Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

إنشاء الأنسجة القلبية عرض التكامل الميكانيكي للكروية باستخدام بيوبرينتينغ 3D

Published: July 2, 2017 doi: 10.3791/55438
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1, 1, 2, 1, 1, 3, 2, 1
1Division of Cardiac Surgery, Johns Hopkins Hospital, 2Division of Cardiology, Johns Hopkins Hospital, 3Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University

Summary

يصف هذا البروتوكول بيوبرينتينغ 3D من الأنسجة القلبية دون استخدام المواد الحيوية. 3D بيوبرينتد بقع القلب المعرض التكامل الميكانيكي من الكروية عنصر واعدة للغاية في تجديد الأنسجة القلب ونماذج 3D من أمراض القلب.

Abstract

يصف هذا البروتوكول بيوبرينتينغ 3D من أنسجة القلب دون استخدام المواد الحيوية، وذلك باستخدام الخلايا فقط. يتم عزل الخلايا العضلية، الخلايا البطانية والألياف الليفية أولا، عد ومختلطة في نسب الخلايا المطلوبة. انهم شارك في تربيتها في الآبار الفردية في منخفضة للغاية مرفق 96 لوحات جيدا. في غضون 3 أيام، ضرب الكروية شكل. ثم يتم التقاط هذه الكروية عن طريق فوهة باستخدام شفط فراغ وتجميعها على مجموعة إبرة باستخدام بيوبرينتر 3D. ثم يتم السماح الكروية ل فتيل على مجموعة إبرة. بعد ثلاثة أيام من بيوبرينتينغ 3D، يتم إزالة الكروية باعتبارها التصحيح سليمة، الذي هو بالفعل ضرب تلقائيا. 3D بيوبرينتد بقع القلب المعرض التكامل الميكانيكي من الكروية عنصر واعدة للغاية في تجديد الأنسجة القلب ونماذج 3D من أمراض القلب.

Introduction

هناك العديد من أساليب مختلفة من بيوبرينتينغ 3D 1 ، 2 ، 3 . غالبا ما تصنف بيوبرينتينغ 3D بواسطة تكنولوجيا الطباعة 1 ، مع أمثلة مثل بيوبرينتينغ النافثة للحبر، بيوبرينتينغ ميكروكروسيون، بيوبرينتينغ بمساعدة الليزر، مزيج من الأساليب، أو نهج أحدث. ويمكن أيضا أن تصنف بيوبرينتينغ 3D في السقالات خالية أو السقالات تعتمد على الطرق 4 . معظم أساليب بيوبرينتينغ 3D تعتمد على سقالة، حيث هناك حاجة للمواد الحيوية، على سبيل المثال بيوينكس 5 أو السقالات 6 . ومع ذلك، بيوبرينتينغ 3D تعتمد سقالة تواجه العديد من القضايا والقيود 4 ، 7 ، مثل إمونوجينيسيتي من المواد السقالات، وتكلفة بيوينكس الملكية، وسرعة بطيئة وسمية من منتجات التحلل.

المجلس العسكريوقد تم محاولة خالية من أضعاف هندسة الأنسجة القلبية باستخدام الكروية 8 ، مع القدرة على التغلب على هذه العيوب هندسة النسيج تعتمد سقالة. ومع ذلك، وكما اعترف المؤلفون في تلك الورقة، كان من الصعب التعامل بقوة مع وضع الكروية في مواقع ثابتة، في عملية التصنيع البيولوجي. استخدام ما يصاحب ذلك من بيوبرينتينغ 3D وهندسة الأنسجة القائمة على كروي لديه القدرة على التغلب على هذه الصعوبات. في هذا البروتوكول، ونحن تصف بيوبرينتينغ 3D من أنسجة القلب دون غيرها من المواد الحيوية، وذلك باستخدام الخلايا فقط في شكل الكروية.

السقالات خالية من كروية 3D بيوبرينترس 3D لديها القدرة على التقاط الكروية الفردية باستخدام شفط فراغ ووضعها على مجموعة إبرة. مفهوم المواقع الكروية على مجموعة إبرة في بيوبرينتينغ 3D، مستوحاة من استخدام صفائف الإبرة (المعروفة باسم " كنزان ") في جابا القديمةنيس، طريقة، بسبب، أزهر، الترتيب، إيكيبانا. يسمح هذا النظام الكروية أن تكون على وجه التحديد في أي تكوين والنتائج في الكروية الفردية دمج معا على مدى فترة قصيرة لخلق الأنسجة بيوبرينتد 3D. وهكذا يسمح هذا الأسلوب الكروية أن التلاعب بكل سهولة، مع الآثار المحتملة على مستقبل بيوفابريكاتيون العضو خالية من سقالة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد كارديوميوسيتس

  1. توليد وثقافة الخلايا الجذعية المحفزة البشرية (هيبسس) على لوحات 6 جيدا المغلفة مع مصفوفة الغشاء القاعدي كما هو موضح 10 .
  2. التفريق هيبسس في الخلايا العضلية المستمدة من هيبسك (هيبسك-سمز) باستخدام أساليب وصفها سابقا 11 ، 12 .
  3. في يوم 19 بعد التمايز، عزل العضلية باستخدام 2 مل من التربسين / إدتا 0.05٪ في كل بئر لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. مراقبة العضلية تحت المجهر الضوئي لمشاهدة التفكك الخلية.
  5. تحييد التربسين باستخدام 2 مل من المانع التربسين 0.0125٪.
  6. تجمع كارديوميوسيتس معزولة ونقلها إلى أنبوب 50 مل المخروطية واحدة باستخدام حشو ماصة بمحركات.
  7. الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 250 x ج في درجة حرارة الغرفة للحصول على بيليه.
  8. ريسوسبيند بيليه في 5 مل من حديقة روزويل(رمي) وسائل الإعلام الخلية تستكمل مع B-27 (رمي / B-27 وسائل الإعلام الخلية).
  9. ماصة 20 ميكرولتر من الخلايا في وسائل الإعلام الخلية وصمة عار مع مبلغ مساو من 0.4٪ حل تريبان الأزرق.
  10. استخدام عداد خلية الآلي أو عدادة الكريات اليدوي لحساب والحصول على بقاء وتركيز الخلية من تعليق الخلية.

2. إعداد الخلايا الليفية

  1. الشروع في الخلايا الليفية القلب البشري (هف) (نوع البطين الكبار) خط الخلية 13 .
  2. مرور وعزل لهم وفقا لبروتوكولات زراعة هف 13 .
  3. ماصة 20 ميكرولتر من الخلايا في وسائل الإعلام الخلية وصمة عار مع مبلغ مساو من حل تريبان الأزرق 0.4٪.
  4. استخدام عداد خلية الآلي أو عدادة الكريات اليدوي لحساب والحصول على بقاء تركيز وبقاء الخلية للتعليق خلية جديدة.

3. إعداد الخلايا البطانية

  1. بدء السرة البشريةإليكال ​​الوريد الخلية البطانية (هوفيك) خط كما هو موضح 14 . مرور وعزل لهم وفقا لبروتوكولات زراعة هوفيك كما هو موضح 14 .
  2. ماصة 20 ميكرولتر من الخلايا في وسائل الإعلام الخلية وصمة عار مع مبلغ مساو من 0.4٪ حل تريبان الأزرق.
  3. استخدام عداد خلية الآلي أو عدادة الكريات اليدوي لحساب والحصول على بقاء وتركيز الخلية من تعليق الخلية.

4. الثقافة المشتركة:

  1. خلط أنواع الخلايا الثلاثة (هيبسك-سم، هكفس، و هوفيكس) في وسائل الإعلام خلية رمي / B-27 لتوليد مخزون من محلول الخلية المختلطة في أنبوب مخروطي 50 مل، في هيبسك-سم: هف: نسبة الخلايا هوفيك من 70:15:15 وتركيز 165،000 خلية لكل مل.
  2. توزيع حل الخلية المختلطة في مرفق منخفضة للغاية 96 جيدا لوحات U- أسفل في 200 ميكرولتر لكل بئر، أو 33،000 خلية لكل بئر، وذلك باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  3. احتضان لوحات 96 جيدا لمدة 3 أيام (37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربونإيد، 95٪ الرطوبة).
  4. فحص لوجود الخلايا الكروية متعددة الخلايا الخلوية في وسط وأسفل الآبار الفردية، تحت المجهر الضوئي.
    ملاحظة: في الإسقاط المجهر ثنائي الأبعاد، وهذه الكروية تظهر دائرية في الشكل ( الشكل 1 ). وينبغي أن تشكل الكروية في غضون 24 ساعة، بعد زرع الخلايا في منخفضة للغاية مرفق 96 لوحات جيدا. يجب أن تبدأ الكروية الضرب في غضون 48 ساعة، بعد زرع الخلايا إلى لوحات 96-جيدا. الكروية التي لا تضرب لا ينبغي أن تستخدم ل بيوبرينتينغ 3D للتأكد من أن التصحيح القلب بيوبرينتد 3D النهائي وظيفية. المناعي من الكروية ل كونيكسين 43 (Cx43) و تروبونين يمكن أن تستخدم لتقييم التكوين الخلوي كروي والجودة 15 .

5. بيوبرينتينغ 3D من الأنسجة القلبية خالية من سقالة

  1. تحميل لوحات تحتوي على الكروية في المجلات من بيوبرينتر 3D كروي القائم على سقالة خالية.
  2. بدوره على بيوبرينتر 3D وتنفيذ برنامج بيوبرينتينغ 3D.
    1. انقر فوق "أوكسيلاري" و "أوبيراتيون بريباراشيون" و "إنسبكت مود" ثم "هوم ريتورن".
    2. انقر فوق الرمز الأخضر تحت "ابدأ" لبدء التفتيش كروي.
    3. مشاهدة لأقطار كروية لتظهر تحت العمود "(2) ضياء (ميكرون)" على الشاشة.
  3. لتقدير متوسط ​​قطر كروي إلى أقرب 100 ميكرون، انقر فوق "الإعدادات الأولية" وأدخل متوسط ​​قطر كروي في المكدس Z الملعب (ميكرون).
  4. انقر على "إجمالي"، يجب إعادة ضبط الرقم تحت "الطبقات" تلقائيا. انقر على "تطبيق" لتأكيد الإعدادات.
  5. انقر فوق "خريطة صفيف الإبرة"، انتقل إلى "طبقة رقم"، حدد الطبقة المطلوبة ل بيوبرينتينغ 3D، ورسم تصميم بيوبرينتينغ 3D المطلوب على الخريطة على يسار الشاشة عن طريق تحديد المواقف كروي الفردية. أنقرk "تطبيق" لتأكيد 3D بيوبرينتينغ التصميم.
  6. انقر فوق "إبرة صفيف تحقق" لبدء التفتيش صفيف إبرة. إذا كانت مجموعة إبرة خارج التركيز، وإدخال القيم في "أوفستز (μm)"، تتراوح بين 0 و 500 ميكرون لضبط التركيز الكاميرا، بدءا من 500 ميكرون وتناقص بنسبة 100 ميكرون إلى 0 ميكرون.
  7. انقر فوق "معلمات التفتيش"، "نوع 1"، وتعيين "قطر (ميكرون)" إلى نطاق القطر المطلوب. تعيين "الاستدارة (٪)" و "نعومة (٪)" إلى النسب المئوية المطلوبة. انقر على "تطبيق" لتأكيد الإعدادات.
    ملاحظة: هنا تم تعيين أقطار كروية من 450 ميكرون إلى 550 ميكرون. "الاستدارة (٪)" و "نعومة (٪)" هي تقييم الكمبيوتر المحسوبة لكل كروي الفردية. هنا، الإعدادات المستخدمة ل "الاستدارة (٪)" هو 60٪ و "نعومة (٪)" هو 70٪.
  8. انقر على "وجود" وتحديث "القطر (μm)" إلى نفس الإعدادs في الخطوة السابقة. انقر على "تطبيق" لتأكيد الإعدادات.
  9. انقر فوق "وضع المكدس"، ثم رمز الأخضر تحت "ابدأ" لبدء كروي التقاط باستخدام فوهة من بيوبرينتر 3D عن طريق شفط فراغ، ووضع الكروية في مواقع محددة في مجموعة إبرة.
    ملاحظة: للحصول على التصحيح القلب تتكون من 81 الكروية (9 الكروية × 9 الكروية)، 3D بيوبرينتينغ يجب أن يستغرق حوالي 20 إلى 30 دقيقة.
  10. بعد بيوبرينتينغ، وذلك باستخدام ملقط معقم، والتقاط مجموعة إبرة تحتوي على التصحيح بيوبرينتد 3D ونقله إلى كوب 250 مل العقيمة التي تحتوي على 150 مل من وسائل الإعلام خلية رمي / B-27.
  11. احتضان التصحيح بيوبرينتد 3D مع مجموعة إبرة لمدة 3 أيام (37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون، و 95٪ الرطوبة).

6. إزالة التصحيح بيوبرينتد 3D من صفيف إبرة والنضج التصحيح

  1. بعد 3 أيام من الحضانة، بيد واحدة في قاعدة مجموعة إبرة والآخر على غطاء من البلاستيك تحت رانه التصحيح، الشريحة بلطف غطاء من البلاستيك إلى أعلى لإزالة التصحيح بيوبرينتد 3D من مجموعة إبرة.
    ملاحظة: تزييت مع الفوسفات مخزنة المالحة (بس) يمكن تطبيقها على الإبر فقط قبل هذه الخطوة، حسب الحاجة، لإزالة أكثر سلاسة وأسهل.
  2. باستخدام زوج من ملقط معقم، والتقاط غطاء من البلاستيك مع التصحيح بيوبرينتد 3D على رأسه ونقل غطاء التصحيح والبلاستيك في طبق 35 ملم تحتوي على وسائل الإعلام خلية رمي / B-27.
  3. هز بلطف غطاء من البلاستيك مع التصحيح في وسائل الإعلام خلية رمي / B-27، مع ملقط لا تزال تحتجز على غطاء من البلاستيك، لإطلاق التصحيح في وسائل الإعلام.
  4. فحص التصحيح بيوبرينتد 3D تحت المجهر الضوئي لتصور ما إذا كان الضرب للتأكد من أن التصحيح بيوبرينتد 3D وظيفية.
  5. احتضان التصحيح بيوبرينتد 3D في طبق 35 ملم لمدة 3 أيام أو أكثر (37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون، و 95٪ الرطوبة).
    ملاحظة: بعد 3 أيام، الكروية فتيل معا والثقوب فيالتصحيح، حيث الإبر، لم يعد مرئيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في نهاية الخطوة 4.4 (ثقافة مشتركة)، يجب أن الخلايا في كل بئر تجميع في الجزء السفلي من منخفضة جدا مرفق 96 جيدا لوحات U- أسفل لتشكيل الكروية عن طريق الجاذبية. هذه الكروية تحتوي على هيبسك-سم، هكفس، و هوفيكس، ويمكن فحصها بصريا تحت المجهر الضوئي، حيث ينبغي أن تظهر دائرية من قبل إسقاط ثنائي الأبعاد ( الشكل 1 ). في نهاية الخطوة 6.3، يجب أن تحتوي على التصحيح القلب بيوبرينتد 3D 3D الفراغات الأنسجة، وذلك بسبب ثقوب إبرة التي أنشأتها مجموعة إبرة ( الشكل 2 ، يسار). عند هذه النقطة، الحدود بين الكروية يجب أن تصبح غير واضحة وينبغي أن التصحيح قد بدأت للتغلب على عفويا، وإظهار التكامل الميكانيكي من الكروية. في نهاية الخطوة 6.5، يجب ملء الفراغات الأنسجة في الأنسجة المحيطة بها ( الشكل 2 ، والحق)، في حين أن التصحيح القلبي بيوبرينتد 3D يجب أن تستمر في بيt تلقائيا.

شكل 1
الشكل 1 : إنشاء مختلطة الخلايا الكروية متعددة الخلايا. هبسك-سم، هكفس، و هوفيكس كانت مختلطة في هيبسك-سم: هف: نسبة خلية هوفيك من 70:15:15، وتم توزيع خليط الخلية في منخفضة للغاية مرفق 96 جيدا لوحات U- القاع. في غضون 24 ساعة، الكروية الخلايا المختلطة متعددة الخلايا (اليسار واليمين) شكلت، واحدة في كل بئر. شريط مقياس = 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2 : إنشاء الأنسجة القلبية إظهار التكامل الميكانيكي من الكروية . A 3D الحيويطبع التصحيح القلبي مباشرة بعد إزالة من مجموعة إبرة مع ثقوب إبرة مرئية (يسار). في هذا الوقت، كانت الحدود بين الكروية قد أصبحت غير واضحة بالفعل وبدأ التصحيح بالفعل بالضرب تلقائيا، وبالتالي أصبحت الكروية متكاملة ميكانيكيا. بعد ثلاثة أيام من إزالتها من مجموعة إبرة، تم ملء الفراغات الأنسجة الناجمة عن مجموعة إبرة في الأنسجة المحيطة (يمين)، واستمر التصحيح الضرب بشكل عفوي. شريط مقياس = 1 ملم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

ويقر المؤلفان بمصادر التمويل التالية: صندوق ماجيك ذا ماترس للأبحاث القلبية الوعائية وصندوق أبحاث الخلايا الجذعية في ميريلاند (2016-مسكرفي-2735).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Geltrex Invitrogen  A1413202
Trypsin/EDTA 0.05% Thermo Fisher 15400054
Defined Trypsin inhibitor 0.0125% Thermo Fisher R007100
RPMI Cell Media Invitrogen 11875-093 RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
B-27 Supplement Thermo Fisher 17504044 RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10227
Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) Sciencell 6310
Human umbilical vein endothelial cells Lonza CC-2935
PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates  Akita Sumitomo Bakelite Co. MS-9096UZ
Regenova Bio 3D Printer Cyfuse Biomedical K.K. N/A www.cyfusebio.com/en/
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher 15250061
Troponin T Antibody Thermo Fisher 701620
Connexin 43 (Cx43) Antibody Chemicon MAB3068
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Thermo Fisher P36935

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
  2. Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16, 247-276 (2014).
  3. Patra, S., Young, V. A Review of 3D Printing Techniques and the Future in Biofabrication of Bioprinted Tissue. Cell Biochem Biophy. 74, 93-98 (2016).
  4. Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Eng Part B Rev. , (2017).
  5. Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
  6. Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomater. 31, 461-466 (2010).
  7. Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. J Heart Lung Transpl. 35, 137-145 (2016).
  8. Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomater. 30, 2164-2174 (2009).
  9. Itoh, M., et al. Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D Printer Undergo Remodeling and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae. PloS One. 10, e0136681 (2015).
  10. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol Biol. 997, 45-56 (2013).
  11. Li, S., Cheng, H., Tomaselli, G. F., Li, R. A. Mechanistic basis of excitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+ spark characteristics: direct evidence of functional Ca2+-induced Ca2+ release. Heart Rhythm. 11, 133-140 (2014).
  12. Boheler, K. R., et al. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Rep. 3, 185-203 (2014).
  13. ScienCell Research Laboratories. Human Cardiac Fibroblasts (adult ventricular) Product Sheet. , https://www.sciencellonline.com/PS/6310.pdf (2017).
  14. Lonza Walkersville, Inc. Endothelial Cell Systems - Technical Information & Instructions.,. , http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf (2015).
  15. Thermo Fisher Scientific, Inc. Immunofluorescence Method for IHC Detection. , https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunofluorescence-method-ihc-detection.html (2017).
  16. Murata, D., et al. A preliminary study of osteochondral regeneration using a scaffold-free three-dimensional construct of porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Orthop Surg Res. 10, (2015).
  17. Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomed Mater. 10, 034002 (2015).
  18. Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K., Hoying, J. B. Direct-write Bioprinting Three-Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res. Part B, Appl Biomater. 98, 160-170 (2011).
  19. Lee, J. M., Sing, S. L., Tan, E. Y. S., Yeong, W. Y. Bioprinting in cardiovascular tissue engineering: a review. International J Bioprinting. 2 (2016), (2016).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 125، هندسة الأنسجة القلبية، 3D الطباعة، بيوبرينتينغ، التصنيع الحيوي، التصنيع المضافة، فشل القلب، الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية المستمدة الخلايا الجذعية المستمدة
إنشاء الأنسجة القلبية عرض التكامل الميكانيكي للكروية باستخدام بيوبرينتينغ 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ong, C. S., Fukunishi, T., Nashed,… More

Ong, C. S., Fukunishi, T., Nashed, A., Blazeski, A., Zhang, H., Hardy, S., DiSilvestre, D., Vricella, L., Conte, J., Tung, L., Tomaselli, G., Hibino, N. Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting. J. Vis. Exp. (125), e55438, doi:10.3791/55438 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter