Summary
Этот протокол описывает трехмерную биотрансляцию сердечной ткани без использования биоматериалов. 3D-биотрансгированные сердечные патч демонстрируют механическую интеграцию компонентов сфероидов и являются многообещающими в регенерации сердечной ткани и в качестве трехмерных моделей сердечных заболеваний.
Abstract
Этот протокол описывает трехмерную биотрансляцию сердечной ткани без использования биоматериалов, используя только клетки. Кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и фибробласты сначала выделяют, подсчитывают и смешивают при желательных соотношениях клеток. Они совместно культивируются в отдельных лунках в планшетах с ультра-низкой насадкой с 96 лунками. В течение 3 дней формируются бейбинг-сфероиды. Затем эти сфероиды подбирают с помощью вакуумного всасывания и собирают на игольчатой матрице с использованием 3D-биопринтера. Затем сфероидам разрешается сливаться с иглой. Через три дня после трехмерного биотрансляции сфероиды удаляются как неповрежденный патч, который уже спонтанно избивается. 3D-биотрансгированные сердечные патч демонстрируют механическую интеграцию компонентов сфероидов и являются многообещающими в регенерации сердечной ткани и в качестве трехмерных моделей сердечных заболеваний.
Introduction
Существует много разных методов 3D-биотрансляции 1 , 2 , 3 . 3D-биотрансляция часто классифицируется с помощью технологии печати 1 , например, с использованием биотрансформации для струйной печати, биопреобразования микроэкструзии, биопринтинга с использованием лазера, комбинации методов или более новых подходов. 3D-биотрансляция также может быть отнесена к незамерзающим или зависящим от леса методам 4 . Большинство методов 3D-биопринтинга являются зависимыми от лесов, где существует потребность в биоматериалах, например биоиндикаторах 5 или лесах 6 . Тем не менее, зависящий от лесов трехмерный биотрансляции сталкивается со многими проблемами и ограничениями 4 , 7 , такими как иммуногенность материала лесов, стоимость патентованных биоиндикаторов, низкая скорость и токсичность продуктов разложения.
ScafБыла предпринята попытка создания бессердечной кардиальной ткани с использованием сфероидов 8 с потенциалом преодоления этих недостатков инженерной инженерии, зависящей от лесов. Однако, как признали авторы в этой статье, было трудно надежно обрабатывать и позиционировать сфероиды в фиксированных местах в процессе биообработки. Сопутствующее использование 3D-биопреобразования и тканевой инженерии на основе сфероидов может преодолеть эти трудности. В этом протоколе мы описываем 3D-биотрансляцию сердечной ткани без других биоматериалов, используя только клетки в форме сфероидов.
3D-биопринтеры 9 на основе сфероидов, основанные на основах, имеют возможность подбирать отдельные сфероиды с помощью вакуумного отсоса и размещать их на игольчатой матрице. Концепция позиционирующих сфероидов на игольчатой матрице в 3D-биотрансляции основана на использовании игольчатых массивов (известных как « kenzan ») в древней ДжапеНежное искусство цветочной композиции, икебана. Эта система позволяет точно расположить сфероиды в любой конфигурации и приводит к тому, что отдельные сфероиды сплавляются вместе в течение короткого периода времени для создания трехмерной ткани с биотрансформацией. Таким образом, этот метод позволяет легко манипулировать сфероидами с потенциальными последствиями для будущего биообработки биомассы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение кардиомиоцитов
- Генерировать и культивировать индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC) на 6-луночных планшетах, покрытых матрицей подвальной мембраны, как описано 10 .
- Различают hiPSC в hiPSC-производные кардиомиоциты (hiPSC-CMs) с использованием ранее описанных методов 11 , 12 .
- На 19-й день после дифференцировки выделите кардиомиоциты, используя 2 мл трипсина / EDTA 0,05% в каждой лунке в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Контролируйте кардиомиоциты под оптическим микроскопом для наблюдения за диссоциацией клеток.
- Нейтрализуйте трипсин, используя 2 мл ингибитора трипсина 0,0125%.
- Слейте изолированные кардиомиоциты и перенесите их в одну коническую трубку объемом 50 мл с помощью моторизированного наполнителя для пипетки.
- Центрифугируйте клеточную суспензию в течение 5 мин при 250 × g при комнатной температуре, чтобы получить гранулу.
- Ресуспендируют гранулу в 5 мл Roswell ParkMemorial Institute (RPMI), дополненную B-27 (ячейками среды RPMI / B-27).
- Пипетируют 20 мкл клеток в клеточных средах и окрашивают равным количеством 0,4% раствора Trypan Blue.
- Используйте счетчик автоматических клеток или ручной гемоцитометр для подсчета и получения концентрации и жизнеспособности клеток суспензии клеток.
2. Получение фибробластов
- Инициировать клеточную линию 13 кардиального фибробласта (HCF) (взрослого желудочкового типа).
- Пройдите и изолируйте их в соответствии с протоколами культивирования HCF 13 .
- Пипетируют 20 мкл клеток в клеточной среде и окрашивают равным количеством раствора Trypan Blue 0,4%.
- Используйте счетчик автоматических клеток или ручной гемоцитометр для подсчета и получения концентрации и жизнеспособности клеток новой клеточной суспензии.
3. Получение эндотелиальных клеток
- Инициировать человекаЛинией эндотелиальных клеток лилии (HUVEC), как описано 14 . Пройдите и изолируйте их в соответствии с протоколами культивирования HUVEC, как описано 14 .
- Пипетируют 20 мкл клеток в клеточных средах и окрашивают равным количеством 0,4% раствора Trypan Blue.
- Используйте счетчик автоматических клеток или ручной гемоцитометр для подсчета и получения концентрации и жизнеспособности клеток суспензии клеток.
4. Совместная культура:
- Смешайте три типа клеток (hiPSC-CM, HCFs и HUVEC) в средах с ячейками RPMI / B-27, чтобы создать запас раствора смешанных клеток в конической трубке объемом 50 мл при соотношении клеток hiPSC-CM: HCF: HUVEC 70:15:15 и концентрации 165 000 клеток на мл.
- Распределите раствор смешанных клеток в планшеты с ультра-низким прилипанием с 96 лунками на 200 мкл на лунку или 33 000 клеток на лунку с использованием многоканальной пипетки.
- Инкубируйте 96-луночные планшеты в течение 3 дней (37 ° С, 5% диоксида углерода, Влажность 95%).
- Осмотрите наличие смешанных клеточных многоклеточных сфероидов в центре и в нижней части отдельных лунок под световой микроскопией.
ПРИМЕЧАНИЕ. В двумерной микроскопической проекции эти сфероиды окажутся круглыми по форме ( рис. 1 ). Сфероиды должны образовываться в течение 24 ч, после посева клеток в пластинки с 96 лунками с ультранизким наложением. Сфероиды должны начинать избивать в течение 48 часов, после посева клеток в 96-луночные планшеты. Сфероиды, которые не избивают, не должны использоваться для 3D-биотрансляции, чтобы гарантировать, что конечный трехмерный биотрансферный пластырь функционирует. Иммунофлуоресценцию сфероидов для коннексина 43 (Cx43) и тропонина можно использовать для оценки состава и качества сфероида.
5. 3D Bioprinting без каркасных сердечных тканей
- Загрузите пластины, содержащие сфероиды, в журналы бескаркасного сферического 3D-биопринтера.
- Включите 3D-биопринтер и выполните программное обеспечение для трехмерного биотрансляции.
- Нажмите «Вспомогательный», «Подготовка к операции», «Режим проверки», а затем «Возврат домой».
- Нажмите зеленую иконку в разделе «Старт», чтобы начать проверку сфероида.
- Следите за тем, чтобы диаметры сфероидов отображались под колонкой «(2) Dia (μm)» на экране.
- Чтобы оценить средний диаметр сфероида до ближайших 100 мкм, нажмите «Начальные настройки» и введите средний диаметр сфероида в шаг Stack Z (мкм).
- Нажмите «Всего», номер под «Слои» должен автоматически отрегулироваться. Нажмите «Применить», чтобы подтвердить настройки.
- Нажмите «Карта массивов игл», перейдите к «Layer No», выберите нужный слой для 3D-биотрансляции и нарисуйте желаемый 3D-проект bioprinting на карте слева от экрана, выбрав отдельные положения сфероида. ClicK «Применить», чтобы подтвердить дизайн 3D-биотрансляции.
- Нажмите «Проверка решетки игл», чтобы начать проверку игольной матрицы. Если игольчатая матрица находится вне фокуса, введите значения «OffsetZ (μm)» в диапазоне от 0 до 500 мкм, чтобы отрегулировать фокусировку камеры, начиная с 500 мкм и уменьшаясь на 100 мкм до 0 мкм.
- Нажмите «Параметры проверки», «Тип 1» и установите «Диаметр (мкм)» в нужный диапазон диаметров. Установите «Roundness (%)» и «Smoothness (%)» на желаемые проценты. Нажмите «Применить», чтобы подтвердить настройки.
ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь диаметры сфероида были установлены от 450 до 550 мкм. «Круглость (%)» и «Гладкость (%)» - это компьютерная расчетная оценка каждого отдельного сфероида. Здесь настройки, используемые для «Roundness (%)», составляют 60%, а «Гладкость (%)» - 70%. - Нажмите «Присутствие» и обновите «Диаметр (мкм)» до той же настройкиС на предыдущем шаге. Нажмите «Применить», чтобы подтвердить настройки.
- Нажмите «Режим стека», затем зеленый значок «Старт», чтобы начать сфероид, забрать с помощью сопла 3D-биопринтера вакуумным всасыванием и разместить сфероиды в определенных местах в игольной решетке.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для сердечного патча, состоящего из 81 сфероида (9 сфероидов x 9 сфероидов), трехмерная биотрансляция должна занимать около 20-30 минут. - После биотрансляции, используя стерильные щипцы, возьмите иглу, содержащую трехмерный биотрансмент, и перенесите его в 250 мл стерильный стакан, содержащий 150 мл среды RPMI / B-27.
- Инкубируйте трехмерный биотрансмент с игольной матрицей в течение 3 дней (37 ° C, 5% углекислого газа, влажность 95%).
6. Удаление 3D Bioprinted Patch из массива игл и паттерна
- После 3 дней инкубации, с одной стороны, у основания иглы, а другой на пластиковой крышке под tОн патч, осторожно сдвиньте пластиковую крышку вверх, чтобы удалить трехмерный биотрансмент из массива игл.
ПРИМЕЧАНИЕ. Смазывание забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) может быть применено к иглам непосредственно перед этим шагом, если необходимо, для более плавного и легкого удаления. - Используя пару стерильных щипцов, поднимите пластиковую крышку с помощью трехмерного биотрансляционного патча поверх нее и перенесите патч и пластиковую крышку в 35-миллиметровое блюдо, содержащее среду с ячейками RPMI / B-27.
- Аккуратно встряхните пластиковую крышку с помощью патча в среде с ячейками RPMI / B-27, при этом щипцы все еще удерживаются на пластиковой крышке, чтобы выпустить патч в носитель.
- Осмотрите 3D-биотрансляционный патч под световой микроскопией, чтобы визуализировать, является ли это побочным эффектом, чтобы функционировать трехмерный биотрансмент.
- Инкубируйте трехмерный биотрансплантат в 35-миллиметровой тарелке в течение 3 дней или дольше (37 ° C, 5% углекислого газа, влажность 95%).
ПРИМЕЧАНИЕ. Через 3 дня сфероиды сливаются вместе, а отверстия вПатч, где игла была, больше не должна быть видимой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В конце этапа 4.4 (совместная культура) клетки в каждой лунке должны собираться в нижней части пластин U-образного основания с ультра-низким прикреплением с 96 лунками для образования сфероидов под действием силы тяжести. Эти сфероиды содержат hiPSC-CM, HCF и HUVEC и могут быть визуально проверены под световой микроскопией, где они должны появляться круговыми по двумерной проекции ( рисунок 1 ). В конце шага 6.3, трехмерный биотрансферный пластырь должен содержать тканевые пустоты из-за отверстий иглы, создаваемых игольчатой матрицей ( рис. 2 , слева). На этом этапе границы между сфероидами должны были стать нечеткими, и патч должен был начать спонтанно биться, демонстрируя механическую интеграцию сфероидов. В конце шага 6.5 тканевые пустоты должны быть заполнены окружающей тканью ( рис. 2 , справа), в то время как трехмерный биотрансферный пластырь должен продолжать бытьT спонтанно.
Рисунок 1 : Создание многоклеточных сфероидов смешанных клеток. HiPSC-CM, HCFs и HUVEC были смешаны при соотношении клеток hiPSC-CM: HCF: HUVEC 70:15:15, и смесь клеток распределялась в ультра-низкорасположенные пластины с 96-луночными планшетами U-bottom. В течение 24 ч образовались смешанные клеточные многоклеточные сфероиды (слева, справа), по одному в каждой лунке. Шкала шкалы = 500 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2 : Создание сердечной ткани с механической интеграцией сфероидов . 3D-биографияОтпечатанный кардиальный пластырь сразу после удаления из игольного массива с видимыми отверстиями иглы (слева). В это время границы между сфероидами уже стали нечеткими, и патч уже начал спонтанно биться, поэтому сфероиды стали механически интегрированы. Через три дня после удаления из игольчатого массива тканевые пустоты, вызванные иглой, заполнялись окружающей тканью (справа), и патч продолжал избивать спонтанно. Шкала шкалы = 1 мм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы признают следующие источники финансирования: Фонд Magic That Matters для сердечно-сосудистых исследований и Фонд исследований стволовых клеток штата Мэриленд (2016-MSCRFI-2735).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Defined Trypsin inhibitor 0.0125% | Thermo Fisher | R007100 | |
| RPMI Cell Media | Invitrogen | 11875-093 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) | Sciencell | 6310 | |
| Human umbilical vein endothelial cells | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates | Akita Sumitomo Bakelite Co. | MS-9096UZ | |
| Regenova Bio 3D Printer | Cyfuse Biomedical K.K. | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Troponin T Antibody | Thermo Fisher | 701620 | |
| Connexin 43 (Cx43) Antibody | Chemicon | MAB3068 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher | P36935 |
References
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
- Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16, 247-276 (2014).
- Patra, S., Young, V. A Review of 3D Printing Techniques and the Future in Biofabrication of Bioprinted Tissue. Cell Biochem Biophy. 74, 93-98 (2016).
- Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Eng Part B Rev. , (2017).
- Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomater. 31, 461-466 (2010).
- Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. J Heart Lung Transpl. 35, 137-145 (2016).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomater. 30, 2164-2174 (2009).
- Itoh, M., et al. Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D Printer Undergo Remodeling and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae. PloS One. 10, e0136681 (2015).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol Biol. 997, 45-56 (2013).
- Li, S., Cheng, H., Tomaselli, G. F., Li, R. A. Mechanistic basis of excitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+ spark characteristics: direct evidence of functional Ca2+-induced Ca2+ release. Heart Rhythm. 11, 133-140 (2014).
- Boheler, K. R., et al. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Rep. 3, 185-203 (2014).
- ScienCell Research Laboratories. Human Cardiac Fibroblasts (adult ventricular) Product Sheet. , https://www.sciencellonline.com/PS/6310.pdf (2017).
- Lonza Walkersville, Inc. Endothelial Cell Systems - Technical Information & Instructions.,. , http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf (2015).
- Thermo Fisher Scientific, Inc. Immunofluorescence Method for IHC Detection. , https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunofluorescence-method-ihc-detection.html (2017).
- Murata, D., et al. A preliminary study of osteochondral regeneration using a scaffold-free three-dimensional construct of porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Orthop Surg Res. 10, (2015).
- Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomed Mater. 10, 034002 (2015).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K., Hoying, J. B. Direct-write Bioprinting Three-Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res. Part B, Appl Biomater. 98, 160-170 (2011).
- Lee, J. M., Sing, S. L., Tan, E. Y. S., Yeong, W. Y. Bioprinting in cardiovascular tissue engineering: a review. International J Bioprinting. 2 (2016), (2016).
