Summary
Denne protokollen beskriver 3D bioprinting av hjertevev uten bruk av biomaterialer. 3D bioprinted cardiac patches utviser mekanisk integrasjon av komponent sferoider og er svært lovende i hjertevevs regenerering og som 3D-modeller av hjertesykdom.
Abstract
Denne protokollen beskriver 3D bioprinting av hjertevev uten bruk av biomaterialer, ved bruk av bare celler. Kardiomyocytter, endotelceller og fibroblaster isoleres først, telles og blandes ved ønskede celleforhold. De samkultiveres i individuelle brønner i 96-brønnplater med ekstremt lav vedlegg. Innen 3 dager formes spheroider. Disse sfærene blir så plukket opp av en dyse med vakuumsuging og montert på en nålegruppe ved hjelp av en 3D bioprinter. Sfæronene får så smelte på nålen. Tre dager etter 3D bioprinting fjernes sfærene som en intakt patch, som allerede spontant slår. 3D bioprinted cardiac patches utviser mekanisk integrasjon av komponent sferoider og er svært lovende i hjertevevs regenerering og som 3D-modeller av hjertesykdom.
Introduction
Det finnes mange forskjellige metoder for 3D bioprinting 1 , 2 , 3 . 3D bioprinting klassifiseres ofte av trykkteknologi 1 , med eksempler som inkjet bioprinting, microextrusion bioprinting, laserassistert bioprinting, en kombinasjon av metoder eller nyere tilnærminger. 3D bioprinting kan også klassifiseres i stillasfrie eller stillasavhengige metoder 4 . De fleste metoder for 3D bioprinting er stillasavhengig, der det er behov for biomaterialer, for eksempel bioinks 5 eller stillas 6 . Imidlertid står stillasavhengig 3D bioprinting overfor mange problemer og begrensninger 4 , 7 , som for eksempel immunogenitet av stillasemateriale, kostnaden for proprietære bioinks, lav hastighet og toksisitet for nedbrytningsprodukter.
SCAFFoldfri hjertevevsteknikk ved bruk av sfæroider har blitt forsøkt 8 , med potensial til å overvinne disse ulempene med stillasavhengig vevsteknikk. Imidlertid, som anerkjent av forfatterne i det papiret, hadde det vært vanskelig å håndtere og plassere sfæroider på faste steder, i ferd med biofabricering. Samtidig bruk av 3D bioprinting og sfæroidbasert vevsteknikk har potensial til å overvinne disse vanskelighetene. I denne protokollen beskriver vi 3D bioprinting av hjertevev uten andre biomaterialer, ved bruk av bare celler i form av sfæroider.
Stillasfrie sfæroidbaserte 3D-bioprintere 9 har muligheten til å plukke opp individuelle sfæroider ved hjelp av vakuumsuging og plassere dem på en nålestruktur. Konseptet med posisjonering sfæroider på en nålestrek i 3D bioprinting, er inspirert av bruk av nålarrayer (kjent som " kenzan ") i den gamle JapaNese kunst av blomsterarrangement, ikebana. Dette systemet tillater sfærer å plasseres nøyaktig i en hvilken som helst konfigurasjon og resulterer i at de enkelte sfæroider smelter sammen over en kort periode for å lage et 3D bioprinted vev. Denne metoden tillater dermed at sfæroider skal manipuleres med letthet, med potensielle implikasjoner for fremtiden for stillasfri organbiobakterisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av kardiomyocytter
- Generere og kultur menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCs) på 6-brønnsplater belagt med kjellermembranmatriks som beskrevet 10 .
- Differensier hiPSCs til hiPSC-avledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) ved å bruke tidligere beskrevne metoder 11 , 12 .
- På dag 19 etter differensiering isolerer kardiomyocyttene ved bruk av 2 ml trypsin / EDTA 0,05% i hver brønn i 5 minutter ved romtemperatur.
- Overvåk kardiomyocyttene under et optisk mikroskop for å se på cellefordeling.
- Nøytraliser trypsin ved å bruke 2 ml trypsininhibitor 0,0125%.
- Basseng de isolerte kardiomyocyttene og overfør dem til et 50 ml konisk rør ved bruk av en motorisert pipettfyller.
- Sentrifuger cellesuspensjonen i 5 minutter ved 250 xg ved romtemperatur for å oppnå en pellet.
- Resuspender pelleten i 5 ml Roswell ParkMemorial Institute (RPMI) cellemedium supplert med B-27 (RPMI / B-27 cellemedium).
- Pipetter 20 μl celler i cellemedia og flekker med en lik mengde 0,4% Trypan Blue-løsning.
- Bruk en automatisert celleteller eller et manuell hemocytometer for å telle og oppnå konsentrasjonen og cellens levedyktighet av cellesuspensjonen.
2. Fremstilling av fibroblaster
- Initiere cellelinjen 13 for human hjertefibroblast (HCF) (voksen ventrikulær type).
- Passasje og isolere dem i samsvar med HCF-kulturprotokollene 13 .
- Pipetter 20 μl celler i cellemedia og flekker med en lik mengde Trypan Blue-oppløsning 0,4%.
- Bruk en automatisert celleteller eller et manuell hemocytometer for å telle og oppnå konsentrasjonen og cellens levedyktighet av den nye cellesuspensjonen.
3. Fremstilling av endotelceller
- Start den menneskelige umbIlisk venet endotelcelle (HUVEC) linje som beskrevet 14 . Passere og isolere dem i samsvar med HUVEC-dyrkningsprotokoller som beskrevet 14 .
- Pipetter 20 μl celler i cellemedia og flekker med en lik mengde 0,4% Trypan Blue-løsning.
- Bruk en automatisert celleteller eller et manuell hemocytometer for å telle og oppnå konsentrasjonen og cellens levedyktighet av cellesuspensjonen.
4. Co-kultur:
- Bland de tre celletyper (hiPSC-CM, HCFs og HUVECs) i RPMI / B-27-cellemedier for å generere en stamme av blandet celleoppløsning i et 50 ml konisk rør ved et hiPSC-CM: HCF: HUVEC-celleforhold av 70:15:15 og konsentrasjon på 165.000 celler per ml.
- Fordel blandetcelleoppløsningen i ultra-lav vedlegg 96-brønn U-bunnplater ved 200 μL per brønn, eller 33.000 celler per brønn, ved hjelp av en flerkanalspipett.
- Inkuber 96-brønnsplatene i 3 dager (37 ° C, 5% karbondioksidIde, 95% fuktighet).
- Undersøk for forekomst av blandede celle multicellulære sfæroider i midten og bunnen av individuelle brønner, under lysmikroskopi.
MERK: I en todimensjonal mikroskopisk projeksjon vil disse sfærene vise seg sirkulær i form ( figur 1 ). Spheroider bør dannes innen 24 timer, etter at cellene er sådd inn i 96-brønnplater med ultra-lav vedlegg. Spheroider bør begynne å slå innen 48 timer etter at cellene er sådd inn i 96-brønnsplater. Spheroider som ikke slår, bør ikke brukes til 3D bioprinting for å sikre at den endelige 3D-bioprintede hjertepatchen er funksjonell. Immunofluorescens av sfæroider for connexin 43 (Cx43) og troponin kan brukes til å vurdere sfæroid cellulær sammensetning og kvalitet 15 .
5. 3D Bioprinting av stillasfrie hjertevev
- Legg platene som inneholder sfærene inn i magasinet på stillasfri sfæroidbasert 3D-bioprinter.
- Slå på 3D bioprinteren og utfør 3D bioprinting programvare.
- Klikk på "Auxillary", "Operation Preparation", "Inspiser modus", og deretter "Home Return".
- Klikk på det grønne ikonet under "Start" for å starte sfærisk inspeksjon.
- Se etter at sfæroiddiametrene vises under kolonnen "(2) Dia (μm)" på skjermen.
- For å estimere gjennomsnittlig sfæroid diameter til nærmeste 100 μm, klikk på "Innledende innstillinger" og skriv inn den gjennomsnittlige sfæroiddiameteren i Stack Z-pitch (μm).
- Klikk "Totalt", tallet under "Lag" bør justeres automatisk. Klikk på "Apply" for å bekrefte innstillingene.
- Klikk på "Needle Array Map", gå til "Lag nr.", Velg ønsket lag for 3D bioprinting, og tegne ønsket 3D bioprinting design på kartet til venstre på skjermen ved å velge individuelle sfæriske posisjoner. clicK "Apply" for å bekrefte 3D bioprinting design.
- Klikk på "Needle Array Check" for å begynne å undersøke nålestikk. Hvis nålarrangementet er ute av fokus, skriv inn verdier i "OffsetZ (μm)", som varierer fra 0 til 500 μm for å justere kamerafokuset, starter med 500 μm og reduseres med 100 μm til 0 μm.
- Klikk på "Inspeksjonsparametre", "Type 1", og sett "Diameter (μm)" til ønsket diameterområde. Sett "Rundhet (%)" og "Glatthet (%)" til ønsket prosentandel. Klikk på "Apply" for å bekrefte innstillingene.
MERK: Her sattes sfæriske diametre fra 450 μm til 550 μm. "Rundhet (%)" og "Glatthet (%)" er datamaskinberegnet vurdering av hver enkelt sfæroid. Her er innstillingene som brukes for "Rundhet (%)" 60% og "Glatthet (%)" er 70%. - Klikk på "Tilstedeværelse" og oppdater "Diameter (μm)" til samme innstillingS i forrige trinn. Klikk på "Apply" for å bekrefte innstillingene.
- Klikk på "Stack Mode", så det grønne ikonet under "Start" for å starte sfæroidopptak ved hjelp av dysen til 3D bioprinteren ved vakuumsuging og plassering av sfæroider på bestemte steder i en nålestruktur.
MERK: For et hjerteplaster som består av 81 sfæroider (9 spheroider x 9 sfæroider), bør 3D bioprinting ta omtrent 20 til 30 minutter. - Etter bioprinting, bruk sterile pincett, plukk opp nålestikket som inneholder 3D-bioprintet patch og overfør det til et 250 mL sterilt beger som inneholder 150 mL RPMI / B-27-cellemedium.
- Inkubér 3D-bioprintet patch med nålen i 3 dager (37 ° C, 5% karbondioksid, 95% fuktighet).
6. Fjerning av 3D Bioprinted Patch fra Needle Array og Patch Maturation
- Etter 3 dager inkubering, med en hånd ved foten av nålen og den andre på plastdekselet under tHan lapper, forsiktig skyv plastdekselet oppover for å fjerne 3D-bioprintet patch fra nålen.
MERK: Smøring med fosfatbuffert saltvann (PBS) kan påføres nåler like før dette trinnet, etter behov, for jevnere og enklere fjerning. - Ved hjelp av et par sterile pincetter, plukk opp plastdekselet med 3D-bioprintet patch på toppen av det og overfør plasteret og plastdekselet til en 35 mm tallerken med RPMI / B-27-cellemedium.
- Rist forsiktig plastdekselet med plåstret i RPMI / B-27-cellemediet, med tangene som fortsatt holder seg fast på plastdekslet, for å løsne plåten i media.
- Kontroller 3D-bioprintet patch under lysmikroskopi for å visualisere om det slår for å sikre at 3D-bioprintet patch er funksjonelt.
- Inkubér 3D-bioprintet patch i 35 mm fatet i 3 dager eller lenger (37 ° C, 5% karbondioksid, 95% fuktighet).
MERK: Etter 3 dager smelter sfæroidene sammen og hullene iPlasten, hvor nålene var, burde ikke lenger være synlige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved slutten av trinn 4.4 (samkultur) skal cellene i hver brønn aggregere i bunnen av de ultra-lave vedleggene 96-brønn U-bunnplater for å danne sfærer med tyngdekraften. Disse sfæriskene inneholder hiPSC-CM, HCF og HUVEC, og kan inspiseres visuelt under lysmikroskopi, hvor de skal vises sirkulære ved todimensjonale projeksjoner ( figur 1 ). På slutten av trinn 6.3 skal 3D-bioprintet hjerteflåte inneholde vevhuller på grunn av nålhull som er opprettet av nålen ( figur 2 , venstre). På dette tidspunktet burde grensene mellom sfæroidene være blitt utydelige og lappen skulle ha begynt å slå spontant og utvise mekanisk integrasjon av sfæroider. På slutten av trinn 6.5, bør vevhullene fylles inn av omliggende vev ( figur 2 , høyre), mens 3D-bioprintet hjerteplast bør fortsette å væreT spontant.
Figur 1 : Opprettelse av blandede celle multicellulære sfæroider. HiPSC-CM, HCFs og HUVECs ble blandet ved et hiPSC-CM: HCF: HUVEC-celleforhold på 70:15:15, og celleblandingen ble distribuert til ultra-lave vedlegg 96-brønn U-bunnplater. Innen 24 timer dannet multicellulære sfæriske blandede celler (venstre, høyre), en i hver brønn. Skalbjelke = 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 : Opprettelse av hjertevev som utviser mekanisk integrasjon av sfæroider . En 3D-bioTrykt hjerteplaster umiddelbart etter fjerning fra nålen med synlige nålhull (til venstre). På denne tiden var grensene mellom sfæroiderne allerede blitt utydelige og lappen hadde allerede begynt å slå spontant, slik at sfæroidene ble mekanisk integrert. Tre dager etter fjerning fra nålarrangementet ble vevhullene forårsaket av nålarrayet fylt inn av omliggende vev (høyre), og lappen fortsatte å slå spontant. Skalbjelke = 1 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner følgende finansieringskilder: Magic That Matters Fund for kardiovaskulær forskning og Maryland Stamcelle Research Fund (2016-MSCRFI-2735).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Defined Trypsin inhibitor 0.0125% | Thermo Fisher | R007100 | |
| RPMI Cell Media | Invitrogen | 11875-093 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) | Sciencell | 6310 | |
| Human umbilical vein endothelial cells | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates | Akita Sumitomo Bakelite Co. | MS-9096UZ | |
| Regenova Bio 3D Printer | Cyfuse Biomedical K.K. | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Troponin T Antibody | Thermo Fisher | 701620 | |
| Connexin 43 (Cx43) Antibody | Chemicon | MAB3068 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher | P36935 |
References
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
- Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16, 247-276 (2014).
- Patra, S., Young, V. A Review of 3D Printing Techniques and the Future in Biofabrication of Bioprinted Tissue. Cell Biochem Biophy. 74, 93-98 (2016).
- Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Eng Part B Rev. , (2017).
- Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomater. 31, 461-466 (2010).
- Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. J Heart Lung Transpl. 35, 137-145 (2016).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomater. 30, 2164-2174 (2009).
- Itoh, M., et al. Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D Printer Undergo Remodeling and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae. PloS One. 10, e0136681 (2015).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol Biol. 997, 45-56 (2013).
- Li, S., Cheng, H., Tomaselli, G. F., Li, R. A. Mechanistic basis of excitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+ spark characteristics: direct evidence of functional Ca2+-induced Ca2+ release. Heart Rhythm. 11, 133-140 (2014).
- Boheler, K. R., et al. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Rep. 3, 185-203 (2014).
- ScienCell Research Laboratories. Human Cardiac Fibroblasts (adult ventricular) Product Sheet. , https://www.sciencellonline.com/PS/6310.pdf (2017).
- Lonza Walkersville, Inc. Endothelial Cell Systems - Technical Information & Instructions.,. , http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf (2015).
- Thermo Fisher Scientific, Inc. Immunofluorescence Method for IHC Detection. , https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunofluorescence-method-ihc-detection.html (2017).
- Murata, D., et al. A preliminary study of osteochondral regeneration using a scaffold-free three-dimensional construct of porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Orthop Surg Res. 10, (2015).
- Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomed Mater. 10, 034002 (2015).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K., Hoying, J. B. Direct-write Bioprinting Three-Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res. Part B, Appl Biomater. 98, 160-170 (2011).
- Lee, J. M., Sing, S. L., Tan, E. Y. S., Yeong, W. Y. Bioprinting in cardiovascular tissue engineering: a review. International J Bioprinting. 2 (2016), (2016).
