在不同遗传背景下对单个野生型视网膜前体细胞进行活体追踪，可评估细胞非自主性信号在神经发生过程中的作用。本文结合基因敲低、通过胚胎移植构建嵌合体以及 体内 采用延时共聚焦成像技术实现此目的。
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本文内容
摘要
摘要
遗传学和实验技术上的优势使斑马鱼成为研究基因操作后果的关键模式脊椎动物 体内 在快速发育期间，可研究多种过程，包括细胞增殖、基因表达、细胞迁移和形态发生。重要的是，通过移植技术可轻松生成嵌合体，从而实现对单个细胞在宿主环境影响下的嵌合标记与追踪。例如，通过结合对宿主胚胎的功能性基因操作例如， 通过吗啉寡聚核苷酸显微注射和活体成像，可评估外源性、非细胞自主信号（由遗传修饰的环境提供）对单个移植供体细胞的影响。本文展示了如何利用该方法比较不同遗传背景宿主环境中荧光报告基因表达的起始时间，以此作为细胞命运决定时机的间接指标。
本文中，我们提供了对斑马鱼胚胎进行显微注射以标记供体细胞并在宿主胚胎中实现基因敲降的实验方案，描述了用于制备嵌合胚胎的移植技术，以及制备和运行相关实验的步骤 在体 多胚胎延时共聚焦成像。特别是，在比较基因表达起始等事件的时间进程时，多位置成像至关重要。这需要同时对多个对照组和实验组胚胎进行数据采集。只要能够根据已建立的胚胎命运图谱准确定位移植位置，该方法可轻松拓展应用于任何适合活体成像的器官或组织中外源性影响因素的研究。
引言
可视化重要发育过程的能力在一种 体内 脊椎动物的特性使得斑马鱼成为研究正常生理和疾病状态的关键模型（综述见 1,2特别是神经视网膜作为中枢神经系统中易于获取的部分，因其结构高度有序且相对简单，以及在脊椎动物物种间高度保守的神经元类型，适合用于神经发生研究。 3细胞行为的动态过程，如增殖、细胞周期退出、不对称细胞分裂、命运决定、分化以及神经环路形成，可在整个视网膜发生过程中进行追踪，斑马鱼中央视网膜的这一过程在受精后3天（dpf）即已完成 4,5,6,7.
此外，可以在斑马鱼视网膜中同时评估上述各个阶段中不同基因的功能需求，这一优势优于其他脊椎动物模型——在那些模型中，基因敲除技术所导致的表型只能通过固定组织的死后检查进行评估。特别是利用转基因品系，我们可以在视网膜中可视化并监测荧光蛋白作为报告基因的表达，从而获得与特定神经元细胞类型发生相关的基因表达时间分辨率。由于斑马鱼发育迅速，这些事件可在整个发育期间被实时观察，从而更深入地揭示基因表达在....
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方案
所有操作均按照澳大利亚国家卫生与医学研究委员会关于动物护理和使用的实践准则进行，并经机构伦理委员会批准。
1. 斑马鱼的准备
- 成年鱼配对
- 在使用前一晚，将成年鱼以单对（或两对）的形式放入适当大小的繁殖缸中。
- 为防止雌鱼与雄鱼接触，使用隔板将其分隔开，但允许彼此可见。
- 次日早晨开灯后，移除隔板，让鱼自由交配，期间避免干扰。
- 成功交配后，将成年鱼放回其原始饲养缸中。
注：宿主与供体品系可以相同，例如，任意野生型（WT）品系。本研究中，供体胚胎来源于转基因品系 Tg(atoh7:gapRFP)、Tg(atoh7:gapGFP) 或 Tg(vsx1:GFP)，这些品系中命运决定因子的表达可分别用于可视化早期或晚期神经命运 14,15,16。为比较不同遗传环境的影响，宿主胚胎可采用特定的突变体或形态发生抑制子（morphant），如下文所述。
- 胚胎收集
- 使用茶筛从繁殖盒中收集卵子。每15分钟检查一次卵子，以确定产卵时间，并确保收集到....
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结果
本研究提出了一种实验方案，用于评估野生型视网膜前体细胞在形态干扰宿主胚胎内发育时基因表达时序的变化。实验组宿主胚胎为Ptf1a形态干扰体，其视网膜中缺乏中间生成的水平细胞和无长突细胞中间神经元7,26。对照组宿主胚胎则注射了标准对照吗啉代寡核苷酸，用于与实验组进行比较。
由于中枢神经系统（包括视网膜）中不同类型的神经元发生具有高度保守的组织发生顺序27,28,29,30,31，后续细胞命运的进展可能依赖于早期出生神.......
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讨论
了解邻近细胞在多大程度上影响关键细胞命运决定因子表达的时间，对于高效指导胚胎干细胞或诱导性多能干细胞分化为特定的终末分化细胞类型甚至模式化组织至关重要。此外，在活体动物的发育细胞中研究这些分子事件，还能提供与这些事件相关的特定细胞环境的动态（时间和空间）信息。 体内此类研究在所有脊椎动物模型中均难以轻易实现。
在本方案中，利用易于操作的斑马鱼胚胎作为脊椎动物模型，在体内研究脊椎动物视网膜这种结构相对简单但高度有序的三维组织中的相关问题。in vivo。以验证一个假说为例：耗竭某一特定视网膜细胞类型会影响视网膜前体细胞的基因表达时序和发育命运。我们还可以利用供体细胞标记物进行逆向追踪，以评估特定细胞在转基因表达之前多久经历了最后一次分裂，或评估该细胞在不同环境中转基因表达之前各个阶段的总体行为（例如，迁移）。针对这些研究，本文介绍了一系列相对易于操作的技术组合，包括吗啉代介导的基因敲低、细胞移植和活体成像。在移植方法方面，本方案提出了一种新型、相对简便且成本较低的移植装置，并展示了该操作系统的便捷性。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了澳大利亚研究委员会发现早期职业研究员项目（ARC DECRA）对 PRJ 的资助（DE120101311）以及德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG）对 LP 的研究资助（PO 1440/1-1）。澳大利亚再生医学研究所得到了维多利亚州政府和澳大利亚联邦政府资金的支持。我们感谢 Jeremy Ng Chi Kei 博士，本文所述实验由其完成，相关内容已发表于 Kei 等，2016年。我们感谢Higashijima教授提供的转基因鱼，感谢Turner教授和Rupp教授提供pCS2+质粒，感谢Wilkinson博士构建H2B-RFP和H2A-GFP载体。我们感谢莫纳什大学FishCore设施工作人员对实验动物的悉心照料。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖 | Bioline | BIO-41025 | 琼脂糖包被培养皿可提前数日制备，用封口膜密封以防止干燥，并于4 °C保存 |
| 低熔点琼脂糖 | Sigma | A9414-100G | 可制备较大体积，微波加热溶解后置于40 °C水浴中维持液态。可分装为1 mL等份（每份用于一组胚胎的固定） |
| 无丝硼硅酸盐玻璃毛细管 | SDR Scientfic | 30-0035 | 可使用直径相似的替代品 |
| 带丝硼硅酸盐玻璃毛细管 | SDR Scientfic | 30-0038 | 可使用直径相似的替代品 |
| 玻璃培养皿（60 mm直径） | Science Supply | 1070506 | 可使用任意尺寸的玻璃替代品 |
| 注射管（2 m） | Eppendorf | 524616004 | 在移植过程中连接针头夹持器与注射器 |
| 显微注射模具（带楔形突起的塑料模具） | Adaptive Science Tools | PT-1 | 可使用形状相似的替代品 |
| 微针夹持器 | Narishige | M-152 | 可使用任何适配注射针外径的替代品 |
| 显微注射仪 | Narishige 或 Eppendorf Femtojet | 使用气体压力的气动注射仪 | |
| 显微操作器 | Coherent Scientific | M330IR | 可使用类似替代品 |
| 微量加样吸头 | Eppendorf | 5242956003 | |
| 矿物油 | Sigma | M5904-500ML | |
| 拉针仪 | Sutter Instruments | Model P-2000 | 本实验所用拉针参数为：H 430，Fil 4，Vel 50，Del 225，Pul 75。只要能获得合适针尖尺寸，任何拉针仪均可使用 |
| 封口膜 | Interpath | PM996 | 任何石蜡膜均可 |
| 塑料巴斯德吸管 | Samco Scientific | 202 | |
| 玻璃巴斯德吸管 | Hirschmann Laborgeraete | 9260101 | |
| 蛋白酶K | Sigma | P5942-25MG | 蛋白酶XIV型 |
| N-苯基硫脲 | Sigma | P7629-25G | PTU具有毒性，可配制成储备液以避免频繁接触粉末，购买或使用前请查阅材料安全数据表（MSDS） |
| Qiaquick凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28704 | 可使用任何可用于纯化DNA的替代试剂盒 |
| RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74104 | 可使用任何可用于纯化RNA的替代试剂盒 |
| SP6 mMessage体外转录试剂盒 | Qiagen | AM1340 | 可使用任何可用于SP6介导DNA转录的替代试剂盒 |
参考文献
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO pra....
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