Summary
Burada, tonik ve enzim-bağlı mikroelektrot dizileri (MEA) kullanılarak in vivo olarak fazik hücre dışı glutamat değişiklikleri ölçmek için bir uzamsal ve zamansal hassas bir yöntem için kurulum, yazılım navigasyon ve veri analizi tarif eder.
Abstract
Nörotransmitter aksama Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, depresyon ve anksiyete altında yatan patolojide rol oynayan, genellikle merkezi sinir sisteminde (MSS) hastalıklarının önemli bir bileşenidir. Geleneksel olarak, mikrodiyaliz bu hastalıklarda meydana nörotransmitter değişiklikleri incelemek için en yaygın (övülen) tekniği olmuştur. Mikrodiyaliz doku büyük alanlar boyunca yavaş 1-20 dakika değişiklikleri ölçmek yeteneğine sahiptir çünkü, bu potansiyel olarak beyin ve yavaş numune alma kabiliyeti olan içsel bağlantıları yok, invaziflik dezavantajına sahiptir. Nispeten yeni bir teknik, mikroelektrot dizi (MEA) meydana olarak bir uzamsal ve zamansal hassas bir yaklaşım için yapım ayrık beyin bölgelerinde spesifik nörotransmitter değişimleri ölçmek için birçok avantajı vardır. Buna ek olarak, ÇÇA kullanılarak in vivo nörotransmiter değişiklikleri ölçme imkanı veren, minimal invaziv. Laboratuvarımızda, biz haAlzheimer hastalığı patolojisi ile ilişkili nörotransmiter, glutamat, değişimlere özel olarak ilgi geçtim. Bu nedenle, burada tarif edilen yöntem, Alzheimer hastalığının bir transgenik fare modelinde glutamat potansiyel hipokampal aksaklıkları değerlendirmek için kullanılmıştır. Kısaca, yöntem, ilgilenilen ve arka plan gürültüsünü ve girişimcileri dışarı çıkarmak için kendinden referanslı siteleri kullanma nörotransmiter için çok seçici bir enzim ile bir çok site mikroelektrot kaplanır; kullanılır. kaplama ve kalibrasyon sonra MEA mikropipet ile tasarlanmış olabilir ve bir stereotaksik aracı kullanılarak ilgili beyin bölgesi içine indirilir. Burada yöntem, RTG (TauP301L) 4510 fareler anestezi ve hassas hipokampusun alt bölgeler (DG, CA1, ve CA3) hedef bir stereotaksik cihaz kullanılarak içerir tarif.
Introduction
beyinde nörotransmitter değişiklikleri ölçme genellikle nörotransmitter düzensizliği ile karakterize edilen merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıklarının araştırılmasında sinirbilimciler için önemli bir araçtır. Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC / EC) ile kombinasyon halinde hücre dışı mikrodiyaliz nörotransmitter seviyeleri 1, 2, değişiklikleri ölçmek için en yaygın olarak kullanılan yöntem olmuştur rağmen, 3, 4, mikrodiyaliz probları uzamsal ve zamansal çözünürlüğü nörotransmiter için ideal olmayabilir , bu şekilde sıkıca hücre dışı alan 5, 6 düzenlenmiştir glutamat gibi. Çünkü genetik ve görüntülemede son gelişmeler, in vivo olarak glutamat eşleştirmek için kullanılabilecek ek yöntem vardır. genetik olarak kodlanmış glutamat floresan haberci kullanılarak (iGluSnFR) bird, çift foton görüntüleme, araştırmacılar, in vitro ve in vivo 7, 8, 9 hem de nöron ve astrositler tarafından glutamat salınmasını görselleştirmek mümkün bulunmaktadır. Özellikle, bu daha geniş bir görüş alanına kayıt için izin verir ve beynin içsel bağlantılarını kesintiye uğratmaz. Bu yeni optik teknikler glutamat kinetik ve duyusal uyarılmış cevaplar ve nöronal aktivitenin ölçümü görselleştirilmesi için imkan vermesine rağmen, farklı beyin bölgelerinde hücre dışı boşlukta glutamat miktarını belirlemek için kabiliyetinden yoksundur.
Alternatif bir yöntem, selektif olarak kendinden başvurulan kayıt düzeni kullanmak suretiyle, glutamat gibi hücre dışı taşıyıcıların seviyelerini ölçebilir, enzime bağlı mikroelektrot dizi (MEA) 'dir. MEA tekniği travmatik beynin aşağıdaki hücre dışı glutamat değişiklikleri incelemek için kullanılmıştıryaşlanma yaralanma 10, 11, 12, 13, 14, stres 15, 16, epilepsi 17, 18, Alzheimer hastalığı 19, 20, ve bir viral mimik 21 enjeksiyonu mikrodiyaliz doğasında uzamsal ve zamansal sınırların üzerinde bir gelişmeyi temsil etmektedir. Mikrodiyaliz sinaps 22, 23 yakınında ölçmek için sınırlayan ise, taraflı çevre hücre dışı glutamat yayılma seçici önlemler yakınındaki 24, 25 sinapsların izin veren yüksek uzamsal çözünürlüğü vardır. İkinci olarak, mikrodiyaliz düşük zamansal çözünürlüğü (1-20 dakika) araştırmak için sınırlarİkinci aralıkta 26 milisaniye meydana gelen glutamat salınımı ve açıklık hızlı dinamikleri. glutamat veya arıtılması farklılıklar glutamat düzeylerini dinlenme tonik ölçümünde de, belirgin olmayabilir, çünkü glutamat salma ve temizlik doğrudan ölçülen edilmesi gerekli olabilir. Taraflı çevre nedeniyle yüksek zamansal çözünürlüğü (2Hz) ve algılama düşük olan bu sınırların (<1 uM) bu tür önlemler için izin verir. Üçüncü olarak, taraflı çevre örneğin sıçan veya fare hipokampta gibi belirli bir beyin bölgesi içinde nörotransmitterlerin alt-varyasyonlar, incelemesine olanak sağlar. Örneğin hücre dışı glutamat alt-farklılıklarını incelemek için, ayrı ayrı dentat girus (DG), bir trisynaptic devresi 27 ile bağlanır, hipokampus, ve cornu ammonis 3 (CA3) ve cornu ammonis 1 (CA1) hedefleyebilir ÇÇA kullanılmıştır. Implantasyon 28 <neden olduğu - (4 mm uzunluğu 1) ve hasar nedeniyle mikrodiyaliz probları büyüklüğü/ sup>, 29 alt-farklar ele almak zordur. Ayrıca, optik sistemler sadece bu alt-stimülasyon 7 izin vermeyen bir bıyık uyarılması veya hafif titreme gibi dış uyarıcılara yoluyla ulaşmayı sağlamaktadır. Diğer yöntemlere göre ÇÇA son bir yararı onların dışsal ve içsel bağlantıları aksatmadan in vivo bu alt bölgeleri incelemek için yeteneğidir.
Burada, bir seramik bazlı çoklu mikroelektrot içeren ÇÇA ile kombinasyon halinde bir kayıt sistemi (örneğin, FAST16mkIII), diferansiyel tayinle ve analit sinyali kaldırılacak maddeleri müdahale sağlamak için kayıt sitelerinde kaplanabilir açıklar. Ayrıca bu diziler amperometri tabanlı DG, CA3 içindeki in vivo glutamat düzenleme çalışmaları ve anestezi uygulanmış RTG CA1 hipokampal alt bölgelerde kullanılabilir göstermektedir (TauP301L) 4510 fareler, yaygın olarak kullanılan bir m,Alzheimer hastalığının ouse modeli. Buna ek olarak, riluzol farelere işlenmesiyle glutamat salınması ve klirens hızlı dinamiklerine MEA duyarlılığın onayı verir, in vitro olarak gösterilen bir ilaç glutamat salınmasını azaltmak ve glutamat alımını 30, 31, 32, 33 arttırılması için ve TauP301L fare modelinde in vivo bu ilgili değişiklikleri gösteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Enzimlerin veya Matris Katmanı Mikroelektrod Array kaplanması
- Protein matriks çözeltisi hazırlanması
- büyükbaş hayvan serum albümin (BSA), 10 mg tartılır ve bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarılır.
- BSA içeren bir mikro santrifüj tüpüne Dİ suyu 985 uL ekleyin. (BSA çözünene kadar, 1000 uL pipet ~ 3 kez kullanılarak yeniden pipetleme) el ile karıştırma ile çözelti karıştırın.
NOT: çözeltisine hava taşıyabilirler Bunu yaparken olarak çözüm karıştırmak için girdap kullanmayın. Ayrıca, hava kabarcıkları önlemek için bir hacme <1,000 L (örn 700 ul) için pipet ayarlayın. Gerekirse çözelti bir mikrosantrifüj içinde yerleştirilebilir. - BSA çözeltisi ile çözüldükten sonra,% 25 glutaraldehid çözeltisi 5 uL ekleyin. 5 kez - kapalı bir tüp 3 ters çevirerek çözüm karıştırın. Elde edilen çözelti,% 0.125 glutaraldehid ile% 1 BSA.
- Protein matriks Solu kenara5 dakika boyunca tion. Çözelti rengi açık sarı görünür.
- Istenen enzim çözeltisinin hazırlanması (örneğin, glutamat oksidaz)
- Liyofilize süzüldü distile su ilave edilerek glutamat oksidaz çözeltisi hazırlayın, saflaştırılmış enzim (örneğin, 50 uL DI suyun 0.5 U / uL vermek üzere glutamat oksidaz 25 adet ilave edildi).
Not: Kısım stok çözeltisi (örneğin 1 uL) ve -20 ° C'de uygun büyüklükte kapların (örneğin, 500 uL mikrosantrifüj tüpleri) alikotları saklayın. Alikotlar bu koşullar altında en fazla 6 ay süreyle saklanabilir. - glutamat oksidaz ihtiva eden mikro santrifüj bölünmüştür tüp BSA / glutaraldehid çözeltisi 4 uL ekleyin. kılavuzu çalkalama ile bir solüsyon (10 uL pipetle yeniden pipetleme. pipet hacmi <5 uL ayarlanmış olmalıdır). Elde edilen çözelti,% 1 BSA,% 0.125 glutaraldehit ve 0.1 U / ml glutamat oksidazdır.Hemen kaplanması için solüsyonu kullanın.
Not: Glutamat oksidaz kaplama çözeltisi, sadece 15 dakika içinde kullanılabilmektedir. Birkaç ÇÇA'lar bir hazırlanan çözelti ile kaplanabilir birlikte, glutamat oksidaz için kullanılabilen bir zaman aralığı aşmayacak şekilde önerilir. 15 dakika içinde kaplanabilir Elektrotların sayısı değişir. Genel olarak, 4 ila 6 elektrotlar her seferinde kaplanabilir.
- Liyofilize süzüldü distile su ilave edilerek glutamat oksidaz çözeltisi hazırlayın, saflaştırılmış enzim (örneğin, 50 uL DI suyun 0.5 U / uL vermek üzere glutamat oksidaz 25 adet ilave edildi).
- MEA kaplanması
- Tipik olarak kaplama kayıt istenen enzim (glutamat oksidaz) ile bir MEA yer (ler) ve kayıt bölgesi (ler) i ( 'sentinel' bölgesi (ler)), farklı bir çift bir çift aktif protein matrisi ile kaplanır.
- L-glutamat oksidaz veya inaktif protein matrisi çözeltisi (BSA + glutaraldehit) ile kat ÇÇA için kör uçlu Hamilton microsyringes (örneğin 10 uL) kullanın. Enzim ya da inaktif protein matrisi kaplamalarda kullanılan prosedürleri aynıdır.
- kullanımdan önce ve sonra şırınga temizleyin (3 durulama ileIyonu giderilmiş su, metanol ile 3 durulama DI su ile 5 durulama).
Not: Dedicated şırıngalar enzim (glutamat oksidaz) ya da protein matrisinin tabakalarının uygulanması için kullanılır. Farklı bir çözüm için aynı şırıngayı kullanmayın. Enzim kaplamalar daha önce protein matrisi kaplamaların yapılması tavsiye edilir. - Bir 10 uL Hamilton şırıngası kullanılarak glutamat oksidaz ya da bir protein matrisi hazırlayın. Yavaşça (bir mikroskop kullanılarak görüntülendi) şırınga ucunun çözeltinin küçük bir boncuk dağıtmak için pistonu.
- disseksiyon mikroskobu kullanılarak, MEA kayıt hedef bölgelere kısa bir süre bir katman temsil çözeltisi damla / boncuk ile kayıt siteleri temas ettirilmesi ile uygun kayıt sitelerine çözelti uygulamak. Üç kat protein matrisi ve enzim kat hem de yeterlidir. Kalın tabakalar MEA hassasiyetini azaltabilir.
- Dik çözüm damlacık kaldırın ve kayıtları sitelerde olmasını (yani enjektörler ige ucu) MEA yüzeyi boyunca kazımak olmamalıdır.
- 1 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın. Bu kayıt yer (ler) için kaplama uygulamaları arasında en az bir zaman gerekliliktir. enzim kaplı ÇÇA'lar 5-7 gün süreyle 4 ° C'de bekletilmelidir.
- Bir laboratuvar defterine kaplamalar, elektrot numarasını ve bir isim ve tarihini uygulamak ne kadar sürdü, uygulanan kat sayısını kaydedin.
Geliştirilmiş Seçicilik m-fenilendiamin ile 2. Elektrokaplama
- Hazırlama m-fenilendiamin dihidroklorür (MPD) çözeltisi
Not: bu şekilde, diğer potansiyel olarak bir karışan moleküllerin fazla glutamat / H2O 2 için sensör seçiciliğinin geliştirilmesi ile, dopamin ve diğer büyük, müdahaleci moleküller (örneğin, askorbik asit) oksidasyonunu önlemek için ihraç tabakasının, MPD, Plate.- Bir hacimli şişe içinde 0.05 M fosfat tamponlu tuz çözeltisi, 50 mL (PBS) ölçün ve 0.05 50 mL aktarmakdaha büyük bir (150 mL) bir Erlenmeyer şişesine M PBS ile yıkandı.
- Bir azot tankı (örneğin, boru kullanarak bir basınçlı ejektör bağlı) bağlı borular kullanarak, Hortumun açık ucuna bir pipet (örneğin P200 ucu) ekleyin. PBS çözeltisi içinde eklenmiş pipet ucu ile boru yerleştirin ve parafilm ile gevşek bir çözüm kapsamaktadır. 20 dakika boyunca azot ile hafifçe kabarcık çözeltisi açın.
- MPD 0.045 g tartılır.
Dikkat: MPD potansiyel kanserojen bir maddedir. MPD Tartı davlumbaz içinde bulunan bir ölçek kullanılarak yapılmalıdır. MPD kullanırken eldiven ve maske kullanılmalıdır. Kaput işlevsel olduğundan emin olun ve kanat uygun çalışma seviyesine çekilir söyledi. MPD ile kirlenmiş olabilir hemen temiz yüzeyler kalıcı lekelenmesinin önüne geçmek için. - fokurdayan sonra gazı alınmış PBS çözeltisine MPD tüm aktarın. parafilm ve çözelti içinde MPD çözünmesi için yavaşça girdap çözeltisi ile bir şişe açıklığı örtün. aggressiv kaçınıne karıştırılması veya çözelti halinde gazları doğurabilir da bu şekilde bir girdap kullanımı.
- 50 mL'lik bir behere çözelti aktarın. Bir karıştırma çubuğu gerekli değildir.
- elektrot elektrokaplama
- bir referans elektrodu elde edin. MPD sadece kaplama adanmış referans elektrotlar kullanın. Kalibrasyon prosedürleri için farklı bir referans elektrodu kullanarak.
- beher içinde, referans elektrot tutucunun plastik kol pozisyonuna. Cam referans elektrotu içinde hava kabarcıklarının kontrol (görmek mümkün olmayabilir). Yavaşça ucundaki bir hava kabarcıklarını çıkarmak için bir referans elektrotun uzak ucunu hafifçe vurun.
- PBS içeren beher içine plastik kol açma ve altta bulunan bir referans elektrotu yerleştirildi. Referans elektrot, deney şişesinin zeminine temas etmez emin olun.
- MEA MPD plaka olması (örneğin DIP konektör) headstage (örneğin 2 pA / mV) referans elektrot bağlayın ve bağlantıheadstage d.
- Sadece MEA ucu çözeltide batık şekilde beher çözelti içine MEA indirin. siyah 'balonunun' (MEA ucu üzerinde bulunan siyah yalıtım) ötesinde sıvı içinde MEA ipuçlarını batırmayın. Aksi takdirde MEA zarar verebilir.
- Elektrot kanalları ve headstage bağlantının işlevselliğini doğrulamak için bir 'test' kalibrasyon çalıştırın.
NOT: Donanım ayarları, kullanılan ekipman yansıtmalıdır rağmen analit / bir karışan tipi ve konsantrasyonu ile ilgili ayrıntılar 'test' Kalibrasyon için girilmesi gerekmez. yeniden şifreleme modu 'Amperometri' olmalı ve 'V uygulanan' -0.7 V tüm kanallar için tipik kayıt doğrulama olmalıdır. - tüm kayıt sitelerinin bağlantısı doğrulandığında 'İptal' seçerek iptal edin. Kalibrasyon verileri kaydetmek gerekli değildir.
- Masaüstünde "Elektro" simgesini seçin. Elektrolitik içinol Menüsü görünecektir. Doğru ayarlar girildikten doğrulayın:
PP genlik: 0.25
Offset: -0.5
Frekans: 0.05
Süre (dak): 20 - kaplamayı başlamak için 'pause' düğmesine basın. Geçen süre alanı saymaya başlamalıdır.
- tamamlanma (bütün zaman geçtikten) sonra, seçme açıldı menüde 'başka MEA' MPD ek MEA kaplama başlayacak. Bir MEA ile kaplı MEA MPD kaplanması için yerine ve elektro aracını kullanarak elektro prosedürü tekrarlayın.
NOT: en fazla 2 kez veya 1 saatlik bir süre içinde hazırlanan MPD çözümü kullanılması önerilir. 2'den fazla ÇÇA hazırlamak için taze bir çözüm hazırlayın. - elektroliz bitirmek için 'çıkış yazılımını seçin. kalibre önce Dİ suyu (bir tuz kalıntısı önlemek için) ve depo (24 saat) ile MPD kaplama elektrot uçları durulayın.
- çözeltiden referans elektrot kaldırma ve uygun s yerleştirmeden önce Dİ suyu ile durulayınUZUN SÜRELİ MUHAFAZA solüsyonu (örneğin, 3 M NaCI). Referans elektrot ucu çözelti içinde kalmasını sağlayın. çözelti içine yavaşça alt cam referans elektrot cam hasar görmesini önlemek için.
- Uygun bir şekilde etiketlenmiş, tehlikeli bir atık konteynerine MPD solüsyonu atın.
3. Glutamat Algılama ve seçicilik için MEA kalibre edin (Şekil 1) 21
- kalibrasyon için gerekli çözümler hazırlanması.
NOT: Tablo 1'e bakınız. - sabit karıştırma altında kalibrasyonu gerçekleştirmek, 37 ° C 'de (manyetik batarya karıştırıcı çalıştırılır). Isıtma yastığı açın veya su dolaşımlı ve küçük bir karıştırma çubuğu elde edin. yavaş ama bir ekleme (aşağıda) yapıldığı zaman, yeni plato çabuk ulaşılır olduğunu yeterince hızlı karıştırınız.
- kayıt kontrol sistemine headstage (2 pA / mV) geç ve karıştırılmıştır 0.05 M PBS, 40 ml (50 ml beher kullanın) içine MEA sokun.
- r bağlayıneference elektrot. hiç hava kabarcığı olmadığından emin olmak için son Flick.
- kayıt programını açın ve "Kalibrasyon" a tıklayın. ayarları (kontrol etmenizi nöbetçi siteler farklı elektrotlarla değişebilir bu şekilde seçilir), MEA numarası ve basın "Başlat" seçeneğini doğru olduğundan emin olun.
- , Dengeleme için 10 dakika - 5 Veren taban (<0.004 nA / dakika değişimi) stabilize olduktan sonra başlar.
- "Taban çizgisi" seçip 500 uL 20 mM askorbik asit (Parazit, nihai [250 uM]) ekleyin mevcut yeni, sabit bir plato değerine ulaşmış bir kez ve "Parazit" seçilirse, (AA beyin çapında bir karışan olarak düşünülür) herhangi. ilaveler arasında 1 dakika - 0.5 izin verin. MEA düzgün elektroliz yoluyla edilirse, hemen hemen hiçbir değişiklik gözlenmelidir.
- 20 mM L-glutamat (nihai [20 iLM]) 40 uL ekleyin ve güncel kez yeni, istikrarlı platoya, mark 1. ek "analit" ulaşmıştır. 3 glutamat olmak üzere toplam üç kez tekrarlayıne ilave.
- 40 mcL DA ekleyin. "Analit" seçmeyin; "Test Madde" seç - DA yalnızca DA içeren alanlarda bir karışan olabilir.
- 40 uL Peroksit ekleyin. "Analit" seçmeyin; "Test Madde" i seçin.
- Kalibrasyon bittiğinde "Dur" butonuna tıklayın.
- MEA işlevselliğini belirlemek için hesaplama sekmesini tıklayın ve bir laboratuar defterine aşağıdaki parametreleri kaydedin.
- Bu kalibrasyon kullanılan MEA tasarımı (3000 um 2) için, ≥ 0.004 nA / uM'lik bir eğimi olan bir MEA kullanımı, daha düşük eğimler bazı deneyler için kullanılabilir. Enzim kaplanmış ve kaplanmamış siteleri arasında eğim% 10 daha az fark ise, o zaman sadece ya da temiz / MEA atmak uyarılmış serbest bırakılması için bu ÇÇA kullanın.
- 1.5 uM ≤ tespiti (LOD) bir sınır kullanın. LOD 1.5 uM'den büyük ise, o uyarılmış Releas bu ÇÇA kullanmakE ve tek alıma izin verir. tonik seviyelerinin kaydedilmesi için bu elektrotlar kullanmayın.
- > 20 keyfi birimler Enterferan üzerinde arzu edilen analite (örneğin, glutamat) için bir seçiciliğe kullanın. seçicilik sonra temiz, 20'den az ise / MEA atın.
- ≥ 0.90 kalibrasyon eğrisinin bir doğrusallık (R2) kullanın. doğrusallık az 0.90, daha sonra temiz veya MEA atmak ise.
- MEA, tarih # ile dosyayı kaydedin ve kişi kalibrasyon baş harfleri.
4. mikropipet monte
Not: Mikropipetler (kapiler cam), 10 bir iç çapı olan bir uca sahip olmalıdır - 15 um.
- dört platinyum kayıt siteleri arasında merkezi olarak mikropipet yerleştirin ve yapışkan balmumu kullanılarak yapıldı ve kil modelleme MEA üzerinde 50-100 um monte edin.
- Mikropipet yüklemek için, glutamat ya da KCI çözeltisi, 0.22 um'lik steril bir şırınga filte ile doldurulmuş bir 1 ml şırınga kullanınr ve 97 mm long, 28-gauge bir pipet dolgu maddesi, mikropipet dolgu. Yani hava kabarcığı vardır emin olarak, mikropipet üstündeki iğneyi ve mikropipet (MEA doğru uç) altındaki doldurun.
- yaklaşık 1 s için 20 psi - 2 basınç püskürtme sistemine mikropipet takın.
5. Plaka, in vivo kullanım için minyatür Referans Elektrot
- Banyo elektrodu () 100 mL'lik bir beher (kaplama banyosu içinde 50 g NaCI / 90 ml 1 M HCI) kaplama çözeltisi hazırlandı ve kesme (~ platin 10 cm uzunluğunda (Pt) tel (~ 0.02" çapında)).
- (0.008" çıplak) Teflon kaplı gümüş tel 15 cm uzunluğunda bir parça ve gümüş tel ucunun her bir ucundan Teflon kaplama yaklaşık 1 cm kazımak için bir tıraş bıçağı kullanma - 10 kesilir.
- bir ucunda bir altın pimini lehimleyiniz ve kaplama banyoya maruz gümüş telin bir ucunu yerleştirin.
- (~ 9 bir çıkışı olan tek bir DC adaptör. - 15 VDC max) bir DC adaptörü kullanılarak,altın pim tarafında hazırlanan bir gümüş tel (referans elektrodu) için "kırmızı" (+) kablolarımn. (-) Pt banyo katoda tel "siyah" kelepçe.
- DC adaptörü takın. Doğru kaplama işlemi için bakın - kabarcıklar banyo elektrotta görünmelidir; Referans elektrot, bir gümüş / gri bir renk alır.
DİKKAT: Olası açmayın [Siyah (-) Kırmızı (+) vs] - Bu durumda ve taze kaplama çözümü yapılması gerekir eğer kaplama banyosundan harap olacak. Kötü bir çözüm renkte sarı dönecek: KULLANMAYIN!
Not: Kaplama Reaksiyon 2-5 dakika genellikle alır: Ag 0 + CI - → AgCİ + e - - Referans elektrodu test edin.
- 200 mV DC ayarı - 100 multimetre ayarlayın.
- Yeni kaplama referans elektroduna karşı referansı 3 M NaCI elektrot ve test (yani, çalışma bilinen önceden test edilmiş elektrottur) bir gösterge yerleştirin.
NOT: Bizim iseyeni bir referans elektrot, ing (12 saat önerilir) kullanılmadan önce 3 M NaCl ile ıslatın. - Referans elektrodunun altın pim üzerine "kırmızı" (+) öne yerleştirin test edilecek. (-) karşılaştırma elektrot kanattan "siyah" koyun. Kabul edilebilir bir okuma aralığı ± 10 mV olur. 0 mV 2 referans elektrotlar boyunca idealdir.
MEA Recordings için 6. Genel Hayvan Cerrahi
- Ameliyat için hazırlık
- Önceki gece dezenfektan içinde cerrahi aletler yerleştirin.
- dezenfektan aletleri çıkarın ve iyice durulayın ve steril cerrahi pad üzerinde araçları yerleştirin. bir ısıtma yastığı elde edin.
- iki elektrot kalibre ve prosedürler 3 ve 4 de tarif edildiği gibi mikropipet ekleyin.
- Bölüm 5'te tarif edildiği gibi, referans elektrotu olun.
- 200 uM glutamat ve 70 mM KCI olun. Tablo 1'e bakınız.
- hayvan Edinme ve cerrahi yaprak üzerindeki ağırlığını kaydedin.
- anestezi hazırlayın ve ısıtma yastığı açın.
- MEA ameliyatı gerçekleştirin
- solunum hızı önemli ölçüde azalmıştır ve hayvan ayak veya kuyruk tutam yanıt vermez kadar izofluran (oksijen içinde% 4 akımı) kullanılarak, bir indüksiyon odasında hayvan anestetize. Telaffuz solunum hızı ve vücut sıcaklığı, her 15 dk.
- kafa stabilize etmek için kulak çubukları kullanılarak steryotaksik bir cihazla hayvan yerleştirin. Hayvan güvenlidir ve kafa hareket etmez emin olun. oksijen içinde% 3 - 1.5 izofluran akış aşağı indirin. ısıtma yastığı doğru hayvan altına yerleştirilmiş ve ek ısı temin etmek üzere 37 ° C'ye ayarlanmış olduğundan emin olun. Tamamlayıcı ısı sağlanamaması derin hipotermi ve hayvanın erken ölüm ile sonuçlanabilir.
- steril pamuklu bir aplikatör kullanılarak göz merhemi sürün ve solunum hızı kayıt vevücut ısısı. Bir pilli düzeltici kullanarak, başın üst tıraş. kulaklara yakın kürk çıkarmak için küçük bir cerrahi makas kullanın.
- Bu noktada, steril cerrahi eldiven taktı. kafa derisi alkol ardından iyot ve (üç kez) uygulayın.
- Bir neşter kullanılarak, düz kafa derisi ortasında aşağı bir kesi yapmak ve boğa köpek kelepçeler kullanarak cilt yayıldı. herhangi bir kan emmek için steril bir pamuk ucu al. bregma ve lambda görünümünü sağlamak için, hidrojen peroksit kullanarak.
- başlığı düzgün D / V ve bregma ve lambda M / L koordinat ölçümü ile yerleştirilmiş olduğunu kontrol edin. kafa düz bir düzlem üzerinde ise koordinat değişiklikler sıfır olmalıdır. bir düzleme sağlamak için gerekli kafa ve kulak çubukları ayarlayın.
- bregma bulun ve koordinatları sıfır. İstenilen koordinatları kullanarak, sol ve sağ taşımak ve kalıcı bir kalem kullanarak bir işareti yapmak. Bir cauterizer / işaretleyici kullanarak ulaşmak için yeterli oda işareti etrafında büyük bir kare yapmakistenen bölgesi.
- Steril bir döner aracını kullanarak, kare işareti etrafında delin. steril pamuklu bir aplikatör kullanılarak bir kan ıslatın. Her kullanımdan için matkap ucu önce dezenfekte.
- headstage MEA takın ve burada arzu edilen birinci çözelti ile pipet dolgu. atılmanın çözüm incelenebilir böylece çözüm olmadan pipet boşluk bırakmayacak emin olun. cam mikropipet için boru takın.
- nitrojen tankı ve basınçlı ejektör (psi = 5, zaman = 0.6 ler) açın. pipet sağlamak için Test (basın manuel kırmızı düğme) başlangıcından önce tıkanmış değildir.
- Mikropipet kalibre edin. retikül üzerinde 0'dan başlamalı ve başlangıç noktasını belirtmek için headstage mavi bir parça bant yerleştirin. Dijital okuyucu açın ve sıfıra sıfırlayın. aşağı 1 mm (DV) git ve çözelti retikülün üzerinde taşınmıştır kenelerin sayısı. 10 kene 1 mm (1 mm = 250 nL), yani 1 kene = 25 nL eşit olmalıdır.
- bir referans elektrotu yerleştirildiBu devrenin tamamlanması için beyin sıvı hala temas içinde olduğu şekilde MEA uzak konum.
- bağlı MEA ile bregma Bul ve dijital okuyucu sıfır. İstenen koordinatlara MEA getirin. ucu beyin dokunana kadar yavaşça MEA indirin. Sıfır DV koordinat yavaşça beyin içine MEA indirin.
- kayıt programında, istenen kalibre elektrot üzerine tıklayın ve ardından "Experiment gerçekleştirin." Hayvan anestezi edilirken Sistem daha sonra ilgilenilen analit için tonik seviyelerinin kaydetmeye başlayacaktır.
- 45 dakika - bir temel gözlem yardımcı ve 20 taban elektrodu sağlayacak bir eksene büyüt.
- bazal istikrarlı sonra, 0,6 s ve 5 psi basınç ejektör ayarlamak ve çıkarma basınçlı ejektör kırmızı düğmeye basın. Enjeksiyon tabakanın (Şekil 2) üzerinde hareket süresi ve yüksek basıncın oluşmasını hem de hacim / keneler kaydedin. Yani (gerekli herhangi bir not MakeDaha büyük zirveler, seyreltme etkisi, tıkanmış pipet, gürültülü bazal / o-kapsam).
- enjeksiyonlar arasında 5 dakika - glutamat enjeksiyonlar için, 3 bekleyin. enjeksiyonlar arasında 2 dakika - KCI için enjeksiyonlar 1 bekleyin. Aynı basınç ve zaman en az 3 kez kullanılarak enjekte edilir. zamanını değiştirin ve tekrarlayın. Mikropipet tıkanmış sürece basıncını değiştirmeye çalışın.
- Mikropipet tıkanmış ise, 30 psi basınç kadar artar.
- İstenen beyin bölgelerinde Kayıt, farklı yöntemler kullanarak beynin her iki tarafta tekrar etmek. 20 dakika boyunca her yeni bölgesinde bir temel kaydedin.
- Ekli mikropipet ile MEA al DI suyla yıkayın ve tüm kan bitene kadar gece boyunca PBS ile ıslatın.
- hayvan euthanize ve -80 ° C dondurucu içinde bir önceden etiketlenmiş tüp ve deposunda beyinlerine veya sabitleme için bir tarafı tutun. izofluran (inhalasyon) ile hayvan, doz aşımı euthanize için. cerrahi makas kullanılarak başının kesilmesini gerçekleştirin ve istenilen bölgeleri teşrih.
7. Temizleme Kaplı ÇÇA'lar sonra kullanın
- değil temiz ÇÇA kullanılmayan eğer yapın. tiftik veya toz yüzeyi üzerinde, metanol ile temiz ve kaplamadan önce, 24 saat boyunca kurumaya bırakın ise.
- Su banyosuna (80 ° C) açın ve 30 dakika boyunca MEA ucu bekletin. Dikkatli bir şekilde pamuk ile elektrot ucu elektrot ucu üzerinde bırakılabilir herhangi bir kirin çıkarılması için aplikatör uçlu silin. Islak MEA siyah "yalıtım kısmı" gelmesin.
- Üç farklı sonikatörler kullanarak, 5 dakika boyunca (1) Citrisolv, ticari bir çözücü madde ve temizleme maddesi (2) izopropil olarak MEA ucu, ve (3) distile su ıslatın. Dikkatli bir şekilde pamuk ile elektrot ucu elektrot ucu üzerinde bırakılabilir herhangi bir kirin çıkarılması için aplikatör uçlu silin.
- Katmanlar başarıyla kaldırıldı sağlamak için bir mikroskop altında ipuçlarını inceleyin.
8. Analiz
- Verileri analiz etmek için,İlk bitmiş deney çift tıklayarak ve dosya açılır menüden "ihracat verilerini" seçerek istediğiniz denemeyi ihracat.
- İstenen dosya konumu için bu verileri kaydetmek ve analiz programı açın. Analiz programında "açmak" ı tıklayın ve son kaydedilen dosyayı seçin.
- programı dosya yüklemek ve daha sonra olay işaretleri sekmesi altında deneyi kontrol etmek için birkaç dakikanızı verin. çıkış altında, istenen parametreler kutularını işaretleyin. Örneğin, bazal, amplitüd (eğri altındaki alan) pik alanı, T yükselişi ve T 80 için.
- yenile seçeneğini tıklayın ve sonra (bu işlem birkaç dakika sürebilir) bir elektronik tabloya veri vermek için analiz edin. Program istediğiniz konuma dosyayı kaydetmek için bir istem verecektir. kaydettikten sonra, dosyanın bir elektronik tabloda düzenlenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu teknoloji böyle travmatik beyin hasarı, yaşlanma, stres ve epilepsi gibi hayvan modellerinde, birçok çeşit sinyal glutamaterjik değişiklikleri ölçmek için kullanılabilecek olsa da, burada MEA teknolojisi transgenik fare modelinde glutamaterjik değişiklikleri incelemek için nasıl kullanılabileceğini göstermek insan tauopati 19, 20. RTG (TauP301L) 4510 fare kromozom 17 ile bağlantılı fronto-temporal demans ve parkinsonizm ile bağlantılı tau P301L mutasyonu ifade eder ve yaygın olarak Alzheimer hastalığı, nörodejeneratif taupatiler ve frontotemporal demans ile bağlantılı tau patolojisinin incelemek için kullanılır. Ayrıca glutamaterjik sinyal farmakolojik müdahale tarafından değiştirilebilir göstermektedir. Biz riluzol ile TauP301L ile tedavi edilen farelerin, amyotrofik lateral skleroz (ALS), bir FDA tarafından onaylanmış bir hastalık-modifiye edici madde stabilize glutamaterjik sinyal modüleBöylece artan glutamin topu 30, 31, 32, 33 giden, glutamat salınımında bir azalma ve glutamat taşıyıcı ekspresyonundaki bir artışı ile glutamat alımının güçlendirdikleri yol açan, voltaj-bağımlı sodyum kanalının durumunu inaktive.
Dört nedenden dolayı gösterim amaçlı bu özel veri kümesini seçtiniz. İlk olarak, bu veri kümesi geçici serbest bırakılması ve glutamat alımını hızlı dinamiklerini ölçmek için yeteneğimizi gösterdiği gibi, sistemin zamansal çözünürlüğe göstermektedir. Buna ek olarak, bu klinik öncesi hayvan modeli, her bir ölçü değişikliklerin bir örnek için izin tonik glutamat glutamat salınmasını ve glutamat klirensi değişimleri sergilemektedir. İkincisi, bu veri kümesi, DG, CA3, a içinde bir alt bölge farklılıklarının ölçümü için izin verir yüksek uzaysal çözünürlüğü kullanannd hipokampusun CA1 gösterilmiştir. Üçüncü olarak, bu veri klinik öncesi hayvan modellerinde gözlenen glutamaterjik değişiklikleri azaltmak için nasıl kullanılabileceğini farmakolojik müdahale gösteri için izin verir. Bu klinik öncesi model, glutamat sürümde değişiklikler olduğundan Nihayet, değişmiş glutamat salınımı varlığında glutamat boşluk dikkatli yorumlanması ihtiyacı açıklanabilir.
<0.004 nA / eğim dak.'dan ile gösterildiği gibi, bir kararlı taban çizgisine yeniden ulaştıktan sonra (10-20 dakika), ilk 10 saniye önce çözeltilerin herhangi bir uygulama için fazla hücre dışı glutamat seviyelerinin ortalaması ile tonik glutamat seviyeleri (uM) ölçüldü. Biz TauP301L farelerin CA3 ve CA1 bölgesinde tonik glutamat seviyelerinde bir artış gözlemledik ve riluzol kontrol (Şekil 3A), bu tonik glutamat seviyeleri restore edilmiştir. Daha sonra, KCI lokal bir hemisph üç alt-bölgelerin her birine (mikropipet ile) verildi3 dk - her 2 ere. Bozulmamış bir glutamat sinir sistemi 34 göstergesidir 10 tekrarlanabilir sinyalleri, sonra, sonuçlar kıyasla her bir grup ve ortalama genliği ortalaması alındı. Örnek izleri (Şekil 3B), riluzol işlemi (Şekil 3C) tarafından kurtarıldı bir etki (sadece CA3 gösterilmiştir) her üç alt bölgelerinde KCI uygulanmasından sonra TauP301L farelerde glutamate salımını açığa çıkarmıştır.
MEA sonra ters yarımkürede taşındı ve istikrarlı bir temel ulaşmaya bırakıldı - eksojen glutamat glutamat açıklığını (Şekil 4) incelemek için uygulanmadan önce (10 ila 20 dakika). Değişen miktarlar glutamat alımının bir ölçüsü olarak kullanılmıştır, eğri (AUC) altında 3 dakika, net alanı - - 200 uM steril filtre edilmiş glutamat çözeltisinin (50 ila 250 nL) hücre dışı boşluğa her 2 uygulanmıştır. t içine Bu glutamat hızlı uygulamaHe hücre dışı uzay endojen glutamat salınımı ve glutamat alımını ölçüm taklit sağlar. Glutamat taşıyıcıları sergilerler Michaelis-Menten 35 kinetiği için, hacim bir dizi - eksojen glutamat (50 ila 250 nL) alımından farklılıkları ortaya çıkarmak için enjekte edilir. 250 nL aralığında - 50 içinde 50 nL artışlarla 2 enjeksiyonu - Bunu yapmak için, her bir hayvan 1 değeri verilir. Bir bölge için grup başına enjekte edilen hacim alım ile ilgilidir 0.05 düzeyinde net AUC sağlamak için en iyi yol p ≤ istatistiksel olarak farklı değildir ve glutamat olmayan miktarda uygulandığı veya difüzyon onaylamak zaman gerekir rağmen, sağlamaktır hem amplitüd (Şekil 4A) ve T artış (Şekil 4B'de MEA için nokta kaynak (mikropipet) difüzyon bir ölçüsü) 10, 11, 19, 20, bir farklılık yoktur. Bu allows, net AUC farklılıkları nedeniyle uygulanan miktar veya difüzyon alımında olup farklılıklara olduğu varsayılır şekilde "zirve eşleştirme" genlikleri (Şekil 4C) için. hayvanlar glutamat sürümde mevcut farklılıkları olduğunda Tepe eşleştirme özellikle önemlidir. Ciltlik bir dizi enjekte edildiğinden, hem genliği ve T yükselişi için varyans genellikle büyük ve tasarımı doğasında olduğu gibi, bu önlemlerin ilişkin varyansı azalmaz ek hayvanları ekleyerek vardır. Genlik ve T yükselişi her alt-bölge (Şekil 4A, 4B) gruplar arasında benzer olduğu için, biz net AUC (Şekil 4C, 4D) farklılıklar glutamat alımında farklılıkları nedeniyle olduğunu varsayalım. Riluzole her üç alt bölgelere (Şekil 4D) kontrollere göre glutamat açıklık düzeldi. Son olarak, ekli bir mikropipet ile bir MEA lokal kesit beynin sonra MEA yerleştirme teyit etmek için bir boya uygulamak için kullanılır, Şekil 3D'de gösterildiği gibi.
Bu veriler, MEA teknolojisi sadece nöronal devreler 28, 29 büyük örnek alanlarında kaydedilmiş ve genellikle hasarlı önceki tekniklere (ör mikrodiyaliz), farklı olarak, hipokampus 24, 25 küçük içinde alt nörotransmitter salımını ölçme yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, ÇÇA'lar glutamat salınımı ve boşluk 25 hızlı kinetik ölçmek için yüksek zamansal çözünürlüğe bize.
Şekil 1: Glutamat Oksidaz Sitede Akım (pA) 'de Değişiklik Ölçme bir Kendine referans mikroelektrot Vitro Kalibrasyon (GluOx; kırmızı) ise karşı bir Sentinel Sitesi (Gönderilen; mavi). karışanlardan askorbik asit (AA: 250 uM) ve dopamin (DA: 2 uM) glutamat oksidaz ya da şahit siteleri ya en akımı değiştirmemiştir. (Glu: 20, 40, 60 uM) glutamat ilavesi glutamat oksidaz tesisinde aşamalı akım artışı, ancak koruyucu sitesinde hiçbir değişiklik yaratmadı. Hidrojen peroksit (H2O 2: 8.8 uM) her iki bölgeden mevcut bir artışa neden oldu. Duyarlılık, eğim, duyarlılık sınırı ve R2 değerleri kalibrasyondan sonra hesaplandı. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. Örnek Elektrokimya Çalışma. Bu çalışma, enjeksiyon ya da püskürtme numarası (SAAT / TTL) arasında bir süre için sütun, beyin koordinatları (AP, ml, DV) içeriruygulanan basıncın miktarı (nitrojen), basınç (zaman) uzunluğu ve basınçlı ejektör ile enjekte edilen hacim. Bu tür tek sinyalleri veya mikropipet tıkanması gibi herhangi bir notlar notlar sütununda kaydedilmelidir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3. Hücre dışı tonik ve potasyum klorür (KCl) Hippocampus DG, CA3 ve CA1 Bölgelerde Glutamat -evoked Yayın. Hipokampus, tonik glutamat düzeyleri CA3 ve CA1 bölgeleri (A) önemli ölçüde, araçla tedavi edilen TauP301L fareleri (Veh-TauP301L) içerisinde riluzol işlenerek zayıflatılmış bir etki artmıştır. (B) CA3 KCI uyarılmış glutamat serbest bazal eşleştirilmiş temsili kayıtları r gösterdi iluzole işlem (Ril-TauP301L) Veh-TauP301L farelerde gözlenen glutamat salım genliğinde anlamlı bir artış azaltmıştır. KCl Yerel uygulama (↑) hızla tonik seviyelere döndü hücre dışı glutamat büyük bir artışa üretti. KCI lokal uygulaması, riluzol, tedaviden zayıflatılmış sonra (C), anlamlı DG, CA3 Veh-TauP301L farelerde gözlenen KCI uyarılmış glutamat salınmasını artış, ve CA1. ** p <.01 Veh Kontrol Veh-TauP301L vs, # p <.05 Ril-Tau-; (D) kresil moru ile boyanmış hipokampus 20 um bölümü CA3 ve CA1 MEA parça konumunu gösterir (ortalama ± SEM P301L Veh-TauP301L vs, ## Veh-TauP301L karşı p <.01 Ril-TauP301L n = 14-19 / grup). Bu şekil, John Wiley and Sons 19, 20 izniyle.rYer = "_ blank"> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.
Hippocampus DG, CA3 ve CA1 Bölgelerde Ekzojen Glutamat Uygulama Sonrasında Şekil 4. Glutamat alımı. (A), lokal olarak uygulanan glutamat sinyalinin genliği, her bölgedeki gruplar arasında benzerdi. (B) T bir artış, mikropipet glutamat difüzyonun bir göstergesi, her bölgedeki gruplar arasında benzerdi. (C), yerel Veh-Kontrollerdeki glutamat uygulaması, Veh-TauP301L ve Ril-TauP301L farelerden CA3 Örnek glutamat sinyaller. (D) Riluzol tedavi riluzol ile muamele edilmiş T geliştirilmiş glutamat alımını gösteren, hipokampus 3 bölgelerinde Veh-TauP301L farelerde gözlenen eğrisi (AUC) altındaki ağ bölgesinde önemli artışlar azaltılabilirauP301L fareleri (ortalama ± SEM; Veh- vs * p <Veh-TauP301L genel .05 Veh Kontrol, ** p <.01 Veh Kontrol Veh-TauP301L vs, # p <.05 Ril-TauP301L TauP301L, ## p Veh-TauP301L vs <.01 Ril-TauP301L n = 13-15 / grup). Bu şekil, John Wiley and Sons 20 izniyle edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
| 0.05 M PBS | 2 L'lik DI su: |
| cam beher içinde deposu kalay folyo ile kaplanır. Gerekirse, KOH ile pH 7.4'e getirmek. | NaH2 4 · H2O: 2.8 g Na2 HPO 4: 11.34 g Sodyum Klorür: 11.68 gr |
| 20 mM askorbik asit 50 ml DI su: | |
| her gün taze olun. | Askorbik asit: 0.18 g |
| 20 mM L-glutamat | 50 ml DI su: |
| her hafta taze olun. | L-glutamat monosodyum tuzu hidrat: 0.15 g |
| 2 mM Dopamin | Dopamin hidroklorid: 0.038 g |
| Taze Aylık'ı olun. | 0.1 M perklorik asit: 10 ml DI su ile 100 mL'ye hacmi getirmek |
| 8.8 mM hidrojen peroksit | 50 ml DI su: |
| her hafta taze olun. | Hidrojen peroksit: 500 uL |
| 70 mM potasyum klorid | 100 ml DI su: |
| Deneyin taze gün yapın. | Potasyum klorür: 0.08 g Sodyum klorür: 0.07 g Kalsiyum Klorür: 0.004 g |
| 200 μM Glutamat | 20 mM glutamat: 100 uL |
| Deneyin taze gün yapın. | Steril tuzlu su: 10 mL |
Tablo 1: Kalibrasyon çözümleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MEA tekniği, in vitro ve in vivo olarak nörotransmitter salımının ve alımının hızlı kinetik ölçümü sağlar. Bu nedenle, teknik tonik nörotransmitter düzeyleri de dahil olmak üzere veri çıkışı, uyarılmış nörotransmiter salımı ve sinir ileticisi temizlenmesinin bir çok çeşitli üretir. ÇÇA kullanımı nispeten karmaşık bir işlemdir Ancak, başarılı kullanım için optimize edilmesi gerekebilir sayısız faktörler vardır. Örneğin, kalibrasyon sırasında, tek bir sinyal dalga formu (osiloskop ekranı) veya stimülasyon yanıtlar az ya da mevcut olmaması olduğuna dikkat edilebilir. Olası bir sistem kayıt sistemini yeniden başlatmayı arıza, ya da bilgisayara bağlı, sorunu çözebilir. Ayrıca, sorun bir bağlantı hatası olabilir. kalibre önce, MEA ve referans elektrotu bağlantılarının düzgün şekilde tekrar kontrol uygun olduğunu. headstage DIP soket yerine MEA bağlantı sorunları çözülebilir.MEA çözelti içinde tamamen değil veya kötü bakılan bir referans elektrot kullanılır, bunlar da kalibrasyon sırasında kayıt müdahale edebilir. Kalibrasyon sırasında yavaşlamış sinyal tepkileri gerekli BSA / glutaraldehit karışımı ya da bir yavaş dönen bir karıştırma çubuğuna göre daha kalın bir sonucu olabilir bir ortak bir sorun vardır. Karışanlardan kalibrasyon sırasında bir sinyal veriyoruz halinde, bu galvanik bir hata olduğunu mümkündür MPD dışlama katmanını (örn yeterince uzun electroplate etmedi). Böyle bir durumda, elektro tekrarlarken gereklidir.
Ameliyat sırasında, bir anestezik düzeyi, tüm fareler için yeterli olmayabilir; Bazı fareler "batmak" için anestezi yüksek düzeyde gerektirebilir ve bazı farelerin daha az gerektirebilir. Anestezi düşük bir düzeyde başlayıp yavaş yavaş fare hafif anestezi altında olduğu kadar yükseltmek için gereklidir. Fare stereotaksik cihazda bir kez Derin anestezi test edilebilirKuyruk veya ayak tutam. MEA yerleştirilmesi için koordinatları seçerken, aynı zamanda pek çok nörodejeneratif hayvan modellerinde 36, 37, 38 oluşabilir olası beyin atrofi için dikkat etmek önemlidir ve doğrudur. Buna ek olarak, bu MEA kayıt özelliklerini etkileyen ve yavaş zamansal çözünürlüğü ya da büyük ölçüde en aza sinyal yanıtlarına neden olabilir kan, MEA birikmemesi ameliyat sırasında zorunludur. Kan pıhtıları elektrot etrafında, basitçe MEA çıkarın ve tuz ile durulayın.
Kayıt sırasında, meydana gelebilir en yaygın sorunlardan biri olduğunu gürültülü sinyalin olduğunu. Bu tür yardımcı aydınlatma, ilave aletler ve matkap gibi diğer elektronik cihazlar, parazit çoğunlukla esas nedenidir, bu nedenle kayıt sistemi ile aynı elektrik devresi ve / veya çıkış takarak önlemek için en iyisidir. Ayrıca, kayıt sys eğertem bir kayıt sisteminin osiloskop salınımların yanı sıra tüm sitelerden kaynaklanan gürültü ve sadece kayıt sitelerini gözlemleyecek, düzgün topraklanmazsa. kayıt sistemi altında önerilen topraklama mat bu sorunları önlemek için topraklı boruya bağlanması gerekir. bunların hiçbirisi hatası olduğu tespit edilirse, hata referans elektrot veya MEA kendisi ile uzanabilir. sisteminin çalışmasını doğrulamak için yeni ve kullanılmamış MEA kullanarak, gürültü sorunlarıyla karşılaşmaksızın zaman yararlı bir sorun giderme yaklaşım olabilir. kesme ya da hiç değişiklik referans elektrotu değiştirilmesi durumunda, referans elektrotu ya da yarı-hücre arızalı olabilir. Referans elektrodu değiştirilmesi sorunu çözmek için tek yol olabilir. Kayıt tamamlandıktan sonra, MEA nihai faydası temizlemek ve onları yeniden yeteneğidir. Taraflı çevre sürece MEA kalibrasyon sırasında yeterince gerçekleştirmek için devam ettiği yaklaşık olarak üç kez yeniden kullanılabilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
GG bu çalışmada glutamat ölçümler için kullanılan FAST-16 kayıt sistemi yapar Quanteon, LLC'nin tek sahibi olduğunu. JEQ Quanteon için ödenen sürdürmektedir.
Acknowledgments
(; U54GM104942 mnr), NIA (mnr; R15AG045812), Alzheimer Derneği (MNR'nin; NIRG-12-242187), SUV Fakültesi Araştırma Senato Grant (mnr) ve SUV PSCOR Grant Bu çalışma, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından desteklendi (MNR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
| Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
| Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
| Hamilton Syringes | Hamilton | #80383 | 2 syringes |
| Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
| m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
| Battery-powered Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
| Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
| Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
| Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
| Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
| Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
| Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
| Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
| Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
| Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
| Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| Silver wire | AM systems | #786500 | |
| Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
| Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
| Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
| Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
| Drill | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
| Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
| Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
| Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
| Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |
References
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
- Montgomery, A. J., Lingford-Hughes, A. R., Egerton, A., Nutt, D. J., Grasby, P. M. The effect of nicotine on striatal dopamine release in man: A [11C]raclopride PET study. Synapse. 61 (8), 637-645 (2007).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 7 Unit 7.1 (2009).
- Hu, S., Sheng, W. S., Ehrlich, L. C., Peterson, P. K., Chao, C. C. Cytokine effects on glutamate uptake by human astrocytes. Neuroimmunomodulation. 7 (3), 153-159 (2000).
- He, X., et al. The association between CCL2 polymorphisms and drug-resistant epilepsy in Chinese children. Epileptic Disord. 15 (3), 272-277 (2013).
- Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
- Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
- Hefendehl, J. K., et al. Mapping synaptic glutamate transporter dysfunction in vivo to regions surrounding Abeta plaques by iGluSnFR two-photon imaging. Nat Commun. 7, 13441 (2016).
- Hinzman, J. M., Thomas, T. C., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Disruptions in the regulation of extracellular glutamate by neurons and glia in the rat striatum two days after diffuse brain injury. J Neurotrauma. 29 (6), 1197-1208 (2012).
- Thomas, T. C., Hinzman, J. M., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Hypersensitive glutamate signaling correlates with the development of late-onset behavioral morbidity in diffuse brain-injured circuitry. J Neurotrauma. 29 (2), Epub 2011 Dec 2011 187-200 (2011).
- Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
- Stephens, M. L., Quintero, J. E., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Age-related changes in glutamate release in the CA3 and dentate gyrus of the rat hippocampus. Neurobiol Aging. 32 (5), Epub 2009 Jun 2017 811-820 (2009).
- Nickell, J., Salvatore, M. F., Pomerleau, F., Apparsundaram, S., Gerhardt, G. A. Reduced plasma membrane surface expression of GLAST mediates decreased glutamate regulation in the aged striatum. Neurobiol Aging. 28 (11), 1737-1748 (2006).
- Hascup, E. R., et al. An allosteric modulator of metabotropic glutamate receptors (mGluR(2) ) (+)-TFMPIP, inhibits restraint stress-induced phasic glutamate release in rat prefrontal cortex. J Neurochem. 122 (2), Epub 02012 Jun 07713 619-627 (2012).
- Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Stromberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
- Matveeva, E. A., et al. Reduction of vesicle-associated membrane protein 2 expression leads to a kindling-resistant phenotype in a murine model of epilepsy. Neuroscience. 202, Epub 2011 Dec 2013 77-86 (2011).
- Matveeva, E. A., et al. Kindling-induced asymmetric accumulation of hippocampal 7S SNARE complexes correlates with enhanced glutamate release. Epilepsia. 53 (1), Epub 02011 Dec 0334 157-167 (2012).
- Hunsberger, H. C., Rudy, C. C., Batten, S. R., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. P301L tau expression affects glutamate release and clearance in the hippocampal trisynaptic pathway. J Neurochem. 132 (2), 169-182 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Riluzole rescues glutamate alterations, cognitive deficits, and tau pathology associated with P301L tau expression. J Neurochem. 135 (2), 381-394 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Peripherally restricted viral challenge elevates extracellular glutamate and enhances synaptic transmission in the hippocampus. J Neurochem. , (2016).
- Obrenovitch, T. P., Urenjak, J., Zilkha, E., Jay, T. M. Excitotoxicity in neurological disorders--the glutamate paradox. Int J Dev Neurosci. 18 (2-3), 281-287 (2000).
- Hillered, L., Vespa, P. M., Hovda, D. A. Translational neurochemical research in acute human brain injury: the current status and potential future for cerebral microdialysis. J Neurotrauma. 22 (1), 3-41 (2005).
- Burmeister, J. J., Gerhardt, G. A. Self-referencing ceramic-based multisite microelectrodes for the detection and elimination of interferences from the measurement of L-glutamate and other analytes. Anal Chem. 73 (5), 1037-1042 (2001).
- Burmeister, J. J., et al. Improved ceramic-based multisite microelectrode for rapid measurements of L-glutamate in the CNS. J Neurosci Methods. 119 (2), 163-171 (2002).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J Neurosci. 25 (11), 2906-2916 (2005).
- Greene, J. G., Borges, K., Dingledine, R. Quantitative transcriptional neuroanatomy of the rat hippocampus: evidence for wide-ranging, pathway-specific heterogeneity among three principal cell layers. Hippocampus. 19 (3), 253-264 (2009).
- Borland, L. M., Shi, G., Yang, H., Michael, A. C. Voltammetric study of extracellular dopamine near microdialysis probes acutely implanted in the striatum of the anesthetized rat. J Neurosci Methods. 146 (2), Epub 2005 Mar 2005 149-158 (2005).
- Jaquins-Gerstl, A., Michael, A. C. Comparison of the brain penetration injury associated with microdialysis and voltammetry. J Neurosci Methods. 183 (2), Epub 2009 Jun 2025 127-135 (2009).
- Azbill, R. D., Mu, X., Springer, J. E. Riluzole increases high-affinity glutamate uptake in rat spinal cord synaptosomes. Brain Res. 871 (2), 175-180 (2000).
- Gourley, S. L., Espitia, J. W., Sanacora, G., Taylor, J. R. Antidepressant-like properties of oral riluzole and utility of incentive disengagement models of depression in mice. Psychopharmacology (Berl). 219 (3), Epub 2011 Jul 2021 805-814 (2011).
- Frizzo, M. E., Dall'Onder, L. P., Dalcin, K. B., Souza, D. O. Riluzole enhances glutamate uptake in rat astrocyte cultures). Cell Mol Neurobiol. 24 (1), 123-128 (2004).
- Fumagalli, E., Funicello, M., Rauen, T., Gobbi, M., Mennini, T. Riluzole enhances the activity of glutamate transporters GLAST, GLT1 and EAAC1. Eur J Pharmacol. 578 (2-3), Epub 2007 Oct 2025 171-176 (2008).
- Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), Epub 2006 Jan 1625 1626-1635 (2006).
- Kane, R. L., Martinez-Lopez, I., DeJoseph, M. R., Vina, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
- Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). J Neurosci. 25 (46), 10637-10647 (2005).
- Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
- Zang, D. W., et al. Magnetic resonance imaging reveals neuronal degeneration in the brainstem of the superoxide dismutase 1 transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 20 (7), 1745-1751 (2004).
