Summary
Detta protokoll beskriver 3D bioprinting av hjärtvävnad utan användning av biomaterial. 3D bioprintade hjärtfläckar uppvisar mekanisk integration av komponent sfäroider och är mycket lovande vid hjärtvävnadsregenerering och som 3D-modeller av hjärtsjukdom.
Abstract
Detta protokoll beskriver 3D bioprinting av hjärtvävnad utan användning av biomaterial, med användning av endast celler. Kardiomyocyter, endotelceller och fibroblaster isoleras först, räknas och blandas vid önskade cellförhållanden. De odlas i enskilda brunnar i 96-brunnsplattor med ultra låga egenskaper. Inom 3 dagar, formar sfäroider form. Dessa sfäroider plockas sedan upp av ett munstycke med vakuumsugning och monteras på en nålmatris med en 3D bioprinter. Sfäroiderna får sedan smälta på nålstället. Tre dagar efter 3D bioprinting avlägsnas sfäroiderna som en intakt lapp, som redan spontant slår. 3D bioprintade hjärtfläckar uppvisar mekanisk integration av komponent sfäroider och är mycket lovande vid hjärtvävnadsregenerering och som 3D-modeller av hjärtsjukdom.
Introduction
Det finns många olika metoder för 3D bioprinting 1 , 2 , 3 . 3D bioprinting klassificeras ofta av tryckteknik 1 , med exempel som bläckstråle bioprinting, biobränsle för mikroekstrudering, laserassisterad bioprinting, en kombination av metoder eller nyare metoder. 3D bioprinting kan också klassificeras i byggnadsfria eller byggnadsberoende metoder 4 . De flesta metoderna för 3D bioprinting är byggnadsberoende, där det finns behov av biomaterial, t ex bioinks 5 eller byggnadsställningar 6 . Stillbildsberoende 3D bioprinting står inför många problem och begränsningar 4 , 7 , såsom immunogenicitet av byggnadsmaterial, kostnaden för proprietära bioinks, långsam hastighet och toxicitet för nedbrytningsprodukter.
SCAFVeckfri hjärtvävnadsteknik med användning av sfäroider har försökt 8 , med potential att övervinna dessa nackdelar med byggnadsberoende vävnadsteknik. Men som bekräftat av författarna i det här papperet hade det varit svårt att hantera och positionera sfäroider på fasta platser, i processen med biofabricering. Den samtidiga användningen av 3D bioprinting och sfäroidbaserad vävnadsteknik har potential att övervinna dessa svårigheter. I detta protokoll beskriver vi 3D bioprinting av hjärtvävnad utan andra biomaterial, med endast celler i form av sfäroider.
Byggnadsfria sfäroidbaserade 3D bioprinter 9 har förmågan att plocka upp enskilda sfäroider med vakuumsugning och placera dem på en nålställning. Begreppet positionering sfäroider på en nålställning i 3D bioprinting, är inspirerad av användningen av nålarrayer (känd som " kenzan ") i den gamla JapaNese konst av blomsterarrangemang, ikebana. Detta system gör att sfäroiderna kan placeras exakt i någon konfiguration och resulterar i att de individuella sfäroiderna smälter samman under en kort period för att skapa en 3D bioprintad vävnad. Denna metod möjliggör sålunda sfäroider att manipuleras med lätthet, med potentiella konsekvenser för framtiden för byggnadsfri organ biofabricering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av kardiomyocyter
- Generera och odla humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) på plattor med 6 brunnar belagda med basalmembranmatris enligt beskrivning 10 .
- Differensiera hiPSCs till hiPSC-härledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) med användning av tidigare beskrivna metoder 11 , 12 .
- På dag 19 efter differentiering isolerar kardiomyocyterna med 2 ml trypsin / EDTA 0,05% i varje brunn i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Övervaka kardiomyocyterna under ett optiskt mikroskop för att titta på celldissociation.
- Neutralisera trypsin med användning av 2 ml trypsininhibitor 0,0125%.
- Pool de isolerade kardiomyocyterna och överför dem till ett 50 ml koniskt rör med hjälp av ett motoriserat pipettfyllmedel.
- Centrifugera cellsuspensionen i 5 minuter vid 250 xg vid rumstemperatur för att erhålla en pellet.
- Resuspendera pelleten i 5 ml Roswell ParkMemorial Institute (RPMI) cellmedium kompletterat med B-27 (RPMI / B-27-cellmedia).
- Pipettera 20 μl celler i cellmedia och fläckar med en lika stor mängd 0,4% Trypan Blue-lösning.
- Använd en automatiserad cellräknare eller en manuell hemocytometer för att räkna upp och uppnå koncentrationen och cellens livsduglighet hos cellsuspensionen.
2. Framställning av fibroblaster
- Initiera celllinjen 13 av humant hjärtfibroblast (HCF) (vuxen ventrikulär typ).
- Passera och isolera dem i enlighet med HCF-odlingsprotokoll 13 .
- Pipettera 20 μl celler i cellmedia och fläckar med en lika stor mängd Trypan Blue-lösning 0,4%.
- Använd en automatiserad cellräknare eller en manuell hemocytometer för att räkna och uppnå koncentrationen och cellens livskraft hos den nya cellsuspensionen.
3. Framställning av endotelceller
- Inleda den mänskliga umbIlisk venet endotelcell (HUVEC) linje enligt beskrivning 14 . Passera och isolera dem i enlighet med HUVEC-odlingsprotokoll enligt beskrivning 14 .
- Pipettera 20 μl celler i cellmedia och fläckar med en lika stor mängd 0,4% Trypan Blue-lösning.
- Använd en automatiserad cellräknare eller en manuell hemocytometer för att räkna upp och uppnå koncentrationen och cellens livsduglighet hos cellsuspensionen.
4. Samkultur:
- Blanda de tre celltyperna (hiPSC-CM, HCF och HUVEC) i RPMI / B-27-cellmedia för att skapa ett lager av blandad celllösning i ett 50 ml koniskt rör, vid ett hiPSC-CM: HCF: HUVEC-cellförhållande 70:15:15 och koncentrationen av 165 000 celler per ml.
- Distribuera den blandade celllösningen till ultra-låga bifogade 96-brunnars U-bottenplattor vid 200 pl per brunn, eller 33 000 celler per brunn, med en flerkanalspipett.
- Inkubera plattorna med 96 brunnar i 3 dagar (37 ° C, 5% koldioxidIde, 95% fuktighet).
- Inspektera förekomsten av multicellulära sfäroider i blandade celler i mitten och botten av enskilda brunnar, under ljusmikroskopi.
OBS: I en tvådimensionell mikroskopisk projektion kommer dessa sfäroider att visas cirkulär i form ( Figur 1 ). Sfäroider bör bildas inom 24 timmar, efter cellsåtning i 96-brunnsplattor med ultra låga egenskaper. Sfäroider bör börja slå inom 48 timmar efter cellsåtning i plattor med 96 brunnar. Spheroider som inte slår bör inte användas för 3D bioprinting för att säkerställa att den slutliga 3D-bioprintade hjärtplåstret är funktionell. Immunofluorescens av sfäroider för connexin 43 (Cx43) och troponin kan användas för att bedöma sfäroid cellkomposition och kvalitet 15 .
5. 3D bioprinting av byggnadsfria hjärtvävnader
- Ladda plåtarna som innehåller sfäroiderna i tidningen på byggnadsfri sfäroidbaserad 3D-bioprinter.
- Slå på 3D-bioprinteren och kör 3D-bioprintingsprogrammet.
- Klicka på "Hjälp", "Driftberedning", "Inspektionsläge" och sedan "Hemreferens".
- Klicka på den gröna ikonen under "Start" för att starta sfäroid inspektion.
- Se till att sfäriska diametrar visas under kolumnen "(2) Dia (μm)" på skärmen.
- För att uppskatta den genomsnittliga sfäriska diametern till närmaste 100 μm klickar du på "Initial settings" och anger den genomsnittliga sfäriska diametern i Stack Z pitch (μm).
- Klicka på "Totalt", numret under "Lager" bör justeras automatiskt. Klicka på "Apply" för att bekräfta inställningarna.
- Klicka på "Needle Array Map", gå till "Layer No.", välj önskat lager för 3D bioprinting och dra önskad 3D bioprinting design på kartan till vänster på skärmen genom att välja enskilda sfäriska positioner. ClicK "Apply" för att bekräfta 3D bioprinting designen.
- Klicka på "Needle Array Check" för att påbörja nålmatningsinspektion. Om nålarrayen är ute av fokus, mata in värdena till "OffsetZ (μm)", från 0 till 500 μm för att justera kamerafokus, börjar med 500 μm och minska med 100 μm till 0 μm.
- Klicka på "Inspektionsparametrar", "Typ 1" och sätt "Diameter (μm)" till önskat diameterintervall. Ställ in "Roundness (%)" och "Smoothness (%)" till önskade procentandelar. Klicka på "Apply" för att bekräfta inställningarna.
OBS: Här sattes sfäriska diametrar från 450 μm till 550 μm. "Roundness (%)" och "Smoothness (%)" är datorberäknad bedömning av varje enskild sfäroid. Här är inställningarna som används för "Roundness (%)" 60% och "Smoothness (%)" är 70%. - Klicka på "Närvaro" och uppdatera "Diameter (μm)" till samma inställningS i föregående steg. Klicka på "Apply" för att bekräfta inställningarna.
- Klicka på "Stack Mode" och sedan den gröna ikonen under "Start" för att starta sfäroidplockning med hjälp av munstycket i 3D bioprinteren genom vakuumsugning och placering av sfäroider på specifika platser i en nålställning.
OBS! För en hjärtplåster som består av 81 sfäroider (9 sfäroider x 9 sfäroider), bör 3D bioprinting ta cirka 20 till 30 min. - Efter bioprinting, använd sterila tångar, plocka upp nålaruppsättningen som innehåller 3D bioprintad patch och överför den till en 250 ml steril bägare innehållande 150 ml RPMI / B-27 cellmedium.
- Inkubera den 3D bioprintade plåstret med nålstället i 3 dagar (37 ° C, 5% koldioxid, 95% fuktighet).
6. Avlägsnande av 3D Bioprinted Patch från Needle Array och Patch Maturation
- Efter 3 dagar inkubation, med ena handen vid basen av nålstället och den andra på plastkåpan under tHan lappar, skjut försiktigt plastlocket uppåt för att ta bort den 3D bioprintade plåstret från nålstället.
OBS: Smörjning med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kan appliceras på nålarna precis före detta steg, vid behov, för mjukare och lättare borttagning. - Använd ett par sterila tångar, plocka upp plastkåpan med den 3D bioprintade plåstret ovanpå och överför patchen och plastkåpan till en 35 mm skål som innehåller RPMI / B-27-cellmedia.
- Skaka försiktigt plastkåpan med plåstret i RPMI / B-27-cellmediet, med tången som fortfarande håller fast på plastskyddet för att släppa plåstret i media.
- Inspektera den 3D bioprintade plåstret under ljusmikroskopi för att visualisera huruvida det slår för att säkerställa att den 3D bioprintade plåstret är funktionellt.
- Inkubera den 3D bioprintade plåstret i 35 mm skålen i 3 dagar eller längre (37 ° C, 5% koldioxid, 95% fuktighet).
OBS: Efter 3 dagar smälter sfäroiderna ihop och hålen iPlåstret, där nålarna var, borde inte längre vara synliga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vid slutet av steg 4.4 (samkultur) borde cellerna i varje brunn sammantaget i botten av de ultra-låga bifogade 96-brunnars U-bottenplattorna för att bilda sfäroider genom gravitation. Dessa sfäroider innehåller hiPSC-CM, HCF och HUVEC, och kan inspekteras visuellt under ljusmikroskopi, där de ska visas cirkulära genom tvådimensionell projicering ( Figur 1 ). I slutet av steg 6.3 ska 3D-bioprintad hjärtplåster innehålla vävnadshåligheter på grund av nålhål som skapas av nålstället ( Figur 2 , vänster). Vid denna tidpunkt bör gränserna mellan sfäroiderna ha blivit otydliga och plåstret bör ha börjat slå spontant och uppvisa mekanisk integration av sfäroider. Vid slutet av steg 6.5 fylls vävnadshålen av omgivande vävnad ( Figur 2 , höger), medan 3D-bioprintad hjärtplåstret bör fortsätta att varaT spontant.
Figur 1 : Skapande av multicellulära sfärer med blandad cell. HiPSC-CM, HCF och HUVEC blandades vid ett hiPSC-CM: HCF: HUVEC-cellförhållande av 70:15:15, och cellblandningen fördelades i ultra-låga bifogade 96-brunnars U-bottenplattor. Inom 24 timmar bildades multicellulära sfäroider med blandade celler (vänster, höger), en i varje brunn. Skalstång = 500 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 : Skapande av hjärtvävnad som uppvisar mekanisk integration av sfäroider . En 3D bioTryckt hjärtplåster omedelbart efter borttagning från nålstället med synliga nålhål (vänster). Vid denna tidpunkt hade gränserna mellan sfäroiderna redan blivit otydliga och plåstret hade redan börjat slå spontant, varför sfäroiderna blivit mekaniskt integrerade. Tre dagar efter avlägsnandet från nålstället fylldes vävnadshålen som orsakades av nålstället av omgivande vävnad (höger), och plåstret fortsatte att slå spontant. Skala bar = 1 mm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Författarna bekräftar följande finansieringskällor: Magic That Matters Fund för kardiovaskulär forskning och Maryland Stamcellsforskningsfond (2016-MSCRFI-2735).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Defined Trypsin inhibitor 0.0125% | Thermo Fisher | R007100 | |
| RPMI Cell Media | Invitrogen | 11875-093 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) | Sciencell | 6310 | |
| Human umbilical vein endothelial cells | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates | Akita Sumitomo Bakelite Co. | MS-9096UZ | |
| Regenova Bio 3D Printer | Cyfuse Biomedical K.K. | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Troponin T Antibody | Thermo Fisher | 701620 | |
| Connexin 43 (Cx43) Antibody | Chemicon | MAB3068 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher | P36935 |
References
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
- Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16, 247-276 (2014).
- Patra, S., Young, V. A Review of 3D Printing Techniques and the Future in Biofabrication of Bioprinted Tissue. Cell Biochem Biophy. 74, 93-98 (2016).
- Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Eng Part B Rev. , (2017).
- Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomater. 31, 461-466 (2010).
- Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. J Heart Lung Transpl. 35, 137-145 (2016).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomater. 30, 2164-2174 (2009).
- Itoh, M., et al. Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D Printer Undergo Remodeling and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae. PloS One. 10, e0136681 (2015).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol Biol. 997, 45-56 (2013).
- Li, S., Cheng, H., Tomaselli, G. F., Li, R. A. Mechanistic basis of excitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+ spark characteristics: direct evidence of functional Ca2+-induced Ca2+ release. Heart Rhythm. 11, 133-140 (2014).
- Boheler, K. R., et al. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Rep. 3, 185-203 (2014).
- ScienCell Research Laboratories. Human Cardiac Fibroblasts (adult ventricular) Product Sheet. , https://www.sciencellonline.com/PS/6310.pdf (2017).
- Lonza Walkersville, Inc. Endothelial Cell Systems - Technical Information & Instructions.,. , http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf (2015).
- Thermo Fisher Scientific, Inc. Immunofluorescence Method for IHC Detection. , https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunofluorescence-method-ihc-detection.html (2017).
- Murata, D., et al. A preliminary study of osteochondral regeneration using a scaffold-free three-dimensional construct of porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Orthop Surg Res. 10, (2015).
- Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomed Mater. 10, 034002 (2015).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K., Hoying, J. B. Direct-write Bioprinting Three-Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res. Part B, Appl Biomater. 98, 160-170 (2011).
- Lee, J. M., Sing, S. L., Tan, E. Y. S., Yeong, W. Y. Bioprinting in cardiovascular tissue engineering: a review. International J Bioprinting. 2 (2016), (2016).
