Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Herstellung von Mikrofluidik-Chips und der Aufbau von mikrofluidischen Experimenten optimiert, um die Lebensdauer und zellulären Phänotypen einzelner Hefezellen zu messen.
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Methodenartikel
Mikrofluidik-Geräte mit Measure Lebensdauer und Cellular Phänotypen in Einzel Budding Hefezellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die knospende Hefe Saccharomyces cerevisiae ist ein wichtiger Modellorganismus in der Alternsforschung. Genetische Studien haben viele Gene mit konservierten Auswirkungen auf die Lebensdauer aller Arten aufgedeckt. Die molekularen Ursachen des Alterns und des Todes sind jedoch nach wie vor schwer fassbar. Um ein systematisches Verständnis der molekularen Mechanismen zu erlangen, die der Hefealterung zugrunde liegen, benötigen wir Hochdurchsatzmethoden, um die Lebensdauer zu messen und verschiedene zelluläre und molekulare Phänotypen in einzelnen Zellen zu quantifizieren. Zuvor haben wir mikrofluidische Geräte entwickelt, um knospende Hefe-Mutterzellen während ihrer gesamten Lebensdauer zu verfolgen, während neugeborene Tochterzellen weggespült werden. In diesem Artikel wird eine Methode zur Herstellung von mikrofluidischen Chips und zum Aufbau von mikrofluidischen Experimenten vorgestellt. Mehrere Kanäle können verwendet werden, um Zellen gleichzeitig unter verschiedenen Bedingungen oder von verschiedenen Hefestämmen zu verfolgen. Ein typischer Aufbau kann Hunderte von Zellen pro Kanal verfolgen und ermöglicht eine hochauflösende Mikroskopbildgebung über die gesamte Lebensdauer der Zellen. Unsere Methode ermöglicht auch eine detaillierte Charakterisierung der Lebensdauer, der molekularen Marker, der Zellmorphologie und der Zellzyklusdynamik einzelner Zellen. Darüber hinaus ist unser mikrofluidisches Gerät in der Lage, eine beträchtliche Menge frischer Mutterzellen einzufangen, die durch nachgeschaltete Bildanalyse identifiziert werden können, wodurch es möglich ist, die Lebensdauer mit höherer Genauigkeit zu messen.
Einleitung
Bäckerhefe ist ein leistungsfähiger Modellorganismus in der Altersforschung. Jedoch beruht eine herkömmliche Assay Lebensdauer in Hefe auf Mikrodissektion, was nicht nur arbeitsintensiv , sondern auch geringen Durchsatz gleich 1, 2. Darüber hinaus ist die traditionelle microdissection Ansatz bieten nicht eine detaillierte Ansicht der verschiedenen zellulären und molekularen Merkmalen in den einzelnen Mutterzellen, während sie altern. Die Entwicklung von Mikrofluidik - Vorrichtungen ist ein automatisiertes Verfahren zur Messung der Lebensdauer Hefe sowie zu folgen molekularen Marker und verschiedene zelluläre ....
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Protokoll
1. Silizium-Wafer-Form Fabrication
HINWEIS: Die Photomaske mit AutoCAD-Software und hergestellt von einem kommerziellen Unternehmen entwickelt wird. Dieser Entwurf enthält drei Schichten von verschiedenen Mustern ( Zusatzdatei 1 ). Die Höhen der ersten, zweiten und dritten Schichten sind etwa 4 um, 10 um und 50 um betragen. Die Siliziumwafer Form wurde von der Photomaske unter Verwendung von Softlithographie 9, 10 geschaffen.
- Bake einen Siliziumwafer bei 200 ° C für 10 min des Wasserdampf zu v....
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Ergebnisse
Nach den Experimenten können die Lebensdauer der Zellen und viele zelluläre und molekulare Phänotypen aus den aufgezeichneten Zeitraffer-Bilder extrahiert werden. Da es eine Reihe von verschiedenen Funktionen, die von jeder Zelle entnommen werden kann, ist der erste Schritt der Analyse der Zellen und Ereignisse mit Anmerkungen zu versehen, einschließlich der Positionen und Grenzen der Zellen und dem Timing der verschiedenen Ereignisse, die verfolgt werden, wie beispiels wie die angehende.......
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Diskussion
Das PDMS-Gerät muss frisch hergestellt werden. Andernfalls werden die Luftblasen, die durch Rohre in die Vorrichtung eingefügt schwer zu entfernen. Schritt 3.4 ist wichtig, um die Zellbeladungseffizienz zu verbessern, indem die Zellen konzentriert. Um den Durchsatz des Experimentes zu erhöhen, 4 bis 6-Module auf dem gleichen Chip verbunden PDMS unabhängig arbeitende Pumpen typischerweise verwendet werden, durchzuführen 4 bis 6 verschiedene Experimente (verschiedene Stämme oder Medienzusammensetzungen) gleichzeitig.
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Diese Forschung wurde unterstützt von NIH Grant AG043080 und der National Natural Science Foundation of China (NSFC), Nr. 11434001. Wir danken Lucas Waldburger für das Korrekturlesen des Manuskripts.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 3'' < 111> Siliziumwafer | Addison Engineering | ||
| SU-8 2000 und 3000 Serie | MicroChem | ||
| Sylgard® 184 Silikonelastomer Kit | ellsworth | 2065622 | Enthält Sylgard® Silikonelastomerbasis und Härter |
| Petrischalen | VWR | 391-1502 | |
| Harris Uni-core™ Stanze (I.D. 0,75 mm) | Sigma-Aldrich | ||
| 24 mm x 40 mm SLIP-RITE® Deckglas | Thermo Fisher Scientific | 102440 | |
| 3M Scotch Tape | ULINE | S-10223 | |
| VWR® Rasierklingen | VWR | 55411-050 | |
| Reines Ethanol, Koptec | VWR | 64-17-5 | |
| Whoosh-Duster & Handel; | VWR | 16650-027 | |
| 5 mL BD Spritze (Luer-Lock™ Tip) | Becton, Dickinson and Company | 309646 | |
| PTFE Standard Wall Tubing (100 ft, AWG Größe: 22, Nenn-ID: 0,028) | Komponentenlieferfirma | SWTT-22 | |
| Nadelsortiment | Komponentenzulieferfirma | NEKIT-1 | |
| Exsikkator | HACH | 2238300 | |
| Laborofen | Fisher Scientific | 13246516GAQ | |
| Nikon TE2000 Mikroskop mit 40X und 60X Objektiv | Nikon | ||
| Zeiss Axio Observer Z1 mit 40X und 60X Objektiv | Zeiss | ||
| Spritzenpumpe | Longerpump | TS-1B |
Referenzen
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Polymenis, M., Kennedy, B. K. Cell biology: High-tech yeast ageing. Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).
- Xie, Z., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
