייה גדולה יחסית יחס 340/380 ננומטר עד ו 0, המסמל גדול עלייה בריכוז הסידן התוך-תאי (איור 3E). רמות סידן חזרו Baseline הגירוי הבא ותאיות יכול להיות מגורה לאחר מכן על מנת לייצר תגובה משרעת דומה. יתר על כן, התגובות הללו אי אפשר היה להבחין בין retinae נרשם <4 שעות ו> 24 שעות postdissection (איור 3F, G).
איור 3: הקלטות אלקטרו וסידן רשתית Wholemount. A, תמונה בעלת ניגודיות הפרעות דיפרנציאלי של הקלטה תיקון- clamp מתא גנגליון ברשתית GCL לאחר עיכול פפאין. B, תאים לשמור תגובות spiking תלוי במינון כאשר depolarized עם 50, 100 ו -150 רשות בהתאמה. C & D, הסרת קרום הגבלת הפנימי לפני יישום אמבטיה של פורעה-02:00 מאפשר טעינה בכל מקום של תאי גנגליון הרשתית, התמונה נלקחה עם 380 עירור ננומטר. E, כאשר 30 מ"מ KCl ASCF מוחל, 85% של תאים מוכתם הגיב עם גידול יחס 340/380. F & G, הגידול 340/380 חוזר יחס אל בסיס לאחר 30 יישום המ"מ KCl (ברים אדומים), ואת התאים מגיבים לגירוי עוקב <4 שעות ו> 24 שעות לאחר דיסקציה שניהם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מתאר שיטת דגירה להאריך את הכדאיות של רקמות עצביות חריפות לניסויי הדמית אלקטרו, ובכך להפחית את מספרי החיה הדרושים כדי להשלים מטרות ניסוי. שני תהליכים עיקריים הקובעים את ההידרדרות של רקמה עצבית לאורך זמן: i) רמות חיידקים מוגברים, וגידול ליווי רעלן פנימי חיידקים שוחרר, ii) יתר רעיל אשר עוקב אחר הליך החיתוך הטראומתי 10. כמו רקמה עצבית חריפה היא הגנה על איכות הסביבה, רגולציה הדוקה של הסביבה רקמות באמצעות מעקב צמוד של pH, טמפרטורה ורמת חיידקים חיונית לשמירה על הפעילות התאית וכן שלמות הרשת. Dissection, וטיפול רקמות (עיכול פפאין, צבע טעינת סידן) יכולים להשתלט 2 שעות כדי להשלים, מה שגרם לירידה זמן הניסוי. עם זאת, מאז הרקמות יכולות להישמר במערכת הדגירה של> 24 שעות ללא הפסד מדידי in כדאית 7, 8, הכנה זו רק צריכה להסתיים פעם להשיג> 24 שעות של תוצאות. כחלק מאסטרטגית 3Rs (החלפה, צמצום, שכלול) שמטרתה לספק עקרונות מנחים לשימוש מוסרי לחיות 16, שיטה זו תהיה השפעה גדולה על צמצום מספר בעלי החיים המשמשים סוגים אלה של ניסויים.
עיכול של ILM של רקמות wholemount רשתית מאפשר מיקוד קל של תאי GCL להקלטות תיקון- clamp וטעה צבע סידן נמצא בכל מקום על ידי יישום אמבטיה. טכניקות אלה הן שימושיות במיוחד עבור רשתיות מנוונות שבו ILM הוא הרבה יותר עבה ויותר קשה לפרוץ על ידי גירוד עם טפטף זכוכית. יתר על כן, הכנת פפאין מספקת דרך לבצע תא הקלטות לזווג באמצעות שתי אלקטרודות להקליט מתאים-צומת הפער מצמידים את GCL, משהו שלא היה אפשרי בעבר. למרות זאתפפאין, עיכול יש להניח כמה השפעות על פיזיולוגית רשתית נורמלית כמו ביטוי הקולטן K + הוכח להיות שונה קולטני אור הבא דיסוציאציה עם פפאין 6. אפשר גם שאדריכלות רשתית מושפעת. Velte ו Masland הראו כי למרות כמה somas דנדריטים RGC ניזוקו על ידי טיפול פפאין להסיר את ILM, שיוכלו להקליט בהצלחה RGC דנדריטים דיסטלי סומה ברוב נוירונים, המציין את השלמות המבנית של תאים ומעבד 5. חשוב לציין, עוזב את הרשתית מצורפת אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) והלחמית, כמתואר לעיל, מבודד את הרשתית החיצונית דיפוזיה פפאין עשוי להפחית תופעות לוואי על מגזרי photoreceptor חיצוניים כאשר בפרוטוקול זה מוחל WT רשתיות. בשני המקרים, הטיפול פפאין, או גירוד של ILM, נזק לתאים מסוימים תתרחש, הנסיין חייב לבחור את השיטה המתאימה אל experimשאלת ental.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich VETEC | V800372 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | |
| N-Methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | 223506 | |
| Papain Dissociation System | Worthington | LK003150 | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Pluronic F-127 Low UV absorbance* | Life technologies | P-6867 | 20% solution in DMSO |
| Fura-2 AM | Anaspec | 84017 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F23917 | |
| Fluo-8 AM | Abcam | Ab142773 | |
| Vibrating blade microtome | Leica Biosystem | VT1200 S | Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device |
| Antivibration table | Kinetic Systems Vibraplane | Vibraplane 9100/9200 | |
| Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Microscope Objective | Olympus | XLUMPlanFLN 20x/1.00w | 20X |
| Microscope Objective | Olympus | LUMPlanFLN 60x/1.00w | 60X |
| CCD Camera | Andor | Ixon + | |
| High speed wavelength switcher | Sutter instrument | Lambda DG-4 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instrument Co | BF150-86-10 | |
| Microelectrode puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-40LP | Low Profile Open Bath Chambers |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Andor iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 | |
| Braincubator | Payo Scientific | BR26021976 | www.braincubator.com.au |
| Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler | TE Technology | CP-121 | |
| Temperature Controller | TE Technology | TC-36-25 RS232 |
References
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Meth mol biol. 337, Clifton, N.J. 117-125 (2006).
- Gibb, A., Edwards, F. Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelect Techniq. , 255-274 (1994).
- Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3. Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).
- Blankenship, A. G., et al. Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves. Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).
- Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J Vis Exp. (92), e51396 (2014).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina. J Vis Exp. (99), e52588 (2015).
- Velte, T. J., Masland, R. H. Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells. J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).
- Cameron, M., et al. Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
- Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Breen, P. P., Buskila, Y. Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology. Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).
- Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. Device for storing a tissue sample. WIPO Patent. , WO2015021513A1 (2015).
- Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Sci Rep. 4, 4-10 (2014).
- Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices. Glia. 52 (3), 169-176 (2005).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).
- Buskila, Y., et al. Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse. PLoS ONE. 2 (9), 9 (2007).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen. London, UK. (1959).
