Method Article

分析树突状形态的列和图层

DOI:

10.3791/55410

⸱

March 23rd, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Section on Neuronal Connectivity, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health (NIH), 2Mathematical and Statistical Computing Laboratory, Center for Information Technology, National Institutes of Health (NIH), 3Biomedical Imaging Research Services Section, Center for Information Technology, National Institutes of Health (NIH)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，我们将展示如何分析列和层果蝇髓质神经元树突路由。该工作流包括一个双视图成像技术，以改善跟踪，登记树突乔木于基准列数组以及用于分析在三维空间中的树枝状结构的图像质量和计算工具。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在中枢神经系统中，如苍蝇视叶和脊椎动物皮质许多地区，突触电路中的层和列组织发达的动物发展和信息处理中，以促进脑布线。突触后神经元精心树突在特定层的型特异性模式与适当的突触前末梢到突触。飞髓质神经毡是由10层到约750列;每一列是通过在38种髓质的神经元，配合部分7种类型的传入的在一个特定类型的方式终末其中树突支配。该报告详细介绍了程序，图像和分析延髓神经元树突。该工作流包括三个部分:（i）该双视图成像部分结合在正交取向成树突的高分辨率三维图像收集整理二共焦图像堆栈; （二）树突追踪和登记部分树突状痕迹在3D乔木和树突注册痕迹，参考列数组; （ⅲ）该树枝状分析部分分析的树突状图案相对于列和层，包括树突乔木层特定的终止和平面投影的方向，并导出树枝状分支和终止频率的估计。该协议利用建立在开源MIPAV（医学影像处理，分析和可视化）平台和自定义工具箱中的矩阵实验室语言自定义插件。总之，这些协议提供一个完整的工作流来分析层和列果蝇髓质神经元的树突的路由，以确定细胞类型，并确定在突变体的缺陷。

Introduction

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在开发过程中，神经元在复杂的，但千篇一律的分支图案精致的树突形成与突触前伙伴突触。树突分枝模式相关与神经元的身份和功能。树突乔木的位置确定的，他们收到的突触前输入的类型，而树枝状分枝的复杂性和字段大小支配输入号码。因此，树突形态属性是突触连接和神经元计算的关键因素。在复杂的大脑，诸如苍蝇视叶和脊椎动物视网膜许多地区，突触电路中的列和层组织，以促进信息处理1,2。在这样的列和层的组织，一个独特的形态项目轴突突触前神经元在一个特定层（所谓的特定层的定位）终止，并形成一个有序的两维阵列（所谓的卡勒ð地形图），而突触后神经元延长特定层适当大小的树突接收到正确的类型和数量的突触前输入。而轴突靶向层和列已经得到很好的研究3，4，较少被知道关于树突如何路由到特定层和扩大适当大小感受域，以形成具有正确的突触前伙伴5突触连接。成像和量化树突靶向层和列的困难阻碍了柱状和夹层的大脑结构树突发育的研究。

果蝇神经髓质是研究在列和树突状层路由和电路组件的理想模型。苍蝇髓质神经纤维组织为10层的3D格与约750列。每列由一组传入，的p支配hotoreceptors R7 / R 8和薄层神经元L1 - L....

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Protocol

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注意:该协议包含三个部分:双视图成像（部分1 - 3），树突跟踪和登记（第4 - 6），和树突分析（第7 - 9）（ 图1）。在材料/设备的表中提供的代码和示例文件。

1.双图像采集

注意:此步骤是为了获得所关注的神经元的两个图像栈在两个正交（水平和额叶）取向。

  1. 制备该含有疏标记髓质神经元飞大脑（〜10个细胞/脑叶）用膜GFP标记（mCD8GFP），如前所述12。染色用兔抗GFP（为髓质神经元树突）和小鼠mAb24B10（对感光体的轴突），初级抗体和荧光二抗（Alexa的488抗兔和Alexa 568抗小鼠抗体）的脑，如前所述13。清除在1×PBS中的70％甘油的大脑。
  2. 到安装在水平方向脑（ 图2A，B）中 ，甘油清除飞脑转移到在滑动的中心的抗褪色封固剂20μL的下降。
  3. 在4个角盖玻片附上粘土小补丁，以防止盖玻片从安装过程中破碎的大脑样本。
    注:粘土补丁提供缓冲，以防止盖玻片从破碎的样本。每个粘土贴片应在直径约为1毫米。
  4. 在解剖显微镜下，在腹侧上位置定位大脑，并放置盖玻片放在上面，以确保大脑。用脑的凸背表面作为地标来识别脑样品（ 图2A）的方向。

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Results

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利用这里提出的双视图成像过程，含有疏标记TM20神经元蝇脑在两个正交的方向被成像。成像之前，将脑与用于可视化膜 - 拴系的GFP和感光体轴突适当初级和次级抗体染色。用于成像，大脑首次安装在水平方向（ 图2A，B）。一个GFP标记TM20神经和周围感光体轴突使用共聚焦显微镜（ 图3A）成像。大脑，然后重新对准（ 图2A，B）和在正面方向（ 图3B）相同的TM20神经元被重新成像。在成像过程中，TM20神经元的位置被确定为在合适的髓质神经毡（RV配置）的腹侧一半。这两个图像堆栈用图像去卷积软件和REC反褶积使用MIPAV（ 图3C），以产生重组图像堆栈（ 图3C'）ombined。相比于任一输入堆栈（ 图3A'，B'）的所述重组的图像堆栈表明轴向畸变的显著减少。

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Discussion

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在这里，我们将展示如何图像和分析果蝇神经髓质树突乔木。第一部分，双视图成像，描述了去卷积和两个图像栈的组合成一个高分辨率的图像栈。第二部分，枝晶追踪和登记，介绍髓质神经元的参考列数组的树突的追查​​和登记。第三部分，树突状分析，介绍了使用自定义脚本来分析树突状图案。总之这些协议提供了一个完整的工作流中提取树突状模式的信息相对于图层和列，并确定树突分枝和终止频率。

这里提出的双视图成像方法在概念上类似于与光片显微镜实现多视点的成像技术，其中两个或更多个图像栈收集正交被重新组合，实现了高的轴向resolutioñ17，18。然而，它在技术上是挑战性的正交实现所需要的成像细长树突两个高NA（数值孔径）物镜。因此，该双视图方法需要在两个连续的步骤成象的脑样品和重新定向成像之间的样本。在图像组合的失败很可能是由样本移动操作过程中成像或样品压扁过程中造成的。此外，虽然在图像重组过程减轻轴向失真问题和在近各向同性分辨率的结果，该重组的图像仍在一个衍射极限。我们的.......

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Disclosures

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作者什么都没有透露。

Acknowledgements

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这项工作是由美国国立卫生研究院院内研究计划的支持，儿童健康和人类发展（授予HD008913到C-HL）的尤尼斯·肯尼迪·施莱佛国立研究所和信息技术中心（PGM，NP，ESM ，和MM）。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
软件
Huygens ProfessionalScientific Volume Imaging16.05 版，用于图像反卷积 （https://svi.nl）。商业软件
MIPAV7.3.0 版，用于图像重组和配准 （http://mipav.cit.nih.gov/）;免费软件
MIPAV 插件：PlugInDrosophila
RetinalRegistration.class		免费软件
MIPAV 插件： PlugInDrosophilaStandard
ColumnRegistration.class		免费软件
ImarisBitplane，用于追踪神经突和为图像配准分配参考点 （http://www.bitplane.com）;商业软件
Vaa3D用于可视化 swc 文件 （https://github.com/Vaa3D/release/releases/）;免费软件
MatlabMathworksR2014b，用于树突的形态测量分析（http://www.mathworks.com）;商业软件
Matlab 工具箱：TREES1.14v1.14用于分析树枝状形态参数（http://www.treestoolbox.org/download.html）;免费软件
Matlab 工具箱：Dendritic_Tree_Toolboxv1.0用于计算形态测量参数 （https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration）。免费软件
名称Company目录号评论
样本文件
SWC 文件定义http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
图像组合和套准https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
参考点示例 https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate=
1471880596000&api=v2
名称Company目录号评论
计算机系统
MS Windows Windows 7 x64 或 Macintosh OS X 10.7 或更高版本3GHz 64 位四核处理器，16G RAM（最小）
可选：Quadro4000 （或更高版本）显卡Nvidia用于树突的立体可视化。
可选：NVIDIA 3D vision2Nvidiahttp://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
可选：用于 NVIDIA 120D vision2 的 3 Hz LCD 显示屏2http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
名称Company目录号>Comments
成像试剂
24B10 抗体The Developmental Studies Hybridoma Bank24B10
GFP Tag 抗体Thermofisher ScientificG10362
山羊抗兔 （H+L）、Alexa Fluor 488Thermofisher ScientificA11034
山羊抗小鼠 （H+L）、Alexa Fluor 568Thermofisher ScientificA21124
VECTASHIELD抗淬灭安装介质Vector LaboratoriesH-1000
 粘土 FisherS04179
70% 甘油溶于 1x PBS
盖玻片中，高性能，D = 0.17 毫米蔡司474030-9000-000
，的代码和示例文件 ，安装

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaas, J. H. Topographic maps are fundamental to sensory processing. Brain Res Bull. 44 (2), 107-112 (1997).
  2. Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66 (1), 15-36 (2010).
  3. Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H.....

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