Summary
G4 Resolvase1 נקשר G-quadruplex (G4) מבנים עם זיקה המדווחת ההדוקה עבור חלבון G4 מחייב ומייצג את מרבית הפעילות ההתרה G4-DNA בתאים הלה. אנו מתארים פרוטוקול רומן שמנצל את הזיקה ופעילות התרה תלויה ATP של G4-Resolvase1 לטהר במיוחד קטליטית G4R1 רקומביננטי הפעיל.
Abstract
מהסוג-הגבוה-יותר מבני חומצות גרעין בשם G-quadruplexes (G4S, מבני G4) עלול להצטבר באזורים עתיר גואנין הוא DNA ו- RNA והם מאוד יציבות תרמית. ישנם> 375,000 רצפים G4 יוצרי המשוערת בגנום האנושי, והם מועשרים באזורי אמרגן, אזורים מתורגמים (UTRs), ובתוך חוזרי telomeric. בשל פוטנציאל מבנים אלה כדי להשפיע על תהליכים תאיים, כגון שכפול שעתוק, התא התפתח אנזימים כדי לנהל אותם. אנזים אחד כזה הוא G4 Resolvase 1 (G4R1), אשר היה שותף מאופיין ביוכימית ידי מעבדה שלנו Nagamine et al. , ונמצא שהיא נקשרת בצורה חזקה ביותר לשני (ד K בטווח הנמוך-PM) G4-דנ"א G4-RNA. G4R1 הוא המקור של רוב הפעילות-בפתרון G4 lysates התא הלה ומאז היה מעורב לשחק תפקיד במטבוליזם הטלומרים, פיתוח הלימפה, שעתוק גנים, hematopoiesis, ומעקב חיסוני. יכולת EFficiently להביע ולטהר קטליטית פעילה G4R1 היא בעלת חשיבות למעבדות מעוניינות להשיג תובנה נוספת לתוך האינטראקציה הקינטית של מבני G4 ואנזימים-בפתרון G4. כאן אנו מתארים שיטה מפורטת לטיהור רקומביננטי G4R1 (rG4R1). ההליך המתואר משלב את טיהור הזיקה המבוססת המסורתית של אנזים היסטידין מתויג בטרמינל C-הביעה בחיידקי קודון אופטימיזציה אדם עם הניצול של היכולת של rG4R1 להיקשר ולהירגע-DNA G4 לטהר אנזים פעיל מאוד בתוך ATP- צעד elution תלוי. הפרוטוקול כולל גם צעד בקרת איכות שבו הפעילות האנזימטית של rG4R1 נמדדת על ידי בחינת היכולת של האנזים מטוהר להירגע G4-DNA. שיטה גם מתוארת כי מאפשרת כימות של rG4R1 המטוהר. עיבודים אלטרנטיביים של פרוטוקול זה הם דנו.
Introduction
מבני G4 הם מבנים משניים מאוד יציבים חומצות גרעין היוצרים בתוך האזורים עשירים-גואנין של DNA ו- RNA. מבני G4 מיוצבים באמצעות אינטראקציות מליטות Hoogsteen ולתאם מליטה בתוך החלל המרכזי עם קטיונים חד ערכיים (כלומר. K + ו + Na) שתורמים משמעותי ליציבות התרמית המדהימה של מבני G4 1, 2. מחקרים ביואינפורמטיקה מוקדם הציע כי הגנום האנושי מכיל> 375,000 "מוטיבים G4 יוצרי פוטנציאל" 3, 4. עוד הערכות מחקר שנערך לאחרונה עולה כי מספר מוטיבים G4 גבוה בפקטור של 2-5 5, ואילו במחקר אחר צופה 716,310 רצפי G4 יוצרי פוטנציאל מובהק בגנום האנושי 6. G4 יוצרי רצפים שמורים באבולוציה ולא התפזרו באופן אקראיהגנום. מוטיבי G4 מועשרים באזורי קידוד גן, ולמעלה מ -40% מכלל יזמי הגן מכילים G4 מוטיבים 7. מעניין לציין, כי מידת העשרת מוטיבים G4 בגן הודגמה להציע את הפונקציה של הגן. לדוגמא, פרוטו-אונקוגנים וגנים מעורבים בפיתוח באופן משמעותי העשרה גדול של מבני G4 מאשר גני מדכאי סרטן 8, 9.
עם יציבות תרמית גבוהה, נוכחות בכל מקום כמעט לאורך הגנום, ואת הפוטנציאל להשפיע על תהליכים סלולריים גדולים משמעותי, אין זה מפתיע לגלות כי התא התפתח אנזימים לנהל את המבנים האלה. אנזים אחד כזה הוא G4 Resolvase1 (G4R1; המכונה גם RHAU ו DHX36), אשר אפיינו כמקור של רוב פעילות בפתרון tetramolecular G4-דנ"א אנושי (הלה) תאים 10. מאז, הוכח that G4R1 ומסוגר המחבר ואת קטליטית unwinds ו tetramolecular unimolecular G4-דנ"א G4-RNA עם KDS המדווחת ההדוקה עבור חלבון G4 מחייב 11, 12, 13. בנוסף, הפעילות-בפתרון G4 של G4R1 הייתה מעורבת במגוון רחב של תהליכים ביוכימיים הסלולר, כוללים ביולוגיה הטלומרים / טלומרז 11, 14, 15, 16, שעתוק שחבור 17, 18, 19, 20, פיתוח 21, hematopoiesis תקנה 21, והמערכת החיסונית 22, 23. עם רצפים עליונים של G4 ממוקם במיוחד לאורך הגנום ואת p הסלולר המגווןrocesses כי G4R1 היה מעורב לאחרונה להיות מעורבים עם, היכולת להביע ולטהר ביעילות מאוד פעיל rG4R1 יהיה בעל חשיבות עליונה עבור הבהרת המנגנונים הביוכימיים והתנהגויות של חלבון זה.
הנה, אנחנו מדגימים ביטוי ברומן ואת ערכת טיהור (איור 1) שמנצל של ATP התלוי, הפעילות-בפתרון G4 של rG4R1 לבודד אנזים פעיל ביעילות. תכנית זו יכולה להיות מותאמת לטהר אנזימי חומצות גרעין תלוי ATP אחרים עבורו המוצר של התגובה האנזימטית הוא כבר לא מצע לכריכה, כפי שנהוג עבור G4R1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מבנים G4-DNA כדי לשמש עבור טיהור rG4R1 (כינונה של Biotinylated G4-DNA G-Quadruplex)
- הזמן את oligomer DNA הבא, שנקרא Z33-ביו, ביחס של 1 μmole מידה: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT ביוטין 3'. ודא כי מחצית ביוטין היא על 3 'סוף oligomer.
- הכן 10x חיץ G4: 450 mM Tris-HCl pH 8, 25 מ"מ EDTA, ו -2,500 מ"מ NaCl.
- Resuspend את oligomer Z33 ב 250 μL של מים (כך ריכוז oligomer הוא ~ 2.5 מ"מ). הוסף 25 μL של 10x חיץ G4 ומערבבים. דגירת oligomer ב 50 מעלות צלזיוס במשך ~ 48 שעות.
- בקצרה לסובב את הצינור כדי לאסוף את העיבוי (בערך 1000 XG, 10 שניות). הוסף ~ 50 μL של פוליסכריד גבוהה המונית, הידרופילי (30% Ficoll ב O H 2) ומערבבים. יוצקים ג'ל גליצרול 10% acrylamide / 1x TBE / 10% (מידות ג'ל: 16 ס"מ x 16 ס"מ x 1 מ"מ). לאחר ג'ל הוא polymerized, לשטוף את הבארות עם TBE 1x והעומסoligomer Z33-ביו נוצר באופן שווה על פני רוב ג'ל (טעינת ליין מדגם ניתן דמיינו עם קווי שליארן).
- בנתיב אחד בסוף הג'ל, לטעון חלק קטן של oligomer כי כבר מחומם על 98 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות (זה ישמש פקד מובנה), כמו גם כמות קטנה של צבע טעינת ג'ל אחר השביל כדי לפקח כמה רחוק את הג'ל יש להפעיל.
- השתמש 1x TBE כמו למאגר פועל ג'ל ולהפעיל את הג'ל על 120 V עד בחזית לצבוע חצו לפחות 1/3 של הג'ל.
- מניחים צלחת כרומטוגרפיה בשכבה דקה עם הפנים למעלה הצד המחוספס שלה באריזת מגן גיליון (או מכסים בניילון נצמד). סר אחד מלוחות הזכוכית ולהעביר את הג'ל אל פני השטח של המגן וכו. כבו את האורות תקורה וצל UV הג'ל (אורך גל ארוך: 365 ננומטר). השתמש סכין גילוח טרי לחתוך את להקת G-quadruplex-Z33-ביו, אשר תראה בריצה גבוהה בתוך הג'ל (שיש ניידות איטית) ביחס להמסשליטת ed.
- מניחים את הפרוסה ג'ל המכיל את G4-DNA שנוצר בתוך שפופרת 50 מ"ל ולהוסיף מספיק השריה חיץ כדי לכסות את הפרוסה ג'ל (חיץ השריית מורכב 1/3 נפח 10x TBE, אצטט נתרן 1/3 נפח רווי, 1/3 נפח H 2 O). מניחים את הצינור בתוך 37 ° C חממה (nonhumidified) דגירה O / N.
- מעבירים את הפתרון לצינור מ"ל 15 ולהוסיף גליקוגן נפח 1/10 (מלאי הגליקוגן ב 20 מ"ג / מ"ל ב 10 mM Tris-HCl pH 8, 2.5 mM EDTA pH 8, ו אזיד הנתרן 0.05%) ו ~ isopropanol נפח 1.2x .
הערה: אזיד הנתרן הוא בחריפות רעילים, כך השתמש בזהירות!- מערבבים ומניחים את הצינור ב -20 מעלות צלזיוס במשך לפחות h 2. לסובב את הצינור ב 2,700 XG בצנטריפוגה שולחן מקורר 4 מעלות צלזיוס במשך 12 דקות. בעדינות למזוג את הפתרון מן G4-DNA pelleted. שטפו את הכדור 3 פעמים עם 70% EtOH + 50 מ"מ NaCl (מלח בכביסה הוא קריטי ליציבות G4). וויק משם נוזל עודף בנייר טישו נטול סיבים.
- מקוםגלולת השטף במקרר למשך שעה לפחות 2 מימה הגלולה ולאפשר resuspension קל. Resuspend גלולה ב 50 μL של חיץ TNE (10 mM Tris-HCl pH 8, 50 מ"מ NaCl, ו 0.05 מ"מ EDTA pH 8).
- מקום 5 μL של התגבשה זה DNA G-quadruplex לתוך 495 μL של H 2 O ולכמת באמצעות ספקטרופוטומטר המאפשר מקדם הכחדה שייקבע על ידי הזנת בהרכב נוקלאוטיד של oligomer (מקדם הכחדה של oligomer DNA Z33 עם הרכב הבסיס של A = 8, C = 3, G = 15, ו- T = 7 הוא 341,946 L / mol / ס"מ). הזן את הגורם לדילול 25 (לא 100), כמו G-quadruplex נוצר מורכב 4 גדילי הדנ"א.
- Aliquot המקבילה נפח של 3 ODS (OD 260 יחידות) לכל צינור ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס; למשל, אם 5 μL כי נוספו 495 μL של H 2 O נותן קריאת OD 260 של 3, אז להכין 5 aliquots μL.
2. הכנת מבנים G4-DNA כדי שניתן יהיה להשתמש בו Assay הפעילות האנזימטית של rG4R1 (כינונה של טמרה שכותרתו G4-DNA)
- הזמן את oligomer DNA הבא, שנקרא Z33-TAM, ביחס של 1 μmole מידה: 5 'טמרה-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'. ודא כי מחצית טמרה נמצאת 5 'סוף oligomer.
- בצע את אותו תהליך כמפורט בסעיף 1 להיווצרות של-quadruplex G, חוץ מזה הצללה אולטרה סגול (UV) הוא לא נחוץ משום tetramethylrhodamine (טמרה) -labeled G-quadruplex יהיה גלוי בקלות בעין בלתי מזוינת. שוב, הקפד לכלול שליטה מומסת על הג'ל.
- לאחר לקיחת הקריאה ספקטרופוטומטר של-quadruplex G טמרה שכותרתו DNA, כמו בשלב 1, לדלל את G-quadruplex שמטרתן 0.2 pmol / μL עם חיץ TNE. לבסוף, להוסיף גליצרול לריכוז ולאחסן הסופי 10% ב -20 ° C.
3. Transform (DE3) PlysS תאים מוסמכים עם PTRiEx4-DHX36 (G4R1 אדם הקידוד פלסמיד) ולגדול / יגרום גדולות תרבויות חיידקים
- השג את הפלסמיד TriEx4-DHX36.
- Aliquot החיידקים לתוך 20 aliquots μL ולאחסן אותם ב -80 ° C. Aliquot המדיום SOC (2% tryptone, תמצית שמרים 0.5%, 10 מ"מ NaCl, KCl 2.5 מ"מ, 10 מ"מ MgCl 2, 10 mM MgSO 4, ו -20 גלוקוז מ"מ) לתוך 80 aliquots μL ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
- כן carbenicillin (פחמימות) / chloramphenicol (CAM) צלחות LB-אגרו. ריכוזים מאגר של פחמימות ו- CAM הם 50 מ"ג / מ"ל ב H 2 O ו -35 מ"ג / מ"ל ב -70% EtOH, בהתאמה, ואלה 1,000x מרוכזת; וכך, הריכוזים הסופיים צלחות מבחר אגר LB 50 מיקרוגרם / מיליליטר ו -35 מיקרוגרם / מיליליטר, בהתאמה.
- מקום 1 aliquot של חיידקים על הקרח ומניחים 1 aliquot של המדיום SOC ב RT. הוסף 1 מיקרוגרם של פלסמיד pTriEx4-DHX36 החיידק לערבל בעדינות עם קצה פיפטה לערבב. דגירה על קרח למשך הלם חום אז 5 דקות נוספות ב 42 & #176; C למשך 30 שניות. מניחים על קרח במשך 2 דקות ומוסיפים את המדיום SOC.
- פלייט את החיידקים שינו על צלחות מבחר prewarmed (בדרך כלל, צלחת נפח קטן, כגון 5 - 10 μL, כדי להבטיח צפיפות מושבה נמוכה כך מושבות אחת יכולות להיות מחוסנות בקלות לתוך תרבויות גדולות) ו לדגור על 37 מעלות CO / N.
- כן מרק נהדר על פי הוראות היצרן 24. הפוך 500 מ"ל לכל בקבוק גדול (לוודא להוסיף גליצרול) החיטוי על מחזור נוזלי קצר.
- להוסיף פחמימות / CAM (50 מיקרוגרם / מ"ל / 35 מיקרוגרם / מ"ל) אל התבשיל ואז לחסן תרבויות על ידי לקיחת אגר תקעים (בעזרת פיפטה P1000) המכיל מושבת חיידקים יחיד pipetting לתוך המרק. מערבולת התרבויות נמרצות לאורר אותם ואז דגירה התרבויות בשעה 37 ° CO / N בלי לרעוד.
- למחרת, למקם את התרבויות שייקרו 37 ° C ולנער ב ~ 225 סל"ד. לגדול התרבויות עד OD 600 הוא כ 0.4 -0.6, אשר בדרך כלל ייקח בערך 4 - 6 שעות, תלוי צפיפות התאים הראשונית.
הערה: זה ידרוש ניטור צפיפות תקופתי באמצעות קריאות spectrophotometric, ואת זה הוא קריטי לא לגדול תרבויות הרבה מעל 0.5 ODS. כתוצאה ריקה לקריאת spectrophotometric, ספין למטה 1 מיליליטר של חיידקים להשתמש במרק בהיר כפתרון לתלייה על הקיר. - לאחר OD הראוי 600 מתקבל, מייד למקם את התרבויות על קרח במהירות לקרר אותם עד 10 מעלות צלזיוס. צג הטמפרטורה באמצעות מדחום מחה נקי עם EtOH 70%. לזרז את הקירור על ידי החלפה של צלוחיות במהירות תוך על הקרח, כמו זה יהיה להגביל התפתחות חיידקים נוספת לפני אינדוקציה חלבון רקומביננטי.
- הוספת IPTG לריכוז סופי 1 מ"מ (~ 120 מ"ג / 500 תרבות מ"ל) ולאחר מכן ללחוץ על 80 סל"ד ב 14 מעלות צלזיוס במשך ~ 17 - 18 שעות. הטמפרטורה האידיאלית לזירוז חלבון כבר מצאו להיות 14 מעלות צלזיוס; הטובה ביותר להשיג זאת, להשתמש loc שייקר מים באמבטיה מקוררated בחדר קר קונבנציונאלי ידני לבדוק את הטמפרטורה של המים באמבטיה עם מדחום.
הערה: לחלופין, להשתמש שייקרו מקורר אוויר / חממה, אם כי יש צורך לבדוק מה הגדרת טמפרטורה שנקבעת דיגיטלי תניב את הטמפרטורה הנוזלית הרצויה (מבחן זה על ידי דוגרי קיתון של מים עם מדחום בתוכו רועד ב 80 סל"ד במשך כמה שעות, כדי להתאים את הטמפרטורה הדיגיטלית הגדרה בהתאם עד 14 ° C הוא הגיע). - מניח את התרבויות על קרח לקרר אותם במהירות, כמו בשלב 3.9. קח aliquot קטן של חיידקים ולקחת OD 600 קריאה; באופן אידיאלי, התרבויות תהיינה הוכפלו במהלך האינדוקציה כ -0.8 - 1.2 OD 600.
- מעבירים את החיידקים 500 מ"ל צינורות צנטריפוגות ידני לאזן אותם באמצעות תרבית החיידקים כדי לאזן את המשקל בין צינורות. לאחר מאוזן, צנטריפוגות אותם 3,840 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C. יוצק את המרק הבהיר ולהקפיא את pel החיידקיםמאפשר ב -80 ° C עד למועד טיהור חלבונים.
טיהור 4. אדם rG4R1
- הפשרת lyse כדורי חיידקים.
- ההפשרה גלולה חיידקים 3 מ"ל של חיץ TN ב RT (חיץ TN מורכב 100 מ"מ טריס pH 7.5 ו -50 מ"מ NaCl). החזק את הבקבוקים ביד המערבולת להפשיר / resuspend גלול חיידקים. לאחר מופשר יחסית מושהית ומאוזנת, ולהביא את נפח של עד 5 מ"ל עם TN חיץ (השעיה נוספת ניתן להשיג באמצעות pipetting מעלה ומטה עם טפטפת 5 מ"ל).
הערה: זה אופייני להפשיר / הכנה או 2 או 4 בקבוקים ביום הכנה, תלוי של רמת המשתמש של נוחות עם הליך הטיהור. - ממיסים 20 מ"ג של ליזוזים ב 250 μL של H 2 O (מחיר התרבות) ולהוסיף חיידקים resuspended. אפשר ליזוזים לעכל את החיידקים עבור ~ 5 - 10 דקות בעוד מתערבל הבקבוקים ביד.
הערה: הצבע של susהפנסיה תתחיל להאיר מעט ככל שמתקדם העיכול, ואת השעיית תהיה יחסית שאינו צמיגה. אם התרבויות הם מגודלים מדי (כלומר הרבה יותר מאשר 1.2 OD 600), אז בכרומוזומי DNA חיידקי יכול לגרום צמיגות רצויות בשלב זה. - הוסף 250 μL של מעכבי פרוטאז קוקטייל (PIC) ו aliquot אחד 10 μL של leupeptin. מערבבים היטב.
- מניחים על קרח ולהוסיף 10 מ"ל של חיץ קר TN ו -22 μL של BME. מעבירים צינור 50 מ"ל.
- Sonicate את החיידקים על קרח עם sonicator דיגיטלית המוגדרת משרעת 30%. Pulse ב -2 s ON ו- s OFF 2 דקות 1. חזור על sonication 3 פעמים, ומאפשר דגימות להתקרר על קרח דק 2 לפחות בין הצעדים sonication.
הערה: מרובת תרבויות, sonicate כל אחד בתורו לפני חזרה על חזרות sonication. במהלך sonication, להיות זהיר כדי לשמור על קצה sonication שקוע מספיק את lysate חיידקי, אך לא לגעת הצדדי דואר של הצינור, כמו זה יהיה לייצר חום עודף. - הוסף נפח שווה (15 מ"ל) של SSC 4x קר + 20 μL של BME + 50 μL של PIC + 1 aliquot של leupeptin ומערבבים.
- בצנטריפוגה השולחן מראש מקורר עד 4 ° C, צנטריפוגה lysates ב 2,300 XG במשך 20 דקות. מעבירים את supernatant טריים, צינורות טרום מקורר 50 מ"ל (1 צינור לכל תרבות גדולה להיות prepped).
- ההפשרה גלולה חיידקים 3 מ"ל של חיץ TN ב RT (חיץ TN מורכב 100 מ"מ טריס pH 7.5 ו -50 מ"מ NaCl). החזק את הבקבוקים ביד המערבולת להפשיר / resuspend גלול חיידקים. לאחר מופשר יחסית מושהית ומאוזנת, ולהביא את נפח של עד 5 מ"ל עם TN חיץ (השעיה נוספת ניתן להשיג באמצעות pipetting מעלה ומטה עם טפטפת 5 מ"ל).
- כן חרוזי G4-מגנטי.
- קח 1 מ"ל של חרוז פאראמגנטיים streptavidin ההשעיה (SPB) (לכל 1 L התרבות) ולהעביר אותו צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. גלולה SPB עם מגנט ולשטוף 2x עם 2x SSC + 5 mM EDTA pH 8. Resuspend את SPB לרחוץ 200 μL של אותו פתרון ששימשה לשטיפת חרוזים.
- להוסיף אחד 3 OD aliquot של G4-דנ"א (G4 Z33-ביו המוכן בסעיף 1) על השעיית SPB ומערבב במהירות על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. מניחים את הצינורות על הכתף וסיבוב ב RT למשך 30 דקות לפחות (עד 60 דקות).
- אָחוֹראה תקופה זו של סיבוב, לחסום את SPB הנכנס G4 על ידי הוספת 1 מ"ל של lactalbumin 0.4%, ולשמור על הקרח עד הצורך. לדלל את lactalbumin 0.4% ממלאי 4% lactalbumin באמצעות 1x טריס-גליצין.
הערה: lactalbumin% המניות 4 (w / v) מוכן בתחילה על ידי פירוק ב 2 מ 'גליצין pH 7.5, בתוספת נוספת של 1x PIC ו אזיד הנתרן 0.05%.
- לאגד היסטידין-tagged rG4R1 חרוזים קובלט (CB) (המשך משלב 4.1).
- הוסף 1 מ"ל של תרחיף CB (שווה ערך לנפח חרוז 0.5 מ"ל) על צינור אחד 50 מ"ל המכיל lysate חיידקי הבהיר. דגירה במשך 20 דקות ב RT על הכתף.
הערה: נפח חרוז 0.5 מ"ל משמש לכל 1 ליטר של lysate הבהיר; למשל, אם שני 500 תרביות חיידקים מ"ל ערוכים, רק להוסיף CB אל הצינור 50 מ"ל המכיל lysate הבהיר מאחד תרבויות בשלב זה, כפי lysate מתרבות השני יהיו מחויבים באופן סדרתי עם אותו 0.5 מ"ל של CB ב stEP 4.3.3). - ספין למטה CB ב 110 XG במשך 5 דקות בצנטריפוגה השולחן 4 ° C.. לשאוב את הנוזל בזהירות, ולהשאיר כמה מ"ל של נוזל כדי לא להפריע את CB pelleted. לשטוף עם 10 - 15 מ"ל של 4x SSC + BME (0.5 μL של BME / מ"ל של 4x SSC) קר.
הערה: לקבלת שוטף, לשפוך 10-15 מ"ל ישירות על גבי חרוזים קובלט pelleted במקום pipetting, כמו pipetting יגרום החרוזים להיתקע לחלק הפנימי של פיפטה וחלבון יאבדו. - גלולה CB שוב באמצעות צנטריפוגה ואז לשפוך את lysate הבא הבהיר (30 מ"ל, המייצגים את התרבות חיידקי המושרה 2 nd גדול) על CB pelleted. דגירה במשך 20 דקות נוספות ב RT על הכתף ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם 10-15 מ"ל של BME + 4x SSC. גלולה ב 110 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- לאחר לשטוף את השני, לשאוב את הנוזל ולהשאיר כ -2 מ"ל של נוזל חרוזים / בתחתית של התחתית. מעבירים את CB חלבון הנכנס לצינור מראש מקורר 2 מ"ל ידיבאמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל "רחב נשא".
הערה: משתמשת סכין גילוח טרי לחתוך את הקצה של הקצה לפני העברה, כמו השימוש "רחב נישא" קצה פיפטה זה יקטין את ההפסד של חרוזי קובלט הנכנס חלבון. - בקצרה בצנטריפוגה חרוזים בצינור מ"ל 2 במהירות גבוהה (~ 18,000 XG) microcentrifuge בבית 4 ° C (~ 5 - 10 שניות הוא כל מה שנדרש עבור pelleting מהירה). הוצא בעדינות וזורקים supernatant ידי pipetting, נזהרים שלא לאבד את CB כבול-חלבון.
- הוסף 1 מ"ל של תרחיף CB (שווה ערך לנפח חרוז 0.5 מ"ל) על צינור אחד 50 מ"ל המכיל lysate חיידקי הבהיר. דגירה במשך 20 דקות ב RT על הכתף.
- Elute rG4R1 מ CB.
- דגירה CB ב 0.5 מ"ל של חיץ elution היסטידין (HEB) על הכתף במשך 5 דקות בחדר קר. שוב, בעת הוספת HEB, רק פיפטה 0.5 מ"ל על חרוזים (לחסל אובדן CB) ו resuspend את החרוזים על ידי צינור היפוך. HEB הוא 0.7 M L-היסטידין pH 6 (ה- pH מותאם באמצעות חומצה אצטית).
- צנטריפוגה ב 18,000 XG ב microcentrifuge 4 ° C. דקות 1. מעבירים את supernatantלצינור מראש מקורר 15 מ"ל. הוצא בעדינות ולהעביר את supernatant המכיל חלבון על ידי pipetting הזהיר, משאיר כמות קטנה של נוזל על גבי CB.
- חזור על שלבים 4.4.1 ו 4.4.2 עבור סכום כולל של 3 elutions HEB.
- Elute פעם עם 0.2 M EDTA pH 6.0; את הצבע של CB ישתנה מוורוד לבן כמו EDTA chelates קובלט.
- לאחר elution הרביעי והאחרון זה הועבר ל -15 הצינור מ"ל, פיפטה למאגר elution שיורית מן CB באמצעות טיפ ג'ל טעינת על קצה קצה פיפטה 1 מ"ל; ניתן לאסוף באמצעות תקיעת הקצה אל החלק התחתון של הצינור, חיץ elution חלבון המכיל שיורית.
- לאגד rG4R1 כדי SPB הנכנס G4 ו elute אנזים רקומביננטי באופן תלוי ATP.
- הכן הצפת מיל 5x: 250 מ"מ טריס-אצטט pH 7.8, 250 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ MgCl 2, ו -50% גליצרול. הכן הצפת מיל 3x: 0.915 מ"ל של H 2 O, 2 מ"ל של 5x הצפת מיל, 0.33 מ"ל של 0.4% lactalbumin (דiluted מ lactalbumin 4% עם 1x טריס-גליצין), 0.010 מ"ל של BME, 0.015 מ"ל של 1 M MgCl 2, 0.050 מ"ל של PIC, ו 0.010 מ"ל של leupeptin. שמור על הקרח.
הערה: lactalbumin% המניות 4 (w / v) מוכן בתחילה על ידי פירוק ב 2 מ 'גליצין pH 7.5, בתוספת נוספת של 1x PIC ו אזיד הנתרן 0.05%. - גלולה G4-SPB אל הצד של הצינור עם מגנט וזורקים supernatant (G4-SPB, כמו מוכן בשלב 4.2). הוסף 1 מ"ל של 3x מיל הצפת אל G4-SPB ו פיפטה לערבב.
- פיפטה 1 זה מ"ל של G4-SPB המרחפים חיץ מיל 3x לתוך הצינור 15 מ"ל המכיל ~ 2 מ"ל של המכילים חלבון HEB / EDTA (eluate משלב 4.4). דגירה במשך 15 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה מדי פעם כך החרוזים לא להתפשר.
- על קרח, גלולת G4-SPB הנכנס החלבון אל הצד של הצינור עם מגנט. כדי לשטוף, להוסיף 1 מ"ל של lactalbumin 4x SSC + 0.4% (+ 0.5 μL / מ"ל BME) ו פיפטה כדי resuspend את החרוזים. חרוזים גלולים עם tהוא המגנט על הקרח. חזור על זה לשטוף עבור סכום כולל של 2 שוטפים.
הערה: סבלנות נדרשת במהלך הליך הכביסה כדי להבטיח שכל של החרוזים המגנטיים כבר pelleted בין השוטף. הדבר נכון במיוחד בהתחשב צמיגות המוגבר של הפתרון בשל גליצרול הכלול מאגרי המיל. - שטפו את 1x G4-SPB עם 1 מ"ל של הצפת מיל 3x.
- הכן חיץ elution (EB): 0.5 מ"ל של הצפת מיל 3x, 0.1 מ"ל של 0.1 מ 'ATP, ו -0.4 מ"ל של H 2 O.
- טרום חמים 1 מיליליטר של EB ל -37 מעלות צלזיוס PCR צינורות המופצים ברחבי בלוק החימום של Cycler תרמית מוגדרת 37 ° C.
- גלולה G4-SPB עם המגנט על הקרח resuspend את החרוזים 100 μL של EB מחומם מראש. מיד להעביר את החרוזים לצינור מראש חימם PCR דגירה למשך 30 שניות על 37 מעלות צלזיוס.
- מיד להוסיף 12 μL של 5 M NaCl ו פיפטה למעלה ולמטה במרץ 20 - 30 פעמים. השילוב של מלח הגבוה ו- ATP הכלול EBמשמש elute rG4R1 מן-חרוזי G4.
הערה: חשוב מאוד לצמצם את מספר הבועות הנוצרות במהלך תהליך pipetting, כבועות יכול לפגל החלבון. - מייד גלולת G4-SPB עם מגנט ולהעביר את eluate המכיל חלבון לצינור PCR טרי על קרח (שכותרתו עם התאריך).
- חזור על elution והעברת כמתואר בשלבים 4.5.8-4.5.10; המוצר בסופו של תהליך זה הוא אפוא ~ 200 μL של EB מכיל מטוהרי rG4R1. מניחים בצד שני 7 aliquots μL (צינורות PCR שכותרתו עם התאריך המתאים) לשימוש assay הפעילות האנזימטית בקרת איכות כי יבדקו האם rG4R1 פעיל מאוד אכן טוהרו.
- אחסן את rG4R1 מטוהרים ב -80 ° C עד למועד של assay פעילות.
- הכן הצפת מיל 5x: 250 מ"מ טריס-אצטט pH 7.8, 250 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ MgCl 2, ו -50% גליצרול. הכן הצפת מיל 3x: 0.915 מ"ל של H 2 O, 2 מ"ל של 5x הצפת מיל, 0.33 מ"ל של 0.4% lactalbumin (דiluted מ lactalbumin 4% עם 1x טריס-גליצין), 0.010 מ"ל של BME, 0.015 מ"ל של 1 M MgCl 2, 0.050 מ"ל של PIC, ו 0.010 מ"ל של leupeptin. שמור על הקרח.
5. Assay פעילות בקרת איכות אנזימתי של מטוהרים rG4R1
- עבור כל הכנת rG4R1 להיות assayed, להכין 300 μLשל חיץ assay resolvase (RAB), כאשר כל 30 μL מכיל 0.2 pmol של DNA G4 Z33 שכותרתו טמרה (מוכן בשלב 2); האיפור של RAB הוא כדלקמן: 0.1 מ"ל של הצפת מיל 3x, 0.01 מ"ל של 0.2 pmol / μL G4-Z33-TAM, 0.03 מ"ל של 0.1 מ 'ATP, ו 0.16 מ"ל של H 2 O. ב רצועה של 6 PCR צינורות, פיפטה 40 μL של RAB לתוך הצינור הראשון ו -30 μL של RAB לתוך צינורות הנותרים (לשמור את הצינורות על קרח בשלב זה).
- אחזור באחת מ -7 aliquots μL rG4R1 (משלב 4.5.11) ומניחים אותו על קרח. עם טפטפת P20 מוגדר 5 μL, פיפטה בעדינות מעלה ומטה מספר פעמים כדי לערבב את rG4R1 ב aliquot ולהעביר 5 μL אל הצינור הראשון של רצועת 6 צינורות PCR (אחד המכיל 40 μL של RAB). לאחר מכן, לקבוע את פיפטה עד 10 μL ו סדרתי להעביר 10 μL אל צינורות הנותרים PCR המכיל RAB.
- מיד דגירה ברצועה זו של צינורות PCR ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות בתוך Cycler תרמית, ואחריו להחזיק 4 ° C..פתח את הצינורות בזמן שהם מוחזקים על 4 מעלות צלזיוס ומוסיף 2 μL של 0.5 M EDTA pH 8 צינור אחד (כדי לעצור את התגובה האנזימטית).
- יוצקים ג'ל גליצרול 10% acrylamide / 1x TBE / 10%. לאחר הסרת המסרק, לשטוף את הבארות עם TBE 1x. הוסף 5 μL של פוליסכריד גבוהה המונית, הידרופילי (30% Ficoll ב H 2 O) על צינור אחד והעומס 15 μL מהצינור כל (והעמסת בארות יכול שוב לצפות באמצעות קווי שליארן).
- כביקורת לניידות G4-DNA, להוסיף 4 μL של מסה גבוהה, פוליסכריד הידרופילי 20 μL RAB, והעומס 15 μL; כבקרה התיר monomeric Z33, חום 20 μL של RAB ב 98 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, להוסיף 4 μL של מסה גבוהה, פוליסכריד הידרופילי, והעומס 15 μL.
- הפעל את הג'ל על 120 וולט עבור 2 שעות עם TBE 1x כמו למאגר ריצה. תמונה הג'ל על תרמי multimodal עם יכולת הקרינה הדמיה באמצעות טמרה ספציפי מסננים (להלהיב עם לייזר ירוק 532 ננומטר ולהשתמש 58להקת 0 ננומטר לעבור 30 מסנן (580 BP 30)).
הערה: תכשיר פעיל ביותר של rG4R1 יניב ברזולוציה מלאה של Z33 טמרה שכותרתו ב -3 הנתיבים הראשונים הועמסו על הג'ל, כפי שמוצג באיור 2.
6. איגום של Preps rG4R1 מאוד פעיל, aliquoting, ואחסון
הערה: שלב זה דורש 2 אנשים. מספר ודרישות האנזימטית של מבחני במורד הזרם כי rG4R1 מטוהרים ישמש יקבע כמה הכנות נדרשות לפני aliquoting. הכנה גדולה טיפוסית מורכבת וריכוז 8 תכשירים פעילים מאוד (ובכך באמצעות סך של 16 מושרה 500 תרביות חיידקי מיליליטר), אבל זה מספר שרירותי והוא ספציפי במעבדה.
- חשבתי את הנפח הכולל של rG4R1 הפעיל, נקי במיוחד כי היא להיות aliquoted. בדרך כלל, 7 aliquots μL משמשים מבחני במורד הזרם. מלאו את הבלוק של cycl תרמיתאה המוגדר כ -4 מעלות צלזיוס עם צינורות הרצועה PCR (אלה יהיו aliquoted לתוך, כאופי המוצק של הגוש יזרז הסגירה המהירה של רצועות PCR).
- תחזר את צינורות PCR המכילים rG4R1 הפעיל ביותר מ -80 ° C ובמהירות להפשיר את הצינורות ביד; כאשר כמות של קרח קטנה שנשארה בצינור, מניח את הצינורות על קרח. מערבב את כל ההכנות המופשרות במהירות לתוך צינור prechilled, 15 מ"ל ומערבב היטב, והקפד למזער בועות.
- בעזרת פיפטה חוזר אוטומטי, לוותר על נפח aliquot הרצוי לתוך צינורות רצועת PCR מראש צונן Cycler התרמית. ברגע 1 - 2 רצועות הושלמו, יש לאדם השני לסגור את העפעפיים ולהעבירם ופלים 96-היטב כי הם מרחפים בחנקן נוזלי (הקפאה פלאש יש צורך לשמר הפעילות האנזימטית).
הערה: אין ליטול יותר מאשר על 200 μL של rG4R1 לתוך קצה פיפטה אוטומטית בכל פעם, כדי לצמצם את הזמן כי האנזים הוא לא ב 4מעלות צלזיוס. - לאחר צינורות רצועת PCR prechilled Cycler התרמית מולאו עם aliquots קפוא כראוי, להעביר במהירות יותר מראש צונן צינורות PCR הרצועה מן הקרח כדי Cycler התרמית ולהמשיך aliquoting. המשך בדרך זו עד שארית האנזים כבר aliquoted, פלאש קפואים בחנקן נוזלי, והועבר קרח יבש. לבסוף, להעביר את aliquots ל -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.
7. כימות ריכוז המטוהרים rG4R1
- יוצקים% תקן 5 לערום / 12% בפתרון ג'ל acrylamide / SDS להפרדת חלבונים.
- ההפשרה כ -50 μL של rG4R1 aliquoted, לשלב לתוך צינור אחד, ומערבבים היטב. מדוד את נפח המדויק עם טפטפת ולהוסיף כמות שווה של חיץ מדגם 2x Laemmli (65.8 mM Tris-HCl pH 6.8, 26.3% (w / v) גליצרול, 2.1% SDS, ו 0.02% bromophenol כחול) + BME (50 μL / 950 μL של חיץ 2x Laemmli). לפגל חלבון 98 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
- הסר את המסרק מן הג'ל ולשטוף את הבארות עם חיץ ריצה 1x SDS / גליצין סטנדרטי. טען את המקבילה של 25 ו -12.5 μL של rG4R1 (המהווה 50 ו -25 μL של חלבון מפוגל), אם כי בהיקף האנזים האופטימלי לטעון צריך להיקבע על ידי המשתמש, כמו הריכוז של ההכנות האנזימטית תשתנה (למשל, 35 μL הועמס על ג'ל באיור 3). טען את סטנדרטי החלבון מוכנים בשלב 7.3. ודא כי טפטפות מכוילים כראוי, ולוודא לדייק ככל possible עם טכניקת pipetting כדי להבטיח כימות מדויק.
- הפעל את הג'ל על 120 V עד בחזית לצבוע חצו בערך 2/3 של ג'ל (כדי להבטיח הפרדה נאותה של חלבונים שמרכיבים את סמנים רחב-טווח MW).
- הסר את הג'ל ולסלק את החלק של הג'ל כי לא מכיל חלבון על ידי חיתוך אותו עם סכין גילוח. מניחים את הג'ל בצלחת תבשיל זכוכית או כלי קיבול שווה ערך. הכתם ג'ל עם צבע Coomassie (50 מ"ג של Coomassie R-250 ל -100 מ"ל של 50:10:40 v / מתנול v: חומצה אצטית: H 2 O כי סוננה דרך משפך מסנן נייר) O / N ב RT על סט שייקר מסלולית כדי להבטיח תסיסה נאותה של הג'ל.
- דה-להכתים את הג'ל עם 30:10:60 v / v מתנול: חומצה אצטית: H 2 O באמצעות מגולגלים, נטולת מוך ממחטת נייר כדי לזרז destaining. שנה את הפתרון destaining לפי הצורך. המשך destaining עד שהרקע הוא נמוך מספיק כדי להמחיש סטנדרטי rG4R1 וחלבון; ג'ל טיפוסית זובשלב מוצג באיור 3.
- מניחים את הג'ל destained בין מגן גיליון ולסרוק את הג'ל על ≥300 רזולוציה. פתח את התמונה הסרוקה בתכנית תוכנת ניתוח תמונה (כגון פוג'י Multiguage או שווה ערך) ולהכין עקומות סטנדרטיות מן סטנדרטי החלבון מתאים 75, 100, ו -150 kDa (העקומות מייצגות כמויות גרמו לעומת קריאות densitometric). הקפד לחסר את הרקע בנתיב אחד להיות לכמת בתהליך קבלת ערכים densitometric.
- בהנחה שסכום היקף rG4R1 שהועמס על הג'ל מכיל כמות של חלבון זה נמצא בטווח ליניארי של עקומות סטנדרטיות אלה, בסך גרם חלבון לכל מיקרוליטר של rG4R1 נטען יכולים להקיש מזה.
- המרת הסכום גרם אקסטרפולציה של rG4R1 לתוך כמות טוחנת באמצעות המשקל המולקולרי של G4R1, שהוא 120,000 g / mol.
הערה: עבור כל ג'ל, שלושה ערכים אקסטרפולציה יהיושנוצר (אחד עבור כל אחד סמנים חלבוניים שלושה השתמשו כדי ליצור את עקומות סטנדרטיות: 75, 100, ו -150 KDA). הפעל שני ג'לים נוספים כתם ולכמת אותם על ידי חזרה על שלבים 7.1 - 7.10. עם התוצאות של כימות עבור הג'ל הראשון, המשתמש יוכל לאמוד כמה rG4R1 יש לטעון על ג'לים יותר כדי להניב סכום נמצא בטווח ליניארי של סטנדרטי החלבון. בסך הכל, לחיץ תשעה ערכים המייצגים את ריכוז מאוד פעיל, מטוהרים rG4R1. ממוצע ערכים אלה לתת את ריכוז rG4R1 יצווה ספציפי הסופי, שהוא בדרך כלל בטווח של 20-100 ננומטר. חשב את סטיית התקן מערכים אלה (n = 9).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה (איור 1) מניב שגרתי כמעט טהור, rG4R1 פעיל קטליטית. כצעד של הפעילות האנזימטית, הוא ציין בדרך כלל כי 50% של 0.2 pmol של G4-DNA tetramolecular שכותרתו טמרה מומר מונומרים בתוך 0.2 - מגוון μL 0.013 של rG4R1, כפי assayed ידי assay פעילות G4 שתוארו לעיל (איור 2). Coomassie המכתים של מטוהרי rG4R1 מצביע על פס אחד בגודל 120 kDa הצפוי, עם להקה מזהמת קטין ב ~ 75 kDa, אשר עשוי לייצג מקוצץ rG4R1 כי יש לשמור על יכולתה לקשור חרוזי G4-דנ"א כדי elute בבית תלוי ATP באופן (איור 3). הלהקה של עניין היא לכמת נגד עקומת חלבון סטנדרטית, פרוטוקול זה בדרך כלל משיג 200 μL של אנזים מטוהר 20-100 ננומטר לכל 1 ליטר של תרבות חיידקים.
איור 1: סכמטי של טיהור שני שלבים של G4R1. 6xHis מתויג rG4R1 הוא עיקר-מטוהרים מן lysates החיידק באמצעות קשירה הראשון משחררי מן Co 2 + מצומדות חרוזים. צעד מחייב חרוזים מגנטיים G4 מצומדות-DNA כדלקמן. לבסוף, צעד elution תלוי ATP יש צורך לקבל טהור יחסית enzymatically הפעיל rG4R1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: בקרת איכות G4-DNA Assay סלילה. Lanes 1 - 6: ריכוז קבוע של G4-DNA tetramolecular שכותרתו טמרה הודגר על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בנוכחות דילולים סדרתי 4x של rG4R1 מטוהרים המייצג 3.9 μL, 0.83 μL, 0.2 μL, 0.05 μL, 0.013 μL , ו 0 .003 ΜL, בהתאמה. ליין 7: G4-DNA tetramolecular בהעדר rG4R1. ליין 8: G4-DNA tetramolecular מבושלים להפחית את מבנה G4 לתוך מונומרים בהעדר rG4R1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: כימות ריכוז מטוהרים rG4R1. Broad-טווח סמנים חלבוניים MW הועמסו בכמויות הבאות: 500, 250, 125, 62.5, 31.3, ו -15.7 ng ב Lanes 1 - 6, בהתאמה, וכן שימשו כדי ליצור עקומת תקן של ריכוזי חלבון. ליין 7 מייצג 35 μL של rG4R1. ג'ל מסוים זה היה לכמת, כחלק סט בשלושה עותקים של ג'לים, וכתוצאה מכך ריכוז חלבון ממוצע של 62 ± 22 סטיית התקן ננומטר (SD; N = 9)..com / קבצים / ftp_upload / 55,496 / 55496fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מייצג ערכת ביטוי, טיהור יעילה ביותר, וכימות עבור הבידוד של מוצר גן DHX36, G4-Resolvase1 (G4R1, המכונה גם RHAU ו DHX36) (איור 1). פרוטוקול זה מנצל שני צעדי טיהור: טיהור זיקת התג שלו על חרוזי זיקת קובלט וטיהור האנזימטית על חרוזי G4-DNA מצומדות. השלב האחרון הוא ייחודי בכך שהוא מנצל את הזיקה ההדוקה, הסגולית גבוה, ופעילות התרה קטליטי כי יש rG4R1 למבני G4. הזיקה ההדוקה למבני G4 (K ד בטווח הנמוך-PM) מאפשרת עבור לשטוף מלח גבוה (קרוב לגבול המסיסות של NaCl) לפני elution מן חרוזי G4, מקטין מאוד את הנוכחות של חלבונים שאינם ספציפיים. הפעילות הקטליטית של G4R1 על מבני G4 מאפשרת elution הספציפי של פעיל rG4R1 על התוספת של ATP ו MgCl 2. ערכת טיהור שני שלבים זה עקבי מייצרת מאוד טהורה, קטליטית פעילה 13 rG4R1 בכמויות מתאימות ניתוחים ביוכימיים ביותר.
צעדים מרכזיים יבטיחו תשואה טובה של טהור מאוד, rG4R1 הפעיל קטליטית. הראשונה היא להבטיח את תנאי אינדוקציה התקינים של-rG4R1 שלו זן ביטוי החיידקים. מצאנו כי את התשואה הטובה ביותר של חלבון רקומביננטי מתרחשת כאשר התאים גדלים כדי OD 600 של לא יותר מ 0.4-0.6 זמן קצר לפני הגיוס. גידול התאי מעבר לנקודה זו עלולה לגרום פסד כולל של התאוששות חלבון, ככל הנראה בשל השילוב של rG4R1 לתוך גופי הכללה. שנית, השגנו ריכוז גבוה של חלבון מטוהר על ידי "סדר המחייב" את lysates על חרוזי זיקת קובלט. לדוגמא, אנו מקשרים את lysate מ -0.5 ליטר של תרבויות המושרה על חרוזי זיקת קובלט ולאחר מכן בצענו מחייב שני של lysate אחר מתרבה 0.5 ליטר נוסף על החרוזים באותה זיקת קובלט. זֶהצעד מבטיח הכנה מרוכזת יותר של חלבון על ידי הגדלת מספר מולקולות rG4R1 כבול נפח נתון של חרוזים, ובכך ניצול הקיבולת המלאה של חרוזי זיקת קובלט. שלישית, לשטוף מלח הגבוה אחרי כבילת elutions הזיקה קובלט על חרוזי G4 מבטיח כי כמעט כל החלבון שאינו ספציפי קשירה של חרוזי מוסר. הרביעית, צעד elution ATP / MgCl 2 מאפשר rG4R1 חייב את חרוזי G4 להתיר את מבנה tetramolecular קטליטית לחוטים יחידים, גרימת rG4R1 להשתחרר מן החרוזים. אנחנו לא יכולים לשלול את האפשרות לחלוטין כי ATP elutes rG4R1 בתוך תחרותי ולא באופן קטליטי; עם זאת, זה פחות סביר להיות המקרה, שכן אנו הראינו בעבר כי אנלוגי ATP הלא hydrolyzable אינו מספיק תחרותי מחייבים 13, 18. הזיקה של rG4R1 עבור התיר, דנ"א חד-גדילי הוא בסדר גודל פחות מ tהוא החל G4-DNA tetramolecular, ובכך rG4R1 אסור מחדש לאגד את החרוזים. על מנת להקטין את האפשרות הזאת, עם זאת, צעד זה צריך להיעשות על 37 מעלות צלזיוס, ואת נפח elution יש להפריד את החרוזים כמה שיותר מהר. שלב elution חוזר פעמים על מנת להבטיח התאוששות מקסימלית. אם יישומים במורד הזרם דורשים חלבון כדי להיות חופשי של מזהמים DNA, אנו ממליצים על שלב הניקוי נוספים בהם להכנת מטוהרים מחדש חייב חרוזים streptavidin על מנת להסיר כל DNAs biotinylated, אם הוא קיים.
מצאנו כי rG4R1 רגיש שפל אם התנאים המתאימים לא נשמרו לאורך כל הפרוטוקול. על מנת לשמור על השלמות ועל פעילותו של האנזים, אנו מעסיקים אמצעי ההגנה הקריטי הבא. מעכבי פרוטאז נשמרים נוכחיים לאורך כל הליך הטיהור. הפרוטוקול מתבצע ב 4 ° C, אלא אם צוין אחרת. החלבון הוא מטוהר בנוכחות lactalbumin ו β-mercaptoethanol. הפרוטוקול מתבצע בזמן אופנה (ב 1 יום עבור טיהור). בנוסף, מצאנו כי להקפיא להפשיר מחזורים מרובים להשפיע לרעה על הפעילות של החלבון, אז אנחנו aliquot החלבון לתוך "לשימוש חד פעמי," 7 aliquots μL בא טיהור ולאחסן אותם ב -80 ° C.
למרות הנוכחות של lactalbumin בהכנה נדרשה לשמור על השלמות ועל הפעילות של החלבון, כאמור לעיל, מצאנו כי זה עלול גם לעכב יישומים במורד זרם. מולקולות מפריעות פוטנציאליות אחרות שנמצאות בהכנת rG4R1 המטוהרת כוללות ATP, β-mercaptoethanol, ו- DNA גדילים בחרו. לדוגמא, מצאנו הכנת חלבון זה להיות עולה בקנה אחד עם ניתוח BIACORE בשל אות רקע הגבוהה מן מרכיבי החיץ. כמו כן, נוכחותם של lactalbumin בהכנת החלבון מונעת את השימוש לסטנדרטים ברדפורדמבחני quantitation חלבון BCA. עם זאת, פיתחנו שיטה quantitation חלופית המבוססת-ג'ל לעקוף מגבלה זו.
הליך טיהור זה, אשר רותם את הפעילות האנזימטית של G4R1 כאמצעי לטהר אותו בפרט עושה שיטה זו נבדלת משיטות אחרות. לדוגמה, קבוצות אחרות הביעו מתויג FLAG rG4R1 בתאים אנושיים 15, 25 או rG4R1 מתויג GST בתאי חרקים 26 וטיהר אותו FLAG- או כרומטוגרפיה זיקה GST, בהתאמה. שיטות אלה יש את היתרון של להיות נעשה מערכת ביטוי איקריוטיים לעומת מערכת ביטוי חיידקים. ערכי K d משוערים של GST-G4R1 מטוהר וכתוצאה למבני G4 נמצאו בסדר גודל 14 גבוה ד K דיווח שלנו ערכי 12, 13. אנו מייחסים תיההתאמה של בערכי ד K להבדלים הקשורים תג-GST bulkier לעומת תג 6xHis, הבדלי purities המתקבל תוכניות טיהור שתיים ושהוא הבדלים במידה והסוג שלאחר translational שינויים שנרכשו חיידקים לעומת פעולה מערכת ביטוי חרקים. לגישה שלנו יש יתרון מובהק על פני החלופות האמורות משום הטיהור של חלבון זה צירים ישירות על הפעילות האנזימטית שלו. לכן, אנחנו בעיקר להשיג אנזים כבר התקפל שונה בצורה כזאת המקיימת תכונות האנזימטית שלו. טכניקות זיקה-תג ו / או בגודל הדרה אחרים אינם מסוגלים להפריד בין האנזים פעיל אנזים מת enzymatically. זה יהיה שימושי עבור פיתוח פרוטוקול בעתיד לשלב את נקודות החוזק של פרוטוקולי הטיהור 'קבוצות אחרות 15, 25, 26 (כלומר מפורשים תאים אנושיים או חרקיםמערכת יון) עם הכח של הפרוטוקול שלנו (כלומר, טיהור מבוססת-קטליטי) כדי לשפר עוד יותר על השיטה הזאת.
למרות בפרוטוקול זה הוא ספציפי כרגע עבור G4R1, זה יכול להיות מותאם בקלות לכל תלוי ATP, חלבונים בפתרון G4, לרבות, אך לא רק, BLM, wrn, FANCJ, חלבונים hnRNP, hPif1, ו / או ChlR1 / DDX1. על ידי שינוי הרצף של חומצות הגרעין מחויבות חרוזי streptavidin, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי לטהר אנזימי חומצות גרעין תלוי ATP אחרים עבורו המוצר של התגובה האנזימטית הוא כבר לא מצע של האנזים, כולל helicases חומצות גרעין nucleases.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות מקורות המימון שלנו, כולל מתנה נדיבה מקרן ור (כדי JPV), המכונים הלאומיים HealthGrant T32-CA079448 (כדי PJS), וקרנות ההפעלה אוניברסיטת בול סטייט (כדי PJS). המממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים וניתוח, ההחלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TriEx4-DHX36 plasmid | Addgene | 68368 | |
| Rosetta2(DE3)plysS competent cells | Novagen | 71403-4 | |
| S.O.C medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Difco Terrific Broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | 35 µg/mL in bacterial plates/large cultures |
| Carbenicillin (plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C3416 | 50 µg/mL in bacterial plates/large cultures |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Lysozyme (from chicken egg white) | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 8 | Universal Scientific Supply Co. | 1963-B | or from standard source |
| 1 M Tris-HCl, pH 7 | Universal Scientific Supply Co. | 1966 | or from standard source |
| 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 | For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-HCl, pH 6.8 | For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-Acetate, pH 7.8 | Universal Scientific Supply Co. | 1981 | or from standard source |
| 70% Ethanol | From standard source | ||
| Magnesium chloride (1 M solution) | Life Technologies | AM9530G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | |
| 20x SSC | Universal Scientific Supply Co. | 1665 | or from standard source |
| β-mercaptoethanol (2-BME) | Sigma-Aldrich | 63689 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Streptavidin paramagnetic beads | Promega | Z5482 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8 | Universal Scientific Supply Co. | 0718 | or from standard source |
| 0.2 M EDTA, pH 6 | Universal Scientific Supply Co. | From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl. | |
| A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) | Sigma-Aldrich | L5385 | |
| Cobalt metal affinity beads | Clonetech | 635502 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) | Sigma | A7699 | |
| 40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) | Biorad | 161-0148 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS) |
| 10% Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Universal Scientific Supply Co. | 1667 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or from standard source |
| 10x TBE | Sigma-Aldrich | 11666703001 | or from standard source |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source |
| TEMED | Sigma-Aldrich | 411019 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Broad Range Protein MW markers | Promega | V8491 | |
| Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") | Oligos Etc | 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’ | |
| TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") | Oligos Etc | 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’ | |
| Fluor-coated TLC plate | Life Technologies | AM10110 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | 30% in H2O |
| Coomassie R-250 | Sigma-Aldrich | 27816 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Multiband UV lamp | Capable of emitting UV light at 365 nm | ||
| Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Microcentrifuge | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Digital Sonfier | Branson | Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2 s ON/2 s OFF) | |
| 50 °C water bath | For formation of Z33 into quadruplex | ||
| 37 °C incubator for bacteria | For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| 37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria | For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| Spectrophotometer | capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000) | ||
| Thermometer | From standard source | ||
| PCR strip tubes | From standard source | ||
| 15 and 50 mL centrifuge tubes (polypropylene) | From standard source | ||
| Microcentrifuge tubes (2.0 mL) | From standard source | ||
| 500 mL centrifuge bottles (polypropylene) | Thermo Scientific | 3141-0500 | |
| Standard array of pipet tips and serological pipettes | From standard source | ||
| Gel-loading tips | From standard source | ||
| Automatic repeating pipette | For quick aliquoting of rG4R1; From standard source | ||
| Thermal cycler | From standard source | ||
| Liquid Nitrogen | From standard source | ||
| Dry ice | From standard source | ||
| Laemlli sample buffer | Biorad | 161-0737 | |
| Apparatus for running large slab gels | Biorad | We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad | |
| Magnet | Life Technologies | 12301D | We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement |
| Razor blades | From standard source | ||
| Filter paper and funnel | From standard source | ||
| Glass casserole dish | From standard source | ||
| Orbital shaker | From standard source | ||
| Kimwipes | From standard source | ||
| Clear sheet protectors | From standard source | ||
| Scanner and associated TWAIN software | From standard source | ||
| Image analysis software | Such as Fuji Multiguage, or equivalent | ||
| Microsoft Excel | Or equivalent |
References
- Qin, Y., Hurley, L. H. Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions. Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).
- Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes. Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).
- Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).
- Huppert, J. L., Balasubramanian, S. Prevalence of quadruplexes in the human genome. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).
- Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter. Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).
- Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M. Jr, Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
- Huppert, J. L., Balasubramanian, S. G-quadruplexes in promoters throughout the human genome. Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).
- Eddy, J., Maizels, N. Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome. Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).
- Eddy, J., et al. G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes. Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).
- Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
- Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary. Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).
- Creacy, S. D., et al. G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).
- Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
- Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme. Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).
- Sexton, A. N., Collins, K. The 5' guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation. Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).
- Smaldino, P. J., et al. Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3'-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding. PLoS One. 10 (7), e0132668 (2015).
- Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1. Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).
- Huang, W., et al. Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5'-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1. Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).
- Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU. Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).
- Yoo, J. S., et al. DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation. PLoS Pathog. 10 (3), e1004012 (2014).
- Lai, J. C., et al. The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis. Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).
- Zhang, Z., et al. DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells. Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).
- Kim, T., et al. Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).
- BD Biosciences. , Available from: http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf (2016).
- Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU. Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).
- Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).
