Summary
Hier beschrijven we een protocol om antifungale activiteit van primaire menselijke immuuncellen te beoordelen in real-time met behulp van fluorescente Aspergillus reporter conidia in combinatie met live-cell video microscopie en flowcytometrie. Gegenereerde data inzicht in gastheer Aspergillus cel-interacties zoals fungicide werking, fagocytose, celmigratie remming van de schimmelgroei.
Abstract
Aspergillus fumigatus is een opportunistisch pathogeen, kan invasieve fungale infecties bij immuungecompromitteerde gastheren met een hoge case-sterftecijfer. Onderzoek onderzoekt immunologische responsen tegen A. fumigatus wordt beperkt door het gebrek aan consistente en betrouwbare tests voor het meten van de antischimmelactiviteit van immuuncellen in vitro. Een nieuwe methode beschreven voor de antischimmelactiviteit van primaire monocyten en neutrofielen door humane donoren tegen A. fumigatus Aspergillus behulp van fluorescente reporter (flare) conidia beoordelen. Deze conidia bevatten genetisch gecodeerde DsRed reporter, die constitutief levend FLARE conidia wordt uitgedrukt en worden extern gelabeld met Alexa Fluor 633, dat bestand is tegen afbraak in de fagolysosoom, waardoor een onderscheid tussen levende en dode A. fumigatus conidia. Video microscopie en flowcytometrie worden vervolgens gebruikt om de interactie te visualiserenion tussen conidia en aangeboren immuuncellen, beoordelen fungicide activiteit tevens wordt een schat aan informatie over fagocyten migratie, fagocytose en de remming van schimmelgroei. Deze nieuwe techniek heeft al interessante nieuwe inzichten in de gastheer-pathogeen interactie van primaire immuuncellen tegen A. fumigatus. Het is belangrijk dat het laboratorium setup vereist om deze analyse uit te voeren, met inbegrip van de nodige microscopie en flowcytometrie faciliteiten, en het vermogen om te werken met menselijke donor bloed en genetisch gemanipuleerde schimmels mee. Echter, deze test is geschikt voor het genereren van grote hoeveelheden data en kan gedetailleerd inzicht in de antifungale respons onthullen. Dit protocol is met succes gebruikt om de gastheer-pathogeen interactie van primaire immuuncellen tegen A. fumigatus bestuderen.
Het is belangrijk dat het laboratorium setup vereist om deze analyse uit te voeren, met inbegrip van de nodige microscopie mee en flowcytometrie facilities, en het vermogen om te werken met menselijke donor bloed en genetisch gemanipuleerde schimmels. Echter, deze test is geschikt voor het genereren van grote hoeveelheden data en kan gedetailleerd inzicht in de antifungale respons onthullen. Dit protocol is met succes gebruikt om de gastheer-pathogeen interactie van primaire immuuncellen tegen A. fumigatus bestuderen.
Introduction
Aspergillus fumigatus is een opportunistische pathogene schimmel en de meest voorkomende schimmelinfecties oorzaak van invasieve longinfecties in de immuungecompromitteerde gastheer 1, 2. Inzicht in hoe immuuncellen van de gastheer te herkennen en te elimineren Aspergillus is een belangrijk gebied van schimmel onderzoek is echter de momenteel beschikbare fungicide assays hebben aanzienlijke beperkingen. Gewoonlijk gebruikte werkwijzen voor het meten fungicide activiteit omvatten colorimetrische assays en bepaling kolonievormende eenheden 3, 4. Dergelijke werkwijzen verschaffen informatie over schimmel levensvatbaarheid op één tijdstip plaats is de dynamische interactie tussen gastheer en pathogeen. Dienovereenkomstig, kunnen deze methoden geen rekening houden met de vraag of een schimmel is gedood of gewoon (tijdelijk) beperkt in groei of metabole activiteit. We hebben een methode ontwikkeld die in staat is het observeren van fungici ontwikkelddal activiteit direct terwijl tegelijkertijd van informatie over fagocytose fagocyt migratie en remming van schimmelgroei.
Voorheen werd een protocol gepubliceerd middels real-time imaging als middel om fagocytose van Candida albicans meten door een muizen macrofaag cellijn 5. Dit concept is nu verder ontwikkeld het gebrek aan kennis in ons begrip van Aspergillus interacties met immuuncellen te pakken door gebruik Aspergillus fluorescente reporter (flare) conidia 6, 7, 8. Deze conidia drukken een rode fluorofoor (DsRed) en gelabeld met een tweede fluorofoor (Alexa Fluor 633). Zodra een FLARE conidium wordt gedood, stopt met het produceren van DsRed en de resterende DsRed verdwijnt, terwijl de AF633 fluorescerende en gebonden aan de conidia blijft. Hierdoor ontstaat een duidelijk onderscheid tussen levende en dode fuNGAL cellen tijdens live-cell imaging en flowcytometrie, en maakt het volgen van het lot van individuele conidia na hun interactie met immuuncellen.
De beschreven assays verschaffen een effectieve werkwijze voor het visualiseren van de interactie tussen immuuncellen van de gastheer en Aspergillus en grote waarde in het ontrafelen van de cellulaire signaleringspaden belast antifungale effector mechanismen aangeboren immuuncellen. Andere toepassingen omvatten visualiseren hoe veranderingen in Aspergillus groei, zoals de overgang van rustende gezwollen conidia, of gezwollen conidia tot hyphae beïnvloeden fagocyt herkenning en functie.
Het volgende protocol beschrijft in detail hoe menselijke monocyten en neutrofielen te verkrijgen; hoe de FLARE conidia voor te bereiden; en hoe ze hun reacties vastleggen met video microscopie en flowcytometrie. Hoewel het gebruik van humane immuuncellen geïsoleerd uit donorbloed hier, dit is beschreventechniek is even effectief gebleken met verschillende murine celpopulaties.
Protocol
Het protocol voor het verkrijgen van neutrofielen en perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) zijn gebaseerd op de eerder gepubliceerde werkwijzen 9. Het gebruik van bloedmonsters van gezonde vrijwilligers is goedgekeurd door het menselijk onderzoek ethische commissie van de Universiteit van Aberdeen. Voordat u begint zorg ervoor dat alle ethische goedkeuringen zijn in de plaats voor het tekenen van bloed van gezonde vrijwilligers en / of patiënten met het oog op de beschreven experiment. Houd cellen op ijs waar mogelijk om hun overlevingskansen te vergroten.
1. A. fumigatus Cultuur en voorwaarden
- Bereid glucose minimale agar medium, zoals beschreven 10.
- Media passen tot pH 6,5 met behulp van 1 M NaOH en autoclaaf bij 120 ° C gedurende 20 minuten.
- Laat afkoelen tot 65 ° C.
- Werken in een steriele zuurkast Giet 30 ml gekoelde medium in een T75 kolf en laat afkoelen op de hals van de fles rust op een 25 ml pipet create een agar helling.
- Streak uit de DsRed Af293- A. fumigatus belasting van de agar en incubeer gedurende 7 dagen bij 37 ° C + 5% CO2. Twee kolven duurt ongeveer 10 9 conidia op in 5 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) vooraf biotinylatie.
2. A. fumigatus Labeling en voorbereiding
Opmerking: Bij het uitvoeren van deze test voor het eerst bereiden de ouderlijke Af293- A. fumigatus stam. Monsters van beide stammen in microcentrifugebuizen en label slechts één van elke stam zoals hieronder beschreven. Dit zal toelaten dat een om de controle conidia te hebben met geen kleur en conidia met een enkele kleur, ofwel DsRed of AF633, om de installatie en apparatuur te testen.
- Oogst A. fumigatus conidia door onderdompeling van de kweek met 30 ml PBS + 0,05% Tween-80. Filtreer de verkregen suspensie door een 40 urn cel zeef in een 50 ml buis hyfenfragmenten verwijderen.
- Centrifuge bij 805 xg gedurende 10 minuten, verwijder het supernatant en was één keer in 20 ml steriel PBS. Pool conidia uit twee platen van dezelfde stam gedurende de wasstap.
- Na de wasstap, resuspendeer de pellet in 5 ml PBS en breng 1 ml porties van mondiale suspensie in microcentrifugebuizen. 1 ml suspensie van elke stam is meestal voldoende voor live cell imaging. Wikkel de overblijvende aliquots in folie en bewaar bij 4 ° C.
- Centrifuge monsters van mondiale suspensie bij 9300 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en verwijder supernatant. Resuspendeer de conidial pellet in 1 ml 0,05 M NaHCO3 pH 8,3.
- Bereid 10 mg biotine / 200 pl dimethylsulfoxide (DMSO) voorraadoplossing door reconstitutie 25 mg biotine in 500 ul DMSO. Voeg 10 ul biotine / DMSO stockoplossing aan de microcentrifugebuis, afdekking aluminiumfolie en incubeer gedurende 2 uur op een schudtafel bij 4 ° C.
- Aliquot de rest van de biotine / DMSO voorraad oplossing;n en invriezen bij -20 ° C voor gebruik in volgende experimenten.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 9300 x g en verwijder het supernatant. Resuspendeer de conidial pellet in 1 ml 100 mM Tris-HCl pH 8,0 gedurende 1 uur tot vrij zwevende biotine deactiveren.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 9300 x g en verwijder het supernatant. Was de pellet twee keer met 1 ml steriel PBS en resuspendeer de pellet in 1 ml PBS.
- Los 1 mg streptavidine-AF633 in 0,5 ml PBS om een 2 mg / ml voorraadoplossing te maken. Voeg 10 ul van 2 mg / ml streptavidine-AF633 per 1 ml mondiale suspensie en incubeer gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur op een schudtafel bedekt met aluminiumfolie. De resterende Streptavidine-AF633 kunnen worden ingevroren in porties voor toepassing in latere experimenten.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 9300 x g en verwijder supernatant. Resuspendeer de conidial pellet in 1 ml PBS en tel de conidia behulp van een hemocytometer bij een 1: 1000 verdunning (1: 100 en 1:10). Pas de conidial concentratie 3,6 x 10 6 / mL met CO2 onafhankelijke media, verpakken in folie en bewaar bij 4 ° C.
LET OP: De conidia zijn nu gemerkt met AF633 en flare conidia zal worden aangeduid. - Optioneel: als stimulatie met gezwollen conidia nodig, na het tellen conidia (stap 2,9), verdund conidia 7,2 x 10 6 / ml in gist stikstofbase (YNB) medium en voeg 500 ul mondiale suspensie en 4,5 ml YNB medium in een autoclaaf 50 mL Erlenmeyer kolf. Bedek en zet de kolf in een schudincubator (200 rpm bij 37 ° C) gedurende 6 uur.
- Breng het medium een 15 ml buis. Centrifugeer bij 805 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en eenmaal wassen in PBS. Centrifugeer opnieuw en resuspendeer pellet in 1 ml CO2 onafhankelijk medium, waardoor 3,6 x 10 6 conidia / ml.
Opmerking: Conidia vaak klonteren nadat ze opzwellen maken nauwkeurige telling moeilijk is, is het raadzaam om te berekenen met de counted aantallen rust conidia gebruikt.
- Breng het medium een 15 ml buis. Centrifugeer bij 805 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en eenmaal wassen in PBS. Centrifugeer opnieuw en resuspendeer pellet in 1 ml CO2 onafhankelijk medium, waardoor 3,6 x 10 6 conidia / ml.
3. Isolatie van humane neutrofielen en monocyten
- Trek 20 ml veneus bloed van gezonde vrijwilligers in twee 10 ml buisjes met bloed ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA). Voor elke donor afzonderlijk giet 20 ml bloed in een buis van 50 ml en verdund met 15 ml PBS.
- Onderlaag het bloed met 15 ml van een lymfocyt isolatieoplossing (dichtheid 1,077 g / ml) met een spuit en naald ijzer. Plaats de naald op de bodem van de buis en voorzichtig dwingen lymfocyten isolatieoplossing out. Centrifugeer bij 630 xg gedurende 20 min zonder remmen en lage versnelling.
- Bereid PBS, gekoeld op ijs.
OPMERKING: Stappen 3.4 en 3.5 worden gelijktijdig gevolgd om monocyten (3.4) en neutrofielen (3,5) te genereren. - Gebruik een pastette, verzamel dan het PBMC-laag. Dit is de laag in het midden tussen de gele serum (boven) en de transparante lymfocyten isolatieoplossing (onderste) laag enover in een verse 50 ml buis.
- De buis met de PBMC tot 50 ml met koude PBS en centrifugeer bij 582 xg gedurende 10 min. Verwijder het supernatant en tweemaal wassen met koud PBS en resuspendeer in 1 ml PBS per 20 ml donorbloed aanvankelijk gebruikt.
- Maak 1:10 verdunningen voor het tellen door toevoeging van 20 pi van de celsuspensie 160 pi PBS en 20 pl van trypan blauw. Tellen cellen met een hemocytometer.
- Bereid een bufferoplossing door toevoeging van 26 ml door warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS) en 2,1 ml 0,5 M EDTA en 500 ml HBSS. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 515 xg en resuspendeer in 40 pl bufferoplossing per 1 x 10 7 cellen.
- Breng de celsuspensie aan een 15 ml buis en voeg 10 ul CD14 microparels per 1 x 10 7 cellen, meng en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C, en zorg ervoor dat de buizen te mengen om de 5 min.
- Was de cellen door toevoeging van 1 ml bufferoplossing per 1 x 10 7 cellen en centrifuge bij 515 xg gedurende 10 min.
- Aspireren supernatant en resuspendeer helemaal tot 1 x 10 8 cellen in 500 pi bufferoplossing.
- Plaats 1 kolom per monster op een magnetische afscheider volgens de instructies van de fabrikant. Was eerst de kolom eenmaal met 500 pi bufferoplossing.
- Pipet 500 pi celsuspensie door de kolom, wacht de kolom drogen en wassen herhalen driemaal met bufferoplossing.
- Plaats een nieuwe 15 ml buis onder de kolom en neem de kolom van de magnetische scheider. Spoel vervolgens de cellen uit de kolom in de buis met 1 ml bufferoplossing.
- Voeg 4 ml buffer oplossing en centrifugeer bij 515 xg gedurende 10 min, en vervolgens resuspenderen in 1 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium.
- Maak 1:10 verdunningen voor het tellen door toevoeging van 20 pi van de celsuspensie 160 pi PBS en 20 pl van trypan blauw. Tel de cellen met eenhemocytometer.
- Pas de celconcentratie 6 x 10 5 / ml met RPMI en zaden 200 ui op een 35 mm glas-based imaging dish. Incubeer overnacht bij 37 ° C met 5% CO2.
- De volgende dag vóór beeldvorming verwijderen RPMI en voeg 200 ul van CO2 onafhankelijk medium.
Opmerking: Deze monocyten kan ook worden onderscheiden in verschillende macrofaag subsets voorafgaand aan de beeldvorming. Als dit is een techniek om ontdekt te worden, een uitstekend uitgangspunt is de recente paper van Ohradanova-Repic et al. 1 1.
- Na het oogsten van de PBMC laag, verwijder alle van het serum en de meeste lymfocyten isolatie oplossing, maar wees voorzichtig niet om de kleine witte band te verwijderen op de top van de rode pellet omdat dit het grootste deel van de neutrofielen zal bevatten.
- Bereid een 10x hypotone lysisbuffer voorraad door toevoeging van 83 g NH4Cl en 10 g KHCO3 in 1 liter steriel water. Bewaren bij 4 °C.
- Verdun deze voorraad 10x met steriel water en voeg deze toe aan de buizen. Vervolgens voorzichtig omkeren 3 keer en incubeer op ijs gedurende 15 minuten.
- Centrifugeer bij 394 xg gedurende 10 min en resuspendeer in hypotone lysisbuffer gedurende 10 minuten in ijs.
- Centrifugeer bij 394 xg en tweemaal wassen met koud PBS. Resuspendeer in 1 ml CO2 onafhankelijk medium per donor.
- Maak 1:10 verdunningen voor het tellen door toevoeging van 20 pi van de celsuspensie 160 pi PBS en 20 pl van trypan blauw. Tel de cellen met een hemocytometer.
- Voor flowcytometrie, dient de concentratie tot 6 x 10 5 / ml en voeg 400 ul celsuspensie aan een plaat met 24 putjes. Voor microscopie, voeg 200 ul van dezelfde celsuspensie 35 mm glas-based imaging dish.
Opmerking: neutrofielen beeldvorming of flowcytometrie dient onmiddellijk gestart vanwege hun neiging om apoptose te ondergaan als ongestimuleerde verlaten. Als dit niet mogelijk is neutrofielen moeten worden gehouden opijs en die zo snel mogelijk (binnen één dag).
4. Flowcytometrie
- Voeg 200 ul van 1,2 x 10 6 / ml FLARE conidia aan de cellen in de plaat met 24 putjes, en daarna van 20 ug / ml voriconazol voeg 100 ul. Voeg 300 ul van RPMI en incubeer gedurende 16 uur bij 37 ° C met 5% CO2.
OPMERKING: Voriconazol wordt toegevoegd aan conidial ontkieming te voorkomen. - Voeg 25 ul van een 1 mM Calcofluor-witte voorraadoplossing in elk putje om een uiteindelijke concentratie van 25 uM en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C met 5% CO2.
- Centrifugeer bij 582 xg gedurende 10 min. Verwijder het supernatant en tweemaal wassen met PBS.
- Hechtende cellen (monocyten) geoogst, voeg 1 ml PBS met 3 mM EDTA aan elk putje en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C met 5% CO2. Voorzichtig te wassen cellen van de plaat door pipetteren en het verzamelen van cellen in een buis.
- Was eenmaal in FACS buffer (2% foetaal kalfsserum naar PBS), en vervolgens hersuspenderen in FACS buffer voor FACS-analyse.
- Voor FACS-analyse, eerst de compensatie parameters van de stroom aan te passen cytometer en stel positieve poorten met behulp van één kleur compensatie buizen, met inbegrip van conidia met geen kleur: DsRed + conidia, AF633 + conidia en Calcofluor White + conidia (gegenereerd zoals in 4.2).
- Bevrijd conidia poort gebaseerd op voorwaartse en zijwaartse verstrooiing gebruiken conidia geen kleur. Set cellen hek aan voorwaartse en zijwaartse verstrooiing door het uitsluiten van de vrije conidia poort.
- Analyseer monsterbuisje door het opnemen van 10.000 gebeurtenissen.
OPMERKING: Cellen in verband met levende conidia zal worden DsRed + en AF633 +. Cellen in verband met dode conidia zal alleen AF633 +. Omstander cellen die niet zijn bezig conidia zal dsRed- en AF633-. De conidiën-actief celpopulaties worden verder geanalyseerd Calcofluor White-kleuring van de Pacific Blue kanaal. Conidia die buiten cellen blijven zal Calcofluor White + en conidia die zijn geïnternaliseerd zal zijnCalcofluor White-.
5. Live-Cell Video Microscopie
Opmerking: De keuze van de microscoop afhankelijk zijn welke lokaal beschikbaar is, maar de microscoop opstelling moet een omgekeerde fase wordt een klimaatkamer bij 37 ° C en geschikte excitatie / emissie filters gedurende DsRed (532/561 nm) en AF633 omvatten (633 nm). FLARE conidia werken niet met de 488 nm laser in plaats van de 532/561 nm laser voor DsRed. Bij het uitvoeren van dit experiment voor de eerste keer, via het bedieningspaneel van conidia geen kleur en een kleur te testen voor achtergrondfluorescentie en doordrukken tussen de DsRed en AF633 kanalen.
- Schakel de microscoop verwarming voorafgaand aan het experiment en voldoende tijd voor het milieu stuurkamer opwarmen tot 37 ° C. De duur kamertemperatuur stabiliseren zal variëren voor verschillende opstellingen microscoop.
- Schakel de microscoop en computer, en loadvertentie van de imaging software. Monteer de beeldvorming schotel op de microscoop podium en stel de focus naar de menselijke neutrofielen of monocyten vinden.
- Voor DsRed en AF633, stelt het laservermogen tot 10% en belichtingstijd op 1 s in de overname-instellingen.
- Verwijder de beeldeenheid glijbaan en voeg 100 ul van 3 x 10 6 / ml FLARE mondiale suspensie aan de geschikte putjes (totaal volume 300 ul / well). Noteer de tijd die flare conidia worden toegevoegd aan het gerecht.
- Zet de schuif naar het podium en aan te passen camera gevoeligheid voor DsRed en AF633 om duidelijk te zien de conidia maar niet overbelichten het beeld. Het opzetten van een podium punten lijst als multi-point acquisitie is vereist.
- Begonnen afbeelden wanneer alle punten in focus zijn de kanalen geoptimaliseerd en de cyclustijd en duur is ingesteld. Cyclustijd en duur van beeldvorming afhankelijk van de experimentele vraag. Het doel is om de cyclustijd zo kort mogelijk (≤2 min) 1 min houden waardoor diepgaande analyse van upgake dynamiek.
Representative Results
Representatieve resultaten worden volgens de methode beschreven protocol. Figuur 1 illustreert een representatieve 6 h levende cellen video met menselijke neutrofielen en flare conidia. DsRed (rood) wordt uitgedrukt door de conidia zichzelf terwijl ze zijn gemerkt met AF633 (Magenta).
Figuur 2 is een beeld van een enkel tijdstip van een soortgelijke film zoals weergegeven in figuur 1, het verschil tussen levende en dode FLARE conidia illustreren. Dead conidia worden onderscheiden van live-conidia door het verlies van hun DsRed (rood) signaal met behoud van een heldere AF633 (magenta) fluorescentie. A. fumigatus conidia vaak overleven in fagocyten voor meer dan 6 uur. Daarom, om effectief doden te kwantificeren, stromingscytometrie plots worden getoond voor een 16 uur incubatieperiode in figuur 3. Deze gegevens werden verkregen met een alveolaire macrofaag cell lijn als voorbeeld, maar kan worden uitgevoerd met elk celtype. In figuur 4 de migratie in het eerste uur van stimulatie van humane neutrofielen en hun snelheid en gerichte beweging. Figuur 5 toont het percentage neutrofielen en monocyten die 1, 2, 3 of meer conidia zijn opgenomen terwijl figuur 6 toont het aantal conidia die ontkiemen in hyfen.
Figuur 1: live-cell video microscopie film van menselijke neutrofielen en flare conidia. Neutrofielen werden geïsoleerd uit menselijk bloed en samen geënt met conidia FLARE in CO2 onafhankelijk medium in een verhouding van 1: 3 respectievelijk. Visualisatie werd direct gestart bij 37 ° C met een draaiende schijf confocale microscoop. Beelden werden vastgelegd met 1 min en 55 s intervallen gedurende een periode van 6 uur. Schaalstaaf = 10 urn.Een ingezoomd video wordt getoond met de kanalen gescheiden om de rol van de FLARE conidia met DIC te verduidelijken in de linkerbovenhoek, DsRed (rood) in de rechterbovenhoek, AF633 (groen) in de linkerbenedenhoek en de samengevoegde video in de rechterbenedenhoek . Klik hier om deze video te downloaden.
Figuur 2: beeld Enige tijdstip te tonen het verschil tussen levende en dode FLARE conidia. Menselijke neutrofielen werden gestimuleerd met FLARE conidia en afgebeeld met een draaiende schijf confocale microscoop. Een beeld werd genomen uit de gegenereerde films. Dode conidia worden onderscheiden van hyfen hun DsRed (red: rechtsboven) verloren signaal behoud van hun AF633 fluorescentie (groen: linksonder). Klik hier om bekijk een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Het kwantificeren en validatie van fagocytose en het doden van A. fumigatus conidia. Muizen alveolaire macrofaag cellen (MH-S) werden geïncubeerd met FLARE conidia bij een 1: 1 ratio gedurende 16 uur in aanwezigheid van voriconazol. MH-S cellen geassocieerd met levende conidia wordt in rode poort (DsRed + + AF633). MH-S cellen geassocieerd met dode conidia wordt in de blauwe poort (DsRed-AF633 +). Omstander MH-S cellen zijn weergegeven in de gouden poort. Calcofluor White, een cel-impermeabele fluorescente kleurstof die zich bindt aan de schimmelcelwand wordt gebruikt om extracellulaire conidia (Calcofluor White +) uit intracellulaire conidia (calcofluor White-) onderscheiden. Als extra bevestiging aan de werkwijze wordt getoond dat een behandeling met 2 uM cytochalasine D remt conidial opname door MH-S cellen.e.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig3large.jpg">Please klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: migratie van humane neutrofielen en monocyten tegen A. fumigatus conidia. Neutrofielen werden geïsoleerd uit menselijk bloed en samen geënt met conidia FLARE in CO2 onafhankelijk medium in een verhouding van 1: 3 respectievelijk. Visualisatie werd direct gestart bij 37 ° C met een draaiende schijf confocale microscoop. Beelden werden vastgelegd met 1 min en 55 s intervallen gedurende een periode van 6 uren. Migratie van alle individuele menselijke neutrofielen per gebied werd handmatig bijgehouden via tracking software tegen rustend (A) en gezwollen (B) conidia gedurende 1 uur. Gegevens vertegenwoordigen 1 kader van cellen voor elke omstandigheid van dezelfde donor. De meanderende factor (C), een maat directional beweging en snelheid (D) werden vervolgens gekwantificeerd met behulp van dezelfde software. Gemiddelde ± SEM voor 3 donoren zijn getoond met 30 cellen per donor via 2 onafhankelijke experimenten. *: P <0,05 (Welch gecorrigeerde t-test). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Fagocytose van A. fumigatus conidia door humane neutrofielen en monocyten. Neutrofielen en monocyten werden geïsoleerd uit menselijk bloed en samen geënt met conidia FLARE in CO2 onafhankelijk medium in een verhouding van 1: 3 respectievelijk. Visualisatie werd direct gestart bij 37 ° C met een draaiende schijf confocale microscoop. Beelden werden vastgelegd met 1 min en 55 s intervallen gedurende een periode van 6 uur. Fagocytose werd gemeten als de hoeveelheid cellen bevattening FLARE conidia na 4 uur stimulatie. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM van 3 donoren en 3 beelden per donor via 2 onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Remming van de ontkieming van A. fumigatus conidia door neutrofielen en monocyten. Neutrofielen en monocyten werden geïsoleerd uit menselijk bloed en samen geënt met conidia FLARE in CO2 onafhankelijk medium in een verhouding van 1: 3 respectievelijk. Visualisatie werd direct gestart bij 37 ° C met een draaiende schijf confocale microscoop. Beelden werden vastgelegd met 1 min en 55 s intervallen gedurende een periode van 6 uren. Remming van fungale kieming werd onderzocht door meting van het percentage conidia die kiem hadinated na 2, 4 en 6 uur van tezamen kweken. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM van 3 donoren en 3 beelden per donor via 2 onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Deze methode beschrijft een innovatief in vitro werkwijze om de antischimmelactiviteit van humane primaire fagocyten tegen A. fumigatus Aspergillus behulp van fluorescente reporter (flare) conidia, live cell imaging bestuderen en flowcytometrie. Eerdere studies hebben de toegevoegde waarde van het gebruik GLOED conidia zowel in vivo in murine experimentele schimmelinfectie en in vitro beoordeling van antifungale immuniteit 6, 7 getoond. De combinatie van FLARE conidia met deze volgende generatie live cell imaging techniek maakt het mogelijk om een opstelling om de levensvatbaarheid van de afzonderlijke conidia te meten tijdens de dynamische interacties in vitro.
De beschreven werkwijze heeft het potentieel om de specifieke rol en het belang van bepaalde cellulaire processen immuuncellen te onderzoeken op hun antifungale reacties. Daarnaast antifungale reacties van fagocyten uit bepaalde patiënten die lijden aangedefinieerd enkele component defecten in het immuunsysteem kan nader worden onderzocht. Zeer vroeg en eerste antifungale reacties kunnen worden bestudeerd in detail dan 6 uur continue beeldvorming. Dit maakt zelfs subtiele verschillen te detecteren, zoals de snelheid van fagocyt migratie naar de schimmel, internalisatie tarieven, dynamica van fungicide gebeurtenissen 12, die niet te onderscheiden zou zijn met gebruikelijke werkwijzen fagocytose.
Elk type cel zou kunnen worden gebruikt met deze methode; de celtypen die hier gebruikt werden gekozen omdat deze fagocyten de eerste en tweede lijnen van verdediging in de menselijke luchtwegen vormen tegen A. fumigatus 13. Interessant is dat zeer duidelijke verschillen worden waargenomen tussen hoe monocyten en neutrofielen grijpen rust en gezwollen sporen en hyfen. Monocyten nauwelijks migreren naar conidia, terwijl neutrofielen veel meer trekkende activiteit vertonen. Aanvullende fluorescerende markers zoals live-dead merkers op immuuncellen kunnen worden opgenomen in de test om inzicht te krijgen in de fagocyt overleving na interacties met Aspergillus te bieden. Interessante potentiële toekomstige toepassingen van deze technologie omvatten de co-kweek van verschillende types gastheercel, de gevolgen van antifungale reacties (bijvoorbeeld macrofagen op epitheliale monolaag, monocyt-afgeleide dendritische cellen met neutrofielen) en real-time meting van reactieve zuurstofspecies productie of neutrofielen extracellulaire vorming omzeilde stimulatie met Aspergillus.
Enkele punten moeten worden opgemerkt bij het protocol, vooral de laboratoriumopstelling vereiste gebruikt: een microscoop met een omgekeerde fase, een klimaatkamer stabiel bij 37 ° C en excitatie / emissie filters voor DsRed (532/561 nm) en AF633 ( 633 nm). Het vermogen van de microscoop om de cellen in focus te houden en verder de olie-immersie (vooral relevant in multi-puntacquisitiesnelheid) moeten periodiek worden gecontroleerd door de lange duur van de beeldvorming. Voor kwantificering van fungicidale activiteit flowcytometrie voorzieningen nodig zijn. Bovendien moeten passende institutionele en ethische goedkeuringen worden in de plaats om te werken met een gezonde donor en patiënt afgeleid bloedmonsters en genetisch gemanipuleerde schimmels. Het wordt sterk aanbevolen om bloedmonsters vers (gebruik op dezelfde dag) gebruiken om de levensvatbaarheid van de cellen te verhogen en het behoud van functionaliteit. Idealiter wordt de isolatie van cellen onmiddellijk na het trekken van de bloedmonsters en neutrofielen worden afgebeeld onmiddellijk na isolatie.
Tot slot, een nieuwe generatie live cell imaging techniek om te beoordelen in de kleinste details fagocytensysteem antifungale activiteit tegen A. fumigatus wordt beschreven. Deze technologie kan een uniek inzicht in individuele cel-schimmel interacties in het begin van aangeboren afweer tegen Aspergillus.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de MRC en de Universiteit van Aberdeen (MRC Centrum voor Medische Mycologie) en door de Wellcome Trust Strategische Award - Medische Mycologie Schimmel Immunology (SFB, JMB, JK, AW). Een speciale dank gaat uit naar de steun van de Chloe fonds. TMH wordt ondersteund door een subsidie van de National Institute of Health (NIH, code RO1 093.808) en het Memorial Sloan Kettering Cancer Center wordt ondersteund door NIH-subsidie P30 CA008748. Bovendien TMH een onderzoeker bij de Pathogenese van Infectious Disease ondersteund door Burroughs Wellcome Fund. Wij willen de Aberdeen Microscopie en Histologie Facility bedanken voor hun hulp en steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma | G6279 | http://www.sigmaaldrich.com |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658 175 | http://www.greinerbioone.com/ |
| PBS | Gibco | 20012-019 | https://www.thermofisher.com/ |
| Tween-80 | Fisher Scientific | 10592955 | https://nl.fishersci.com/ |
| 40 µm filter | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | https://www.thermofisher.com/ |
| 15 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 188 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| 50 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 227 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| MilliQ | Millipore | QGARD00R1 | Nanopure water works similarly. http://www.merckmillipore.com/ |
| Biotin | Molecular Probes | B-6352 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| DMSO | Sigma | D5879 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Streptavidin-AF633 | Molecular Probes | S-21375 | AF633 is the only tested fluorophore so far that remains visible in phagosomes. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| EDTA blood tubes | Greiner Bio-One | 455036 | Any blood tubes with an anti-coagulating agent should work. http://www.greinerbioone.com/en/start/ |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | http://www3.gehealthcare.com/ |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | SV3008401 | https://www.thermofisher.com/ |
| HBSS | Gibco | 14170112 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CD14 microbeads | Myltenyi Biotec | 130-050-201 | Other monocyte isolation methods can be used as well, we prefer this method as it gives a consistent high purity of monocytes without being labor intensive. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| MS Columns | Myltenyi Biotec | 130-042-201 | See comment at CD14 microbeads. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| RPMI + Glutamax | Gibco | 72400-021 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CO2 independent medium | Thermo Fisher Scientific | 18045054 | Necessary if there is not sufficient CO2 exchange during imaging. https://www.thermofisher.com/uk/en/home |
| µ-slide 8 well glass bottom | Ibidi | 80827 | This is the imaging dish that we use, however any glass imaging dish of proper size should work. http://ibidi.com/ |
| UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System | Perkin Elmer | L7267000 | Includes volocity software for acquisition and analysis. http://www.perkinelmer.com/ |
| Calcofluor white | Sigma | 18909 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Voriconazole | Sigma | PZ0005 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| BD LSRII | BD Biosciences | Flowcytometer used. https://www.bdbiosciences.com/ |
References
- Kosmidis, C., Denning, D. W. The clinical spectrum of pulmonary aspergillosis. Thorax. 70 (3), 270-277 (2015).
- Warris, A. The biology of pulmonary Aspergillus infections. J Infect. 69 (Suppl 1), S36-S41 (2014).
- Henriet, S. S., et al. Human leukocytes kill Aspergillus nidulans by reactive oxygen species-independent mechanisms. Infect Immun. 79 (2), 767-773 (2010).
- Sheppard, D. C., et al. Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis. Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. J Vis Exp. (71), e50196 (2013).
- Heung, L. J., Jhingran, A., Hohl, T. M. Deploying FLAREs to Visualize Functional Outcomes of Host-Pathogen Encounters. PLoS Pathog. 11 (7), e1004912 (2015).
- Jhingran, A., et al. Tracing conidial fate and measuring host cell antifungal activity using a reporter of microbial viability in the lung. Cell Rep. 2 (6), 1762-1773 (2012).
- Espinosa, V., et al. Inflammatory monocytes orchestrate innate antifungal immunity in the lung. PLoS Pathog. 10 (2), e1003940 (2014).
- English, D., Andersen, B. R. Single step separation of red blood cells, granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradient of ficoll hypaque. J Immunol Met. 5 (3), 249-252 (1974).
- Shimizu, K., Keller, N. P. Genetic involvement of a cAMP-dependent protein kinase in a G protein signaling pathway regulating morphological and chemical transitions in Aspergillus nidulans. Genetics. 157 (2), 591-600 (2001).
- Ohradanova-Repic, A., Machacek, C., Fischer, M. B., Stockinger, H. Differentiation of human monocytes and derived subsets of macrophages and dendritic cells by the HLDA10 monoclonal antibody panel. Clin Transl Immunology. 5 (1), e55 (2016).
- Lewis, L. E., et al. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69 (3), 617-631 (1982).
