A investigação do tráfico de membranas é crucial para a compreensão das funções neuronais. Aqui, introduzimos um método para quantificar a motilidade vesicular nos neurónios. Este é um método conveniente que pode ser adaptado para a quantificação do tráfico de membrana no sistema nervoso.
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Artigo de método
Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes
Neste artigo
Resumo
Resumo
No cérebro, os sistemas de tráfico de membrana desempenham papéis importantes na regulação de funções neuronais, como morfologia neuronal, plasticidade sináptica, sobrevivência e comunicações gliais. Até à data, numerosos estudos têm relatado que defeitos nestes sistemas causam várias doenças neuronais. Assim, a compreensão dos mecanismos subjacentes à dinâmica das vesículas pode fornecer pistas influentes que poderiam auxiliar no tratamento de vários distúrbios neuronais. Aqui, descrevemos um método para quantificar motilidades de vesículas, tais como a distância de motilidade e a velocidade de movimento, utilizando um plug-in de software para a plataforma ImageJ. Para obter imagens para quantificação, marcamos estruturas de endossomas neuronais-lisossomas com proteínas marcadoras de vesículas marcadas com EGFP e observamos o movimento de vesículas usando uma microscopia de lapso de tempo. Este método é altamente útil e simplifica a medição da motilidade vesicular em neurites, tais como axônios e dendritos, bem como no soma de ambos os neurônios e células gliais. MaismoRe, este m�odo pode ser aplicado a outras linhas celulares, tais como fibroblastos e c�ulas endoteliais. Esta abordagem poderia fornecer um avanço valioso da nossa compreensão do tráfico de membrana.
Introdução
O controle preciso do tráfico de endossomas-lisossomos é indispensável para a regulação da função neuronal. Notavelmente, os movimentos dinâmicos destas vesículas são um factor chave subjacente à regulação da morfologia neuronal, desenvolvimento e sobrevivência. Defeitos neste sistema causam graves distúrbios neuronais 1 , 2 . Os mecanismos moleculares que ligam o tráfico de vesículas a doenças neuronais são considerados complicados, e vários grupos têm procurado examinar essa relevância. Por exemplo, foi relatado que a motilidade endosómica tardia perturbada está significativamente associada com a doença
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Protocolo
Todos os procedimentos com animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Tsukuba (IACUC).
1. Dissecção
- Para preparar os fetos embrionários do dia 13-14 ICR ou C57BL / 6, eutanásia camundongos grávidas por deslocamento cervical. Remova o útero e coloque-o em uma placa de Petri com Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Enxaguar bem para remover o sangue.
- Usando fórceps, transferir o útero para uma nova placa de Petri com etanol a 70% para esterilizar.
- Transferir o útero para uma nova placa de Petri com HBSS. Remova os fetos do útero usando fórceps de dis....
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Resultados
Este ensaio foi concebido para medir a dinâmica das vesículas em culturas in vitro . Este ensaio foi utilizado para determinar a motilidade vesicular associada com morfologia neuronal e sobrevivência. As Figuras 1A e B apresentam dados representativos que mostram a motilidade dos lisossomas nos neurónios. Os neur�ios corticos foram transfectados com o marcador de lisossoma, LAMP-EGFP, e observados utilizando um microsc�io de fluores.......
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Discussão
Este protocolo introduz o procedimento para quantificar a motilidade vesicular. Nos neurônios primários, os endossomos e os lisossomos tendem a apresentar alta motilidade em neurônios mais jovens (4-6 DIV). Dado que os neurônios devem fornecer alguns componentes para os bordos de ataque para alongar os processos neurais, o tráfico de membranas deve ocorrer dinamicamente durante esta fase. Assim, é importante usar neurônios mais jovens para observar a motilidade dinâmica em dendritos neuronais. Além disso, vesículas maio.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Ricardo Dolmetsch (Faculdade de Medicina da Universidade de Stanford, afiliação atual: Novartis Institutes for Biomedical Research) por ajudar a desenvolver essa análise e ao Dr. Matthew Wood, Takuma Aihara e Dongsook Kim por sua leitura crítica do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Meio neurobasal | Thermo Fisher | 21103-049 | |
| Meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Meio livre |
| de soro Solução salina balanceada de Hank (HBSS) | Thermo Fisher | 14170112 | |
| Penicilina Estreptmicina | Thermo | Fisher 15140122 | |
| L-Glutamina | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 Suplementos | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2,5% de tripsina | Thermo Fisher | 15090046 | |
| bromidrato de poli-D-lisina (PDL) | Sigma | P7280 | |
| Poli-L-Ornitina (PLO) | Filtro | ||
| Corning | 431750 | ||
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Reagente de transfecção |
| Polietilenoimina "Max" (PEI) | policiências | 24765 | Reagente de transfecção. Como alternativa ao Lipofectamine2000, está disponível 0,1 mg / mL de polietilenoimina dissolvida em água esterilizada. Mas é baixa eficiência e alta toxicidade. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| Sistema de incubação INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism versão 6.0 | GraphPad Software | NA | |
| Excel versão 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ verion 1.47 | NA | NA |
Referências
- Nicot, A. S., Laporte, J. Endosomal phosphoinositides and human diseases. Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Mendelian disorders of membrane trafficking. N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).
- Lebrand, C.
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Reimpressões e permissões
