Summary
Vi beskriver ett protokoll för dissektion, fixering och immunfärgning av steroidogena organ i Drosophila larver och vuxna kvinnor att studera steroid biosyntes hormon och dess regleringsmekanism. Förutom steroidogena organ, visualisera vi innervation av steroidogena organ samt steroidogena målceller såsom groddlinje stamceller.
Abstract
I flercelliga organismer, är en liten grupp av celler utrustad med en specialiserad funktion i sin biogena aktiviteten inducerar en systemisk reaktion på tillväxt och reproduktion. I insekter, larver prothoracic körteln (PG) och den vuxna kvinnliga äggstocken spela viktiga roller i biosyntes de viktigaste steroidhormoner som kallas ecdysteroids. Dessa ecdysteroidogenic organ innerveras från nervsystemet, genom vilka tidpunkten för biosyntes påverkas av miljöfaktorer. Här beskriver vi ett protokoll för att visualisera ecdysteroidogenic organ och deras interaktiva organ i larver och vuxna i bananflugan Drosophila melanogaster, vilket ger en lämplig modellsystem för att studera steroidhormoner biosyntesen och dess regleringsmekanism. Skicklig dissektion ger oss möjlighet att behålla positionerna för ecdysteroidogenic organ och deras interaktiva organ, inklusive hjärnan, den ventrala nerv sladd, och andra vävnader. Immunfärgning med enntibodies mot ecdysteroidogenic enzymer, tillsammans med transgena fluorescensproteiner drivna av vävnadsspecifika promotorer, är tillgängliga för att märka ecdysteroidogenic celler. Dessutom kan de innervationer av ecdysteroidogenic organ också märkas genom specifika antikroppar eller en samling av GAL4 förare i olika typer av neuroner. Därför kan ecdysteroidogenic organ och deras neuronala anslutningar visualiseras samtidigt av immunfärgning och transgena tekniker. Slutligen beskriver vi hur man visualisera könsceller stamceller, vars spridning och underhåll styrs av ecdysteroids. Denna metod bidrar till övergripande förståelse av steroid biosyntes hormon och dess neuronal regleringsmekanism.
Introduction
I flercelliga organismer, är en grupp av celler utrustad med en specialiserad funktion i sin biogena aktivitet som är viktigt för hela kroppen. Att fullgöra sina uppgifter, varje vävnad eller organ uttrycker en rad gener relaterade till deras funktioner och kommunicerar med andra vävnader att iscensätta sin verksamhet i samband med utveckling. För att karakterisera sådana specialiserade cellulära funktioner och interaktioner mellan organ behöver vi ange en grupp celler tillsammans med andra typer av celler hålls intakt i flercelliga arkitekturen.
Ett exempel på sådana specialiserade organ är en steroidogen organ, där många biosyntetiska enzymer medierar stegen omvandlings från kolesterol till aktiva steroidhormoner 1. De flesta av dessa enzymgener är specifikt uttryckt i steroidogena organ och biosyntesvägen är hårt reglerad av många externa stimuli via humorala ingångar och neuronala ingångar. En gångsyntetiserade, steroidhormoner utsöndras i hemolymfa och är riktade till många vävnader och organ för reglering av uttryck av en mängd gener 2. Därför effekten av en steroid hormon framkallar ett systemiskt svar för att upprätthålla homeostas, tillväxt och reproduktion.
Att undersöka funktionerna hos steroidhormon-biosyntes och de pleiotropa åtgärder av steroidhormoner, kan Drosophila melanogaster användas som ett lämpligt modellsystem. Under larvstadier, insektsteroidhormon, ecdysteroid, biosyntetiseras i en specialiserad endokrina organ som kallas prothoracic körteln (PG) 3. I PG, flera ecdysteroidogenic enzymer specifikt katalyserar de multipla omvandlingssteg från kolesterol till ekdyson, som styr ömsat och metamorfos vid de lämpliga utvecklingsstadier 4. Därför är en dynamisk förändring i ecdysteroid titer reglerasav många signalvägar som svar på miljösignaler. Å andra sidan, i sitt vuxna stadium, spelar ecdysteroid väsentliga roller i fysiologi, inklusive reproduktion, sömn, minne, och livslängd 5, 6, 7, 8. Det är känt att ecdysteroid aktivt biosyntetiseras i äggstocken, reglerar progressionen av oogenes 6, 7, 8, 9, 10, 11. Nyligen har vi rapporterat att antalet nedärvda stamceller (GSCs) påverkas vid ecdysteroid och kön peptidsignalering som svar på parning stimuli 12.
Kraftfulla verktyg i D. melanogaster genetik och cellbiologi, inklusive väl kommenterad genominformationen, binär genexpressionssystem, och transgena RNAi tekniker, har gjort det möjligt för oss att identifiera gener som är väsentliga för ecdysteroid biosyntes i PG och äggstocken 13, 14, 15. När väl de ecdysteroidogenic generna har identifierats, kan den transkriptionella regleringen av dessa gener och de dynamiska lokaliseringar av genprodukter att undersökas i biosyntesvägen 16. För detta ändamål, kvantitativt-omvänd transkription-PCR, RNA in situ hybridisering, och immunhistologisk analys utförs. Tillämpningen av dessa tekniker innefattar en utmanande uppgift; genomarbetade dissektion av PG eller äggstocken. I synnerhet är PG av bananfluga relativt mindre än den för andra insekter (t.ex. för silkesodling och blås fly), så måste man utöva den vitala skicklighet bananfluga dissektion för provtagning. Dessutom, båda ecdysteroidogenic organ mottar innervations från det centrala nervsystemet (CNS) 17, 18, 19, 20. Således för noggranna anatomiska analyser de ecdysteroidogenic organ bör hållas intakt tillsammans med CNS och andra organ, för att inte störa deras neuronala anslutningar.
Här ger vi protokoll för dissekering och visualisering av steroidogena organ i D. melanogaster. Att lära sig dissektion tekniken är nyckeln utgångspunkten för dessa experiment. Dessutom kan man med framgång märka steroidogena organ samt deras interaktiva organ med flera antikroppar och GAL4 föraren linjer. Med utnyttjande av dessa tekniker, material och genetik kan man studera de omfattande mekanismer av steroidhormon biosyntes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Den övergripande systemet för protokoll visas i figur 1.
1. Dissekering av Larvernas ring Gland (RG)
OBS: I D. melanogaster, som hör till cyclorrhaphous Diptera, är PG inuti en komposit endokrint organ som kallas ringen körteln (RG, figur 2D). Eftersom det är omöjligt att PG är kirurgiskt separerad från andra typer av celler (som diskuteras senare), är en praktisk mål att isolera en intakt, oskadad RG av dissektion.
- Beredning av larver vid de lämpliga utvecklingsstadierna
OBS: För att synkronisera utvecklingsstadier i D. melanogaster larver, är det nödvändigt att samla ägg inom ett smalt tidsfönster och att samla in larver vid lämpliga tidpunkter.- Samla ägg för 2 h på en druvsaft agarplatta vid 25 ° C.
- Samla nykläckta 1
- Vid lämplig tidpunkt, samla iscensatt larver med en engångsplastslinga för att undvika oönskade skador. För att minimera en skillnad i utvecklings progression av 3: e instar larver, samla in de två nd instar larver vid 70 hæl (48 HAH) och tillåta dem att molt i 2 timmars intervall. Därefter uppsamlades den 3: e instar larver inom 2 h efter den L3 ecdysis; Detta förfarande ger 0-2 hAL3E larver.
- Överför iscensatt larver till en maträtt fylld med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Skölj larver med PBS för att avlägsna kvarvarande mat från kroppen.
- Grov dissektion av larver underdissekera mikroskop
- Håll munnen krok på en larv med pincett. Avskilja larvkroppen vid den främre en tredjedel av kroppens längd med hjälp av mikro sax.
- Håll den avskurna ändan av den främre larvkroppen med en pincett. Med hjälp av andra pincett, tryck försiktigt toppen av huvudet mot insidan av kroppen; detta förfarande vänder larvkroppen inifrån och ut.
OBS: Detta steg kan hoppas över för dissektion av 1: a INSTAR larver. - Upprepa steg 1.2.1-1.2.2 med ytterligare larver under 5-10 min.
OBS: Antalet larver bör vara lika med eller mindre än 20 för att spara tid för dissekering.
- Filé dissektion av larver
OBS: Denna metod gör det möjligt att hålla position vävnader att förbli intakt.- Låt larver i enbart vatten under 1 timme. Larverna är immobiliserade på grund av kvävning.
- Sätta en larv ryggsidan uppåt i en droppe PBS på en kiselbelagdskålen, med sin ryggsidan uppåt.
OBS: Den dorsala sidan har 2 trakealtuber körs i längdriktningen. - Under ett dissektionsmikroskop, sätt en insekt stift i den främre spetsen av larven med pincett. Sträcka larvkroppen till den bakre sidan och sätta en andra tapp i den bakre spetsen av larven.
OBS: Förutom insektsstift, kan en nål gjord av en volframtråd vara användbar 21. En nål kan bäddas in i en pipettspets genom upphettning för användning som en dissekera nål. - Under ett dissektionsmikroskop, gör ett litet snitt nära svansen med mikro sax. Från snittet, skär rygg nagelbanden i längdled längs ryggens mittlinje mot huvudet. Var noga med att inte skada vävnader i nagelbanden.
- Sträck stomvägg nagelband på varje sida och placera 4 stift i varje hörn av den dissekerade stomvägg.
- Avlägsna en del av främre fett kroppen med pincett, för att exponera hjärnan-RG complex exponeras på ytan. Ta ett par spottkörtlarna, om det behövs.
- Fixering och färgning av vävnad med immunohistokemi
- Sätta den främre en tredjedel av de larv organ (steg 1.2.2) till ett 1,5 ml mikrorör fyllt med 500 mikroliter fix lösning (4% paraformaldehyd i PBS). Fixa mindre än 20 prover på en gång, på annat sätt PBS fästa till de fasta prover kan orsaka en ogynnsam utspädning av fixativ. För filé dissektion, ta bort en droppe PBS och sedan lägga till en droppe av fix-lösning.
OBS: För fix-lösning, kan antingen 3,7% formaldehyd eller 4% paraformaldehyd användas. - Inkubera de dissekerade vävnader i fix-lösning under 30 min vid rumstemperatur (RT) eller alternativt för 2 timmar vid 4 ° C.
- Ersätta den fix-lösning med 500 | il PBS och snabbt skölja proverna 3 gånger. Tvätta proverna med 500 ul 0,3% PBT (PBS + 0,3% oktylfenol-etoxylat) under 15 min på en rocker vid RT. För filé dissektion, ta bort insekter stift och överföra proverna in i ett 1,5 ml mikrorör.
OBS: För att öka permeabiliteten av antikroppar in i vävnader, är proverna behandlas med 500 mikroliter 2,0% PBT under 1-2 h på en rocker vid RT. - Ersätta PBT med 500 mikroliter blockeringslösning (2% bovint serumalbumin i PBT). Inkubera proverna under 1,5 h på en rocker vid RT.
- Ersätta den blockerande lösningen med 50 mikroliter den primära antikroppen lösning, dvs antikroppar utspädda i blockeringslösningen.
- Inkubera proverna över natten på en rocker vid 4 ° C.
- Ersätta den primära antikroppslösningen med 500 mikroliter 0,3% PBT och snabbt skölja proverna 5 gånger. Tvätta proverna 3 gånger med 500 | il 0,3% PBT under 15 min vardera på en rocker vid RT.
- Ersätta 0,3% PBT med 50 mikroliter sekundärlösningen antikropp (färgämnes konjugerade antikroppar utspädda i blockeringslösning). För nukleär färgning, 0,5 | il 4' , 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 0,1 mg / ml stamlösning) sättes till 50 mikroliter lösning. Inkubera proverna på en rocker under 2 h vid RT eller alternativt vid 4 ° C över natten.
OBS: Håll proverna i mörker. - Ersätta antikroppslösningen med 500 mikroliter 0,3% PBT och skölj 5 gånger. Tvätta proverna 3 gånger med 500 | il 0,3% PBT i 15 min vardera vid RT.
- Sätta den främre en tredjedel av de larv organ (steg 1.2.2) till ett 1,5 ml mikrorör fyllt med 500 mikroliter fix lösning (4% paraformaldehyd i PBS). Fixa mindre än 20 prover på en gång, på annat sätt PBS fästa till de fasta prover kan orsaka en ogynnsam utspädning av fixativ. För filé dissektion, ta bort en droppe PBS och sedan lägga till en droppe av fix-lösning.
- Fina dissekering av hjärnan-RG komplex innehållande PG och monterings
- Använd en engångs pipett för att överföra immunofärgade proverna till en maträtt fylld med 0,3% PBT.
OBS: För att undvika obekväm bubblor under dissekering och montering, kan 0,3% PBT ersätts med PBS. - Under ett dissektionsmikroskop, hålla nagelbanden eller munnen krok med en pincett. Med användning av en 27 G nål fäst till en 1 ml spruta som en "kniv", skär den främre spetsen av matstrupen och ögonskivor för att avlägsna hjärnan-RG-eye skivkomplexet från kroppen nagelbanden.
- Sepagradera matstrupen och tarm från hjärnan-RG-ögonskiv komplex med pincett. Eftersom matstrupen passerar genom hjärnan ovanför den ventrala nerv sladd (VNC), dra ut tarmen till den bakre sidan.
OBS: För att ta bort extra imaginal skivor från proverna, skär sambanden mellan hjärnan, ögonskivor och ben skivor med en nål kniv. - Upprepa steg 1.5.1-1.5.4 för andra prover.
OBS: För att förhindra vävnadsrester fastnar till proven, överföra varje avslutad prov till en annan ren skål fylld med 0,3% PBT eller PBS. - Överför proverna till mitten av en ren glasskiva med en mikropipett.
OBS! 2: a eller 3: e stadiet larver, bör i slutet av en mikropipett spets trunkeras med ett rakblad. - Under ett dissektionsmikroskop, rikta individuella prover med sin ryggsidan upp med hjälp av pincett.
OBS: RG är belägen på den dorsala sidan av hjärnan (figur 2A). Denna inriktning underlättar om enskilda prover under avbildning. - Luta en glasskiva och torka bort så mycket överskott PBT som möjligt. Sätta en droppe monterings reagens på en sida av sliden. Placera kanten av ett täckglas från den andra sidan av nedgången och sätta locket glida på proverna långsamt med pincett.
OBS: Denna procedur hindrar proverna från att röra sig utanför täckglas. - Lagra proverna vid 4 ° C. Förvara proverna i mörker.
- Använd en engångs pipett för att överföra immunofärgade proverna till en maträtt fylld med 0,3% PBT.
2. Dissekering av Ovary i vuxna kvinnor
- Framställning av vuxna kvinnor
- Feed kvinnliga flugor med standard jäst / majsmjöl flyga mat för 3-4 dagar för att göda upp äggstocken. Bibehålla vid 25 ° C.
- Dissekering av den vuxna kvinnliga äggstocken
- Söva kvinnliga flugor med CO 2 gas och avskurna huvudet.
- Överföra gylf organ till en 3 cm skålfylld med PBS.
- Under ett dissektionsmikroskop, hålla bröstkorgen på ryggsidan med hjälp av pincett. Förstå den abdominala segmentet A5 eller A6 med de andra pincett och skala bort den abdominala nagelband mot den bakre sidan. Torka av den klibbiga nagelband från spetsen av pincett.
- Nyp en äggledare och ta ut äggstocken från kroppen.
- Kamma och sprida tips av äggstocken med pincett.
OBS: Denna operation förbättrar effektiviteten av immunfärgning.
- Dissekering av vuxna kvinnliga hjärnan, VNC och reproduktiva organ.
OBS: Denna metod gör det möjligt att innervation i äggstockarna hållas intakt.- Söva kvinnliga flugor med CO 2 gas och överföra dem till en kiselbelagd skål fylld med PBS.
- Under ett dissektionsmikroskop, hålla snabel och skala bort huvudet nagelband att exponera hjärnan med pincett. Ta bort luftstrupen fäst till hjärnan.
OBS! Brain är ett vitt och rundad struktur. Hjärnan ansluter till VNC i bröstkorgen. - Håll bröstkorgen på ryggsidan och skära av ben och vingar med en pincett. Med hjälp av andra pincett, skala bort bröstkorgen ventrala nagelband från baserna i benen. När VNC är exponerad, avlägsna kvarvarande dorsala nagelband och muskler fästa vid VNC använder pincett. Var noga med att inte skada kopplingen mellan hjärnan och VNC.
- Använd pincett för att skala bort buken nagelband och exponera äggstocken och deras interaktiva organ, inklusive nervceller, grödan, tarmen, äggledaren, livmodern, och medhjälpare körteln.
- Ta bort de kvarvarande vävnader inklusive luftstrupen och fettet kroppen med hjälp av pincett.
- Fixering och färgning av vävnad med immunohistokemi
- Överföra cirka 8-10 par av äggstockarna till ett 1,5 ml mikrorör fyllt med 250 mikroliter av fix-lösning (4% paraformaldehyde i PBS) och inkubera proverna under 30 min vid RT.
- Ersätta den fix-lösning med 500 | il PBS och snabbt skölja proverna 3 gånger.
- Tvätta proverna 2 gånger med 500 | il 0,1% PBT för 5 min vardera vid RT.
- Ersätta PBT med 50 | il blockerande lösning. Inkubera proverna under 1 h på en rocker vid RT.
- Ersätta den blockerande lösningen med 50 mikroliter den primära antikroppslösningen.
- Inkubera proverna över natten på en rocker vid 4 ° C.
- Ersätta den primära antikroppslösningen med 500 mikroliter 0,1% PBT. Tvätta proverna 3 gånger med 500 | il 0,1% PBT under 15 min vardera på en rocker vid RT.
- Ersätta 0,1% PBT med 50 | il sekundär antikropp lösning. För nukleär färgning, tillsätt 0,5 | il DAPI till 50 mikroliter lösningen. Inkubera proverna under 2 h på en rocker vid RT.
- Ersätta den sekundära antikroppslösningen med 500 mikroliter 0,1% PBT. Tvätta proverna 3 gånger med 500 | il 0,1% PBT under 15 min vardera på en rocker vid RT.
OBS: Tvättningsförfarandet kan utföras vid 4 ° C över natten. Förvara proverna i mörker.
- Montering av proverna på glasskivor
- Överföra proven till en glasplatta med 0,1% PBT med användning av en mikropipett.
OBS: För att undvika obekväm bubblor under dissekering och montering, kan 0,1% PBT ersätts med PBS. - För äggstocken, separera strängarna hos de ovarioles från varandra med pincett under ett dissektionsmikroskop. Inte skada spetsarna på ovarioles innehåller germaria. För hjärnan-VNC-reproduktivt organ-komplex, avlägsna kvarvarande nagelband och arrangera den position på ett objektglas.
- Torka bort så mycket överskott PBT som möjligt och sätta en droppe monterings reagens i mitten av proverna. Placera ett täckglas långsamt med hjälp av pincett.
- Lagra proverna vid 4 ° C. Förvara proverna i mörker.
- Överföra proven till en glasplatta med 0,1% PBT med användning av en mikropipett.
- Observera proverna under mikroskop och föra steroidogena organ i synfältet. När vyn är fast, växla avbildningssystemet till bildförvärvsläge.
OBS: 10-20x objektiv används för att erhålla bilder av hjärnan RG komplex eller hela äggstocken. Alternativt är 40-63X objektiv (vatten- eller oljeimmersion) användes för att visualisera den subcellulära lokaliseringen av proteiner i GSCs eller de neuronala innervationer av PG och äggstocken. - Ställ in parametrarna för bildtagning på den bifogade programvaran. Välja den kombination av fluorescens (t.ex. GFP och RFP). Genom snabb avsökningsproceduren, justera lasereffekten, känsligheten hos detektorerna (Gain / Offset), och storleken på det lilla hålet.
OBS: För att förvärva bilder med hög kvalitet bör avsökningslasereffekten och känsligheten hos detektorn (Gain) optimeras för varje prov. Att beskriva formenav vävnaderna, kan en genomlysningsbild tas i tillägg till en fluorescerande bild. - Ta Z högar av bilderna. Under en kontinuerlig snabb skanning Flytta fokalplanet med fokus drivningen av mikroskop och ställa in startpositionen och slutpositionen. Antalet segment och intervallavståndet mellan skivorna anpassas därefter.
- Välj skanningshastighet, skanningsmetoden och den dubbelriktade skanningsläget.
- "Starta verkliga skannar" för bildtagning.
- Spara bilden med formatet på den bifogade programvaran.
OBS: De ursprungliga bildfilerna innehåller information om bildförvärvsparametrar och våg. Exporterade bilder kan bearbetas med hjälp av en bildbehandlingsprogram i datorn 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi använde ovanstående protokoll för att visualisera steroidogena organ och deras interaktiva organ i D. melanogaster larver och vuxna kvinnor. Det övergripande systemet för protokoll visas i figur 1.
RG, inklusive PG (figur 2D), är mindre och mer transparent än hjärnan och är belägen vid den främre-dorsala sidan av hjärnan (figur 2A-C och 3A-E). Att märka PG celler har flera grupper genererat olika typer av antikroppar mot ecdysteroidogenic enzymer (dvs Neverland 23, spookier 24, Höljet 20, Phantom 25, disembodied 25, och Shadow 26). Bland dem är anti-Shroud (Sro) antikropp tillförlitligt användas för att märka PG genom immunfärgning (figur 2C, 2E, och 3C). Alternativt, Binary-gen-expressionssystem, GAL4 / UAS systemet 27, kan användas för att uttrycka fluorescerande proteingener i PG-celler. Genom promotoranalys av ecdysteroidogenic genen fantom (phm), kan PG specifik promotor inducera genuttryck uteslutande i PG 28. Därför kan de PG cellerna vara specifikt visualiseras genom att uttrycka GFP eller RFP under kontroll av phm-GAL4 # 22 (Figur 3D).
Att visualisera den neuronala anslutningen mellan PG och hjärnan, kan en grupp av neuroner märkas med mCD8 :: GFP under kontroll av olika GAL4-drivrutiner och antikroppar (Figur 2C, 2E, 3D, och 3E). Den FlyLight databas GAL4 linjesamlingar är optimerad för märkning nervceller 29. Bland dem, etiketter GMR45C06-GAL4 PG-utskjutande neuroner (Figur 2C och E). den immunostaining av GFP-uttryckande larver med anti-GFP-antikroppen är effektiv för att förbättra GFP-signaler. Dessutom, TRH-GAL4> mCD8 :: GFP larver visar stomatogastric nervsystemet, i vilket serotonerga neuroner projekt för att inte bara PG, men också till förmage (PV, insekt foregut) och svalgmusklerna (PM) (fig 3D och E) 20, 30. Därför, är det viktigt att bibehålla positionen för RG, hjärnan och de andra omgivande vävnader under filé dissektioner (Figur 3).
Hos vuxna kvinnor, påverkar äggstocks ecdysteroid många aspekter av oogenes, såsom GSC proliferation, cysta differentiering, ägg kammaren tillväxt, och stressrespons 11. Som i PG, är ecdysteroidogenic enzymer i äggstocken också visualiseras med de specifika antikropparna som beskrivits ovan 12, 31.Som en nedströms händelse på vilken ecdysteroider handling, är antalet GSCs i germarium vårt fokus (figur 4). Även om germarium är en sammansättning av flera celltyper, är GSCs specificeras av immunfärgning med två GSC markör antikroppar, 1B1 och D E-cadherin 32. Att visualisera innervation i äggstockarna, är äggstocken dissekeras tillsammans med hjärnan, VNC, gut, skörd, livmoder, och spermatheca (Figur 5). Neuroner visualiseras genom mCD8 :: GFP under kontroll av nSyb-GAL4, en pan-neuronal drivrutin (figur 5B och D). Musklerna runt äggstock, livmoder, och tarm färgas med färgämnet-konjugerat falloidin.
Figur 1: Den övergripande systemet för protokoll. Två distinkta dissektion metoder är applickunna larver och vuxna kvinnor, beroende på syftet med experimenten. Monteringsmetoder är också utformas enligt provbetingelser. Fixering, färgning och avbildningstekniker är i princip gemensamma för alla prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Visualisering av PG och PG-utskjutande nervceller. (A och B) Hjärnan-ringen körtel (RG) komplex av vildtyp 3: e INSTAR larv. I (B), är PG beskrivs av streckade linjer. Den filamentösa struktur mellan hjärnan och RG är luftstrupen. (C - O) The innervation av PG visualiserades med mCD8 ::GFP drivs av GMR45C06-GAL4 i FlyLight samling. PG och GFP-positiva neuroner var märkta med anti-Sro antikropp (magenta) och anti-GFP-antikropp (grön), respektive. Den fluorescerande bilden slås samman med den genomlysningsbild för att ange konturerna av vävnader. I (D), PG, corpora allata (CA) och corpora cardiaca (CC) illustreras. De PG-utskjutande nervceller är mer framträdande i hög effekt bild med 40X objektiv (pilar i E) än lågenergi- bild med 10X objektivlins (C). Scale bar = 100 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: De stomatogastric nervsystemet Projekt till PG, PV, en nd PM. (A och B) Filé dissektion av en vild-typ 3: e instar larv. Positionerna för PG, hjärna (Br), ventrala nerv sladd (VNC), ögonskivor (ED), vingskivorna (WD), faryngeal muskel (PM), och körtel (PV) förblir intakta. (C) Den PG uteslutande märktes med anti-Sro antikropp (magenta). (D) PG märktes med turboRFP driven av phm-GAL4 # 22. Serotonerga neuroner var märkta med anti-5HT-antikropp (grön). (E) Den stomatogastric nervsystemet visualiserades med mCD8 :: GFP drivs av TRH-GAL4. Serotonerga neuroner skjuter till PG, PM och PV (pilar). Scale bar = 100 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
filer / ftp_upload / 55.519 / 55519fig4.jpg"/>
Figur 4: Den germaria av vildtyp Flugor innehållande en, två eller tre GSCs. (A) En översikt av den kvinnliga reproduktiva organ. En äggstock består av 16-20 ovarioles som strängar av ägg kammare. Den germarium, där GSCs finns är vid spetsen av varje ovariole. (B - D) En, två, eller tre GSCs är belägna i varje germarium (vita streckade cirklar) av vildtyp honor. GSCs färgas med 1B1-antikropp (grön), vilka etiketter en sfärisk struktur som kallas de spectrosome (pilar) och en membranös cytoskelett struktur känd som fusome. Cellgränserna visualiseras med anti D E-cadherin-antikropp (magenta). Scale bar = 10 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: den kvinnliga reproduktionsorgan och deras interaktiva organ. (A) Den äggstocken (Ov), tarm (Gut), gröda (Cr), hjärna (Br), ventrala nerv sladd (VNC), och spermatheca (Sp) dissekerades under mikroskop. (B - D) innervation av äggstocken visualiserades med mCD8 :: GFP drivs av nSyb-GAL4. GFP-positiva neuroner sträcker sig från VNC (pil), som skjuter ut på ytan av äggstockarna (pilspetsar). Äggstockarna beskrivs med streckade linjer. Proverna färgades med anti-GFP-antikropp (grön) och färgämne-konjugerat falloidin (magenta). Falloidin associerar med den filamentösa aktin av muskler runt äggstockarna (Ov) och livmoder (Ut). Illustrationen visas i C. Scale bar = 200 | im.rge.jpg" target = '_ blank'> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi studerade ecdysteroid biosyntesen och dess regleringsmekanism i D. melanogaster, och utarbetat ett protokoll för dissekering och immunfärgning. Tidpunkten för ecdysteroid biosyntes påverkas av miljöfaktorer genom neuronala ingångar 33, så det är viktigt att bibehålla innervation av de ecdysteroidogenic organ tillsammans med hjärnan, VNC, och andra vävnader under dissekering.
Såsom beskrivits ovan, D. melanogaster PG bildar ett komplex endokrint organ RG med corpora allata (CA) och corpora cardiaca (CC) (figur 2D). Medan PG producerar ecdysteroids, CA och CC producerar juvenila hormoner och adipokinetic hormon, respektive. Detta anatomiska egenskapen har varit ett hinder för forskare som studerar ecdysteroidogenesis i D. melanogaster, jämfört med andra insekter. Men under de senaste decennierna, flyga genetik has tillät oss att identifiera många ecdysteroidogenic gener som specifikt uttrycks i PG 4. Dessa gener uttrycks också i nurse celler eller follikelceller i äggstockarna 34, 35. Nu kan man använda en unik uppsättning av genuttryck profiler i ecdysteroidogenic organ, vilket gör det möjligt att specificera ecdysteroidogenic celler genom immunfärgning och transgena tekniker.
Under dissektion, är det viktigt att använda fin pincett med vassa kanter. Före dissektion, kan kanterna av pincetten skärpas med en Arkansas slipsten för att föra ihop kanterna utan luckor. Under dissektion, skräp eller de kvarvarande vävnader, såsom fett kroppen, tarmen, och imaginal skivor, bör avlägsnas så mycket som möjligt. Framför allt bitar av fett kroppen fastnar lätt till vävnaden av intresse. Dessutom bör monteringen av proverna på glasskivor också utföraed noggrant. Ett komplex av vävnader kan oordning när ett täckglas placeras på samplen i klibbiga monteringsmedium. Därför måste ett tillräckligt antal prover skall dissekeras, och lämpliga prover måste väljas för avbildning, såsom de i vilka RG eller äggstocken är på den översta sidan och de neuronala anslutningarna förblir intakta.
För att utföra framgångsrik immunfärgning och för att erhålla reproducerbara resultat är det viktigt att bibehålla samma villkor för de provtagnings- och hantering. Omfattningen av immunfärgning beror i hög grad på tillståndet hos enskilda djur vid tidpunkten för provtagning och fixering. Till exempel bör en ålder av djuren, uppfödnings temperaturer, näringstillstånd och dissektion tiden noga övervägas. För att minimera handhavandefel av fixering i flera experiment, vi håller noga nästan lika många prover för att samordna dissekering tid och fixering reaktionstider. För fixering solution, är 4% paraformaldehyd eller 3,7% formaldehyd användes. Eftersom paraformaldehyd snabbt nedbrytes med tiden, är dess pulver vanligtvis upplöst för att göra 10% stamlösning i PBS, och alikvoter lagras vid -20 ° C. Alikvotema är ofruset att göra den färska 4% fix-lösning före varje dissekering. Dessutom omfattande tvättsteg prover minska bakgrunden ospecifik färgning.
I steget för bildtagning, vi följer tillverkarens protokoll för konfokalmikroskopi. Den mikroskopi systemet tillhandahåller ett användarvänligt gränssnitt för forskare eller studenter, så att de optimala uppsättningar av excitations- / emissionsfilter automatiskt väljs när de typer av fluorofor specificeras. Medan mikroskopi systemet är enkelt att använda, måste man för att optimera parametrarna för bilden förvärvet på varje prov eller varje fokalplan, genom att ändra detektorförstärkningen, avsökningshastighet, scan siffror och hålstorleken.
36. För att övervinna detta problem, kan den knock-in teknik kunna användas för att infoga en HA-tagg i genlocus av ouija ombord med hjälp av CRISPR / Cas9 systemet. Genom att använda sådana transgena tekniker i kombination med immunfärgning, minst 3-4 proteiner kan samtidigt visualiseras i PG eller äggstocken. I motsats till protein lokalisering emellertid en metod för att visualisera endogena ecdysteroids genom immunfärgning har inte fastställts. När anti-ecdysteroid antikropp är tillgänglig för immunfärgning, kan subcellulära lokaliseringar av ecdysteroid biosyntesen och transport av ecdysteroid undersökas i framtiden. En annan begränsning är att den temporala dynamik ecdysteroidogenesis inte kan undersökas i fasta vävnader. Med tanke på att ecdysteroid titern varie längs utvecklingsstadier, bör aktiviteten för ecdysteroidogenic organ och de utskjutande nervceller vara temporalt reglerat som svar på olika stimuli från omgivningen. En nyligen genomförd studie övervakade Ca2 + dynamiken hos PG celler med användning av levande avbildningstekniker 37. För framtida applikationer vi utvecklar för närvarande ett protokoll för levande avbildning av PG eller odlade äggstockarna tillsammans med sina utskjutande nervceller. När det gäller befintliga metoder, syftar detta nya protokoll för att visualisera aktiviteten av nervceller och deras målorgan samtidigt. När aktiviteten av neuroner kan övervakas med Ca2 + indikatorn GCaMP eller Cameleon 38, kan den manipuleras med optogenetic eller thermogenetic tillvägagångssätt vid lämplig tidpunkts 39. Dessa metoder bidrar till en övergripande förståelse av steroidhormoner biosyntesen och dess neuronal regleringsmekanism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Reiko Kise och Tomotsune Ameku för deras tekniska stöd för detta arbete. Vi är också tacksamma mot Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, Bloomington Drosophila Lager Center, KYOTO Stock Center (DGRC) och utvecklingsstudier Hybridoma Bank för aktier och reagens. Detta arbete har finansierats med bidrag till YSN från JSPS KAKENHI Grant Number 16K20945, The Naito Foundation och Inoue Science Research Award; och genom ett bidrag till RN från MEXT KAKENHI Grant Number 16H04792.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
| dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
References
- Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
- Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
- Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
- Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
- Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
- Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
- Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
- Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
- Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
- Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
- Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32 (2015).
- Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).
- Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
- Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O'Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
- Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O'Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
- Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
- Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
- Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778 (2014).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
- Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
- Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
- Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
- Parvy, J. -P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
- Li, H. -H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
- Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).
- Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
- Song, X., Zhu, C. -H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
- Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
- Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
- Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).
- Yamanaka, N., Marqués, G., O'Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
- Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
- Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).
