Summary
蛋白激酶是对于细胞间和细胞内信号转导至关重要的高度进化的信号酶和支架。我们提出了通过使用放射性标记的三磷酸腺苷（[γ- 32 P] ATP）测量激酶活性的方案，这是一种有助于阐明细胞信号调节的可靠方法。
Abstract
蛋白激酶能够响应于复杂的刺激阵列来控制大规模细胞变化，并且大量努力旨在揭示其调节的变构细节。激酶包括信号网络，其缺陷通常是多种形式的癌症和相关疾病的标志，使得能够操纵上游调节因子的测定平台和对于改进治疗学的研究至关重要的反应要求的验证。在这里，我们描述了一个基本的激酶测定，可以很容易地适应特定的实验问题，包括但不限于测试生物化学和药理学的作用，遗传操作如突变和缺失，以及细胞培养条件和治疗探针细胞信号传导机制。该测定使用放射性标记的[γ- 32 P] ATP，其允许定量比较和清楚的结果可视化，并且可以是mod如果用于免疫沉淀或重组激酶，特异性或典型的底物，在广泛的反应条件下使用。
Introduction
蛋白激酶是将细胞信号传递到适当的反应中所必需的复杂酶。鉴于其在维持体内平衡和预防或促进疾病状态方面的作用2 ，用于评估激酶活性的生物化学方法继续是描绘真核信号传导3的特征的有力工具。尽管使用磷酸特异性抗体的策略在测量不同治疗条件对细胞信号传导状态的影响方面已经具有高度的信息，但激酶测定允许直接根据激酶的酶活性来测量不同治疗条件的影响利益。虽然对于不使用放射性物质的类似测定法有几种选择5 ，我们仍然依靠这种方法对结果进行稳健的定量。那里是该测定的两个典型应用，两者都有价值的不同原因：免疫沉淀（IP）激酶测定（ 图1 ）和重组蛋白激酶测定（ 图2 ）。
IP激酶测定对于识别能够激活特异性蛋白激酶的因子以及测量抑制性治疗条件非常有用。简言之，将感兴趣的表位标记的激酶转染到培养的真核细胞中，进行各种处理，免疫沉淀，并测定将放射性标记的磷酸掺入模型底物（ 例如髓磷脂碱性蛋白（MBP））的能力。也可以通过免疫沉淀内源蛋白或任何数量的基因组编辑技术来进行IP激酶测定而不诉诸过表达。因为治疗是在文化中进行的，所以这种方法可以检测通过多个上游因素传播的刺激或通过体外读出的平行通路。该方法的一个主要优点是其不需要在其中直接上游或下游因子或磷酸化位点的先验知识。此外，一旦已经鉴定了感兴趣的激酶的特异性底物，与重组组分可以使用相同的激酶测定方案，以测量与天然底物的比活性，并在与质谱分析结合时鉴定特异性磷酸化位点。使用底物突变体的激酶测定可以进一步验证以这种方式鉴定的位点。最后，该方法也可用于检测和测量自磷酸化。
这里提供的方案假设用于在培养细胞中表达感兴趣的亲和标记的激酶的优化的蛋白质纯化方案或转染方法。有关转染，裂解，免疫沉淀和蛋白质纯化的更详细的论述我们建议参考Cold Spring Harbor Protocols 6 。有关测定开发和修饰的更多信息，请参阅蛋白质磷酸化：选择的酶学方法7 。
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Protocol
激酶纯化资源和一般免疫沉淀管道
注意：用于该测定的激酶可以来源于培养细胞的免疫沉淀物，或通过重组方法如亲和标记的纯化6 。以下是标记免疫沉淀的通用方案，其可能必须根据感兴趣的激酶进行修饰。一切尽可能保持在冰上。
- 向200μL细胞裂解液（通常〜1 mg / mL总蛋白浓度）中加入2μL1 mg / mL抗体，并在4℃下摇摆孵育1小时。
- 通过在5,000 xg（“触摸旋转”）下在4℃下短暂旋转30秒至1分钟，将蛋白质琼脂糖珠洗涤2-3次，并用移液管除去上清液，并将缓冲液重悬于缓冲液。
- 制备裂解缓冲液：50mM HEPES pH 7.7,150mM NaCl，1.5mM MgCl 2，1mM EGTA，10％甘油，0.2mM原钒酸钠，100mM氟化钠，50mMβ-甘油磷酸酯，0.1％Triton X 100或0.1％NP-40。
- 将30μL50％的蛋白A琼脂糖凝胶珠浆液在裂解缓冲液中加入到裂解物中;在4℃下孵育1小时，同时摇摆。
- 在4℃下触摸旋转以沉淀珠并除去上清液。
- 用1mL珠洗涤缓冲液（1M NaCl，20mM Tris pH 7.4）洗涤3次。
- 用1x激酶反应缓冲液（10mM HEPES pH8.0,10mM MgCl 2 ）洗涤一次。去除尽可能多的缓冲液，而不去除珠子。
2.初始化激酶反应
注意：对于IP激酶测定，〜15μL的悬浮珠是典型的起始样品。对于重组蛋白激酶测定，典型的起始量范围为1-10至25-50μL最终反应体积中的1-10-1.0μg。调整重组蛋白质样品的体积s等于其在初始化测定之前存储的缓冲液。当使用大量的激酶时，包括载体蛋白如BSA以帮助在测定期间保持蛋白质的稳定性。
- 准备下面给出的5x激酶反应缓冲液：
50mM HEPES pH 8.0
50mM MgCl 2
50mM苄脒（蛋白酶抑制剂）
50mM DTT（还原剂）
ATP（未标记或“冷”）250μM - 将激酶样品保存在1.5 mL管中。将以下反应混合物在分开的冷却的1.5mL管中制备：
21μLH 2 O
6μL5x激酶反应缓冲液
1μL放射性标记（“热”）ATP
2μL底物（〜5 mg / mL）
注意：对于重组激酶测定，可以调节体积以适应纯化的蛋白质。计算使最终反应体积为30μL。使用这个配方准备一个主人混合。在加入标记的ATP之前，将H 2 O稀释至0.01mCi /μL的比活性，然后加入反应混合物中。 - 为了初始化测定，将整个反应混合物加入激酶样品中，并根据测定的激酶的活性在30℃孵育5分钟至1小时。
注意：当使用其活性尚未测定的激酶时，在时间点之间以5分钟间隔进行激酶活性的时间过程。
3.反应终止和SDS-PAGE
- 放入冰上停止反应，并加入7.5μL5x Laemmli样品缓冲液6 。
- 在热块中在100℃下加热30秒至2分钟。
- 在10-15％SDS-PAGE凝胶上，每孔接触20μL/孔。运行凝胶足够长以分离激酶和底物（通常在5 W的恒定功率下1小时）确保保持凝胶装置屏蔽以限制暴露于32
- 在这里，使用自制的凝胶装置，但标准的市售迷你凝胶是完全适合的。使用尺寸如下：
凝胶：8厘米宽，5.5厘米长（分辨），1.5毫米厚度。
梳子：15孔，1.5mm厚，2.9mm宽，16mm深
4.凝胶染色和干燥
注意：对于所有步骤，请务必使用放射性屏蔽和佩戴个人防护装备来减少32 P的个人暴露。有关具体步骤的更多信息，包括一些有用的参考。
- 从玻璃/氧化铝平板上取出凝胶，并置于50毫升考马斯染色剂（10％冰醋酸，50％甲醇，0.25％R-250染料）中1小时。对于该步骤，使用比凝胶本身略大的容器。 8
- 将凝胶从染色剂移至定影液（10％冰醋酸）d，20％甲醇）以去污。将凝胶在600-700mL定影液中以50rpm在轨道振荡器上摇动过夜。将泡沫或打结的实验室擦拭物放在容器中，用凝胶吸收考马斯染料8,9 。
- 从固定溶液中取出凝胶，并在温和搅拌下浸泡在200 mL甲醇中1-2分钟，直到凝胶变成乳白色。这将有助于防止干燥步骤中的裂纹。
- 用甲醇将14厘米x 14厘米的定性滤纸弄湿，放在平板凝胶真空干燥器上。将凝胶放在滤纸正面朝上。
- 小心地用塑料盖住凝胶，以避免皱纹和气泡。在80℃下运行干燥器1.5小时。在真空得到打开盖子之后，如果需要的话，用软橡胶支架将所有的气泡推出。
放射自显影和闪烁计数
- 清除dri并将凝胶上的滤纸上贴上自动标记，磷光标尺或点。如果使用点确保它们处于非对称模式。这将使曝光和显影后的凝胶与胶片保持一致。
- 使用盖革计数器检查信号强度。对于较弱的信号，在-70°C至-80°C的强度屏幕曝光会增加胶片带密度。
- 在黑暗的房间里，将干凝胶放置在胶片盒中，胶片和增强屏幕从上到下按顺序依次为：凝胶，薄膜，增强屏幕。
- 将增强屏幕连接到盒子的盖子上，并将胶水贴在适当的位置，使此步骤更容易。当从32P的β粒子照射时，增强屏幕发光。这些光辐射比β粒子更有效地穿透膜。
- 确保从增强屏幕发出的波长相应池塘到电影最敏感的波长。
- 使用盖革计数器确定多长时间才能使用曝光：如果cpm计数为〜100或更低，请在-70°C下过夜。如果计数为〜10,000，则从1小时开始曝光并从那里进行优化。
- 在曝光结束时，去除胶片并在医疗/ X光片处理器中发展。如果在-70至-80℃下进行曝光，则可以将盒子温热至室温，以尽量减少膜上的凝结，或者在冷凝液形成10之前立即取出膜。
- 将膜放在干燥的凝胶/滤纸上，并将标记/点的图像与干燥凝胶上的标记/点对齐。在电影上标记对应于蛋白质标准的条带。标记蛋白质标准和哪些通道的反应是将来参考。
- 从胶片中消除与胶片上感兴趣的条带相对应的胶带，并将其放置在7mL闪烁瓶中。加入4 mL闪烁液，用液体闪烁计数器计数。确认计数器设置为监视32 P的正确能谱窗口。
注意：确保从无激酶对照泳道切除对应于底物的条带。这将用于计算将从所有样品闪烁计数中减去的背景辐射。
6.结果分析
注意：放射自显影图提供了结果的定性可视化。为了精确定量，可以用闪烁计数器测量32 P掺入。数据通常用相对活动来表示， 如图1B所示 。只要维持所有样品的均匀条件，比活度的相对测量就足以比较治疗。
- 当计算绝对比活动值时，请执行严格的操作对所有反应条件（包括激酶，底物和冷ATP浓度）进行优化，以确保在一段时间过程中活性的线性范围（ 例如 2×[激酶] = 2×比活性）。对于具有高比活性的激酶，可以进行具有增加的底物浓度的测定，因为激酶活性受底物量的限制。
- 以每分钟每mg激酶转移的磷酸纳米微粒单位计算感兴趣的激酶的比活性。
- 从计数带中的cpm中减去空白。
- 计算热ATP的衰减：[（1/2）^（t / t 1/2 ）] x 0.95其中t是参考日期以后的天数（应由供应商提供）， t 1/2是32 P的半衰期为14.3天，0.95反映了闪烁计数器的效率。示例：如果使用28天的热ATP，则衰减值应为0.245。
- 计算器测定中总ATP的皮摩尔（pmol）（通常等于反应中冷ATP的量）：测定体积（μL）×[冷ATP]（μM）=总ATP（pmols）。实施例：30μL×50μM= 1500pmol
- 计算cpm / pmol ATP：[热ATP x（2.2×10 7 ）×衰变系数] / pmol的冷ATP。
注意：2.2 x 10 7的值将0.01 mCi /μL的ATP转换为cpm。 - 以mg计算测定中的激酶量。对于重组激酶和免疫沉淀的激酶，标准方法如BCA测定适用于测定起始浓度。实施例：在50μL激酶反应中，wtERK20.0002μg/μL为0.01μg，或1×10 -5 mg。
- 计算测定中的总cpm。组装30μL反应，每个反应在凝胶上运行20μL。将计数的cpm（空白减去后）乘以总测定体积/体积负载的因子。继续以上例如，将所有计数乘以1.5或30/20。
- 计算测定的激酶的比活性：
测定中的总cpm）/（cpm / pmol ATP）/（测定时间（分钟））/（激酶的量，以mg计）
注意：将上述值除以1,000，可得到纳摩尔/分/毫克的比活度
- 计算多少摩尔磷酸盐掺入底物（只要其分子量已知）。一旦反应完成，这用于确定特定蛋白质上磷光体的数量。
测定中的总cpm）/（cpm / pmol ATP）] /（pmols中的底物量）
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Representative Results
WNK1 IP激酶测定
将Myc标记的WNK1转染到HEK293细胞中，并用抗Myc抗体11免疫沉淀。免疫沉淀物显示对模型底物MBP以及自身的激酶活性（ 图1A ）。然后通过相同的方法测试WNK1突变体对MBP的激酶活性，此时采用GST标记的构建体（ 图1B ）。相对于野生型的突变体激酶行为的分析揭示了对于最佳WNK1活性至关重要的残基。
将HEK293细胞暴露于一组药理和生化处理。使用针对WNK1 N末端肽产生的抗体，使用MBP作为底物测定免疫沉淀的内源性WNK1激酶活性。表皮生长因子（EGF），一种已知的活化物或ERK1 / 2信号传导，诺考达唑，靶向微管动力学的药物，茴香霉素，真核翻译抑制剂和溶血磷脂酸（LPA），一种有效的丝裂原，都无法引起磷酸化MBP的强大增加。相比之下，NaCl被证明是WNK1激酶活性的调节剂。
ERK2重组蛋白激酶测定
携带N末端6His标签的大鼠ERK2在细菌细胞中表达并用镍树脂12亲和纯化。蛋白质通过MonoQ柱上的离子交换层析进一步纯化，其中测试几种洗脱级分的激酶活性（ 图2A ）。由于ERK2需要MEK进行双重磷酸化以达到最大激酶活性，所以在不存在MEK的情况下从细菌中纯化的ERK2在很大程度上是无活性的。因此，为了测试分数的推荐对于MBP活性的二级ERK2，称为MEK1R4F的MEK1的组成型活性形式被包括在激酶反应中。值得注意的是，MEKR4F对MBP没有高的激酶活性（ 图2 ）。
使用类似于图2A所示的测定法，使用MBP激酶活性来测量从细菌培养物相对于野生型蛋白质纯化的重组ERK2突变体的活性（ 图2B ）。尽管ERK2在MEKR4F刺激下能够磷酸化MBP，但是在二磷酸化（T188D和T188E）的典型位点附近的催化赖氨酸（K52R）或苏氨酸的突变显着地消除了ERK2激酶活性。 ERK2-T188D和ERK2-T188E显示出朝向小的柔性肽的边缘激酶活性（ 图2C ），然而，它们不能稳定地磷酸化已知的ERK2底物Nup153和PDX1（ 图2 D）。
图1：WNK1的免疫沉淀激酶测定。 （ A ）用没有插入片段或pCMV5-Myc-WNK1的pCMV5-Myc转染HEK293细胞，用抗Myc抗体免疫沉淀标记的蛋白质，然后使用MBP作为底物进行激酶测定。放射自显影显示在左侧，免疫沉淀在右侧。 （ B ）各种GST-WNK1突变蛋白用于以MBP为底物的激酶测定; MBP磷酸化被表达为相对于野生型WNK1的活性。 （ C ）内源性WNK1由用各种刺激处理的HEK293细胞免疫沉淀，并测定自身磷酸化。这个数字从Xu 等人修改，2000 11 。5504fig1large.jpg“target =”_ blank“>请点击此处查看此图的较大版本。
图2：ERK2的重组蛋白激酶测定。 （ A ）来自MonoQ阴离子交换柱的纯化的ERK2级分用于在存在或不存在ERK1激酶活性的组成型活性刺激物MEK1R4F的MBP的激酶测定中。 （ B ）测试ERK2突变体对MBP的激酶活性。 （ C ）激活环突变体ERK2-T188D和ERK2-T188E向小的典型肽底物显示边缘激酶活性。 （ D ）通过MEK1R4F与已知的ERK2底物核蛋白-153（Nup153）和胰腺和十二指肠同源异型盒1（PDX1）的活化后的ERK2或T188D激酶活性的比较。磷酸化底物由楔形和磷光体表示用星号表示ERK2和T188。经McReynolds 等人许可转载（并修改） ，2016 12 （版权所有2016美国化学学会）。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
激酶是一种多样化的蛋白质家族，其在多种情况下已经发展了广泛的功能，激酶测定在研究几种信号蛋白方面已经非常有用，并且极大地有助于我们目前对细胞通信的理解。值得注意的是，尽管在结构和活性上存在重大差异，但使用相同的基本测定来表征两种不同的激酶。 WNK1激酶含有非典型催化口袋，临界赖氨酸转移到独特的位置，已知通过激酶和脚手架功能调节阳离子氯化物共转运蛋白的作用。已知WNK1的激酶活性具有低周转数，即使在其最佳表征的底物，蛋白激酶氧化应激反应1（OSR1）和SPS / STE20相关的脯氨酸富含丙氨酸激酶（SPAK）。相比之下，ERK2以及紧密相关的激酶ERK1在激活时显示出强大的激酶活性
测定的最关键的方面是反应组装。为了进行准确的时间点测量，必须特别注意初始化激酶反应。激酶测定进行四个基本要求：激酶，底物，ATP和金属离子。对于主要用于真核激酶的该方案，使用MgCl 2作为镁源。重组蛋白激酶和IP激酶制剂通常含有镁，使得MgCl 2作为反应起始剂不足。同样地，在添加标记（“热”）ATP之前加入未标记的（“冷”）ATP可能引起不适当的反应。我们建议使用促进MgCl同时添加的浓缩激酶反应缓冲液制备反应 尽管IP激酶测定和重组蛋白激酶测定有一些区别，他的实验范例两者都显示了这种测定可以多么通用。实际上，有些激素测定类型的特征可能被混合，如有丝分裂原激活的蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK / ERK）信号通路的研究。在该途径中，ERK1 / 2被上游因子MAPK / ERK激酶1（MEK1）双磷酸化激活。以前的研究表明，虽然MEK1以及称为MEK1R4F的组成型活性突变体能够激活ERK1 / 2，但对MBP具有非常低的活性。因此，从细菌细胞中纯化的ERK1 / 2除了用MEK1R4F处理外，还显示出对MBP的激酶活性有限，从而为野生型ERK1 / 2与突变体构建体的激酶活性进行比较创造了一个强大的平台， 如图2所示 。包含免疫沉淀的组分可以增加更多的细微差别，突出激酶测定作为一种高度适应性的方法来探测多方面的n这些重要信号分子的存在。 虽然有些人可能发现使用放射性物质繁琐，但放射性标记的激酶测定的定量易处理性是其主要优点之一。然而，天然产物化学，基因组学和质谱学领域的最新进展已经产生了对修饰的激酶测定的需求读数更适合高通量应用15 。因为这些测定法利用不同的标记材料，所以在准确性方面做出了妥协，但是可以通过使用放射性标记的测定来验证筛选结果来克服这些。随着我们对蛋白激酶信号传导的了解的增加，仍然很清楚，能够挑选激酶调节功能细节的技术将继续有助于开发工具和疗法。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
作者感谢Cobb实验室的所有现任和前任成员有价值的工作和讨论，Dionne Ware提供行政协助。这些研究得到了National Institutes of Health Grant R37 DK34128和Welch Foundation Grant I1243对MHC的支持
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 | |
| Radiolabeled [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610737 | |
| Radioactive shielding | Research Products International | BR-006 | |
| R-250 dye (Coomassie) | Thermo Fisher | 20278 | |
| Whatman Grade 3 qualitative filter paper | Whatman | 1003-917 | |
| Slab gel vacuum dryer | Bio-Rad | Model 583 Gel Dryer #1651745 | |
| Autorad marker | Agilent Technologies | 420201 | |
| Phosphorescent ruler | Sigma Aldrich | R8133 | |
| Phosphorescent dots | Sigma Aldrich | L5149 | |
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 with 44-9 detector | |
| BioMax Cassette 8 x 10" | Carestream Health | 107 2263 | |
| BioMax MS Film 8" x 10" | Carestream Health | 829 4985 | |
| BioMax MS Intensifying Screen 8" x 10" | Carestream Health | 851 8706 | |
| Medical/X-ray film processor | Konica Minolta | SRX-101A | |
| Scintillation vials | Research Products International | 125500 | |
| Scintillation fluid | MP Biomedicals | 188245305 | |
| Beckman LS 6500 Scintillation counter | Beckman | LS 6500 |
References
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