CAPRRESI: Chimären Assembly durch Plasmid Recovery und Restriktion Enzym Site Insertion

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir die Chimären-Assemblierung durch Plasmid-Wiedergewinnung und Restriktionsenzym-Insertion (CAPRRESI), ein Protokoll, das auf der Insertion von Restriktionsenzymstellen in Synonym-DNA-Sequenzen und funktionelle Plasmid-Recovery basiert. Dieses Protokoll ist eine schnelle und kostengünstige Methode zum Fixieren von Protein-kodierenden Genen.

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir die Chimären-Assemblierung durch Plasmid-Wiedergewinnung und Restriktionsenzym-Insertion (CAPRRESI). CAPRRESI profitiert von vielen Stärken der ursprünglichen Plasmid-Wiedergewinnungsmethode und führt eine Restriktionsenzym-Verdauung ein, um DNA-Ligationsreaktionen zu erleichtern (erforderlich für die Chimären-Assemblierung). Für dieses Protokoll klonieren Benutzer Wildtyp-Gene in das gleiche Plasmid (pUC18 oder pUC19). Nach der in Silico- Selektion von Aminosäuresequenzregionen, in denen Chimären zusammengesetzt werden sollen, erhalten die Benutzer alle Synonym-DNA-Sequenzen, die sie codieren. Ad-hoc Perl-Skripte ermöglichen es Benutzern, alle Synonym-DNA-Sequenzen zu bestimmen. Nach diesem Schritt sucht ein anderes Perl-Skript nach Einschränkungsenzytsites auf allen Synonym-DNA-Sequenzen. Diese in der Silico- Analyse wird auch unter Verwendung des Ampicillin-Resistenzgens ( ampR ), das auf pUC18 / 19-Plasmiden gefunden wurde, durchgeführt. Benutzer entwickeln Oligonukleotide in Synonymregionen, um Wildtyp- und AmpR- Gene durch PCR zu stören. Nach obtAining und reinigen komplementäre DNA-Fragmente, Restriktionsenzym-Verdauung wird erreicht. Die Chimärenanordnung wird durch Ligieren geeigneter komplementärer DNA-Fragmente erreicht. PUC18 / 19-Vektoren sind für CAPRRESI ausgewählt, weil sie technische Vorteile wie kleine Größe (2.686 Basenpaare), hohe Kopienzahl, vorteilhafte Sequenzierungsreaktionsmerkmale und kommerzielle Verfügbarkeit bieten. Die Verwendung von Restriktionsenzymen für die Chimärenanordnung eliminiert die Notwendigkeit von DNA-Polymerasen, die stumpfendige Produkte ergeben. CAPRRESI ist eine schnelle und kostengünstige Methode zur Fusion von Protein-kodierenden Genen.

Einleitung

Die chimäre Gen-Assemblierung wurde in der Molekularbiologie weit verbreitet, um die Proteinfunktion und / oder für biotechnologische Zwecke zu erhellen. Es gibt verschiedene Verfahren zum Fixieren von Genen, wie etwa die überlappende PCR-Produktverstärkung ¹ , die Plasmidrückgewinnung ² , die homologe Rekombination ³ , die CRISPR-Cas9-Systeme ⁴ , die ortsgerichtete Rekombination ⁵ und die Gibson-Anordnung ⁶ . Jeder von ihnen bietet verschiedene technische Vorteile. Zum Beispiel die Flexibilität der überlappenden PCR-Konstruk....

Protokoll

1. CAPRRESI-Protokoll

HINWEIS: Abbildung 1 stellt das gesamte CAPRRESI-Protokoll dar. Diese Technik basiert auf einem Silico- Design und dem darauffolgenden Aufbau der gewünschten Chimären.

1. Auswahl des Klonierungsplasmids, pUC18 oder pUC19.
   1. Wählen Sie den pUC-Vektor aus, der am besten zu technischen Anforderungen passt.
      HINWEIS: Beide Vektoren haben die gleiche Sequenz, mit Ausnahme der Orientierung der multiplen Klonierungsstelle. Dies ist wichtig für die Konstruktion von Oligonukleotiden und die PCR-Plasmidstörung.
2. In der Silico- A....

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt CAPRRESI. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden zwei chimäre Gene durch Austausch der Domänen von zwei bakteriellen primären Sigma-Faktoren ( dh E. coli RpoD und R. etli SigA) zusammengesetzt. Die DNA-Sequenzen der rpoD- und sigA- Gene wurden unter Verwendung des Artemis Genome Browser ¹⁴ aus den GenBank-Genom-Dateien NC_000913 bzw. NC_007761 erhalten. Die DNA-Sequenz des pUC18-Vektors wurd.......

Diskussion

CAPRRESI wurde als Alternative zum PRM ^{2 konzipiert} . Die ursprüngliche PRM ist eine leistungsfähige Technik; Es ermöglicht die Verschmelzung von DNA-Sequenzen entlang eines beliebigen Teils der ausgewählten Gene. Für PRM sollten Wildtyp-Gene in das gleiche Plasmid kloniert werden. Danach werden Oligonukleotide innerhalb von Wildtyp- und Antibiotika-Resistenzgenen, die auf dem Plasmid gefunden wurden, entworfen. Die Plasmidstörung wird durch PCR unter Verwendung von stumpfendigen, hochauflösenden.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Platin-Taq-DNA-Polymerase High Fidelity	Thermo Fisher 11304011		Erzeugt eine Mischung aus stumpfen/3'-A-überhängenden PCR-Produkten
Hochreines Plasmid-Isolationskit	Roche	11754785001	Wird für alle Plasmidaufreinigungsreaktionen verwendet
Aufreinigungskit für hochreine PCR-Produkte	Roche	11732676001	Wird für alle PCR-Aufreinigungsreaktionen aus Agarosegelen verwendet
AflII-Restriktionsenzym	New England Biolabs	R0520L	Erkennt die Sequenz 5'-CTTAAG-3' und schneidet bei 37 ° C
KpnI-HF Restriktionsenzym	New England Biolabs	R3142L	Erkennt die Sequenz 5'-GGTACC-3' und schneidet bei 37 &de; C
SpeI-HF Restriktionsenzym	New England Biolabs	R3133L	Erkennt die Sequenz 5'-ACTAGT-3' und schneidet bei 37 > C
XbaI-Restriktionsenzym	New England Biolabs	R0145L	Erkennt die Sequenz 5'-TCTAGA-3' und schneidet bei 37 ° C
Ampicillin Natriumsalz	Sigma Aldrich	A0166-5G	Antibiotika
Nalidixinsäure	Sigma Aldrich	N8878-5G	Antibiotika
Hefeextrakt	Sigma Aldrich	Y1625-1KG	Bakterielle Zellkultur
Kasein Pepton	Sigma Aldrich	70171-500G	Bakterielle Zellkultur
NaCl	Sigma Aldrich	S9888-1KG	Natriumchlorid
Agar	Sigma Aldrich	05040-1KG	Bakterielles Zellkultur
XbaI Restriktionsenzym	Thermo Fisher	FD0684	Schnellverdau XbaI Enzym
KpnI Restriktionsenzym	Thermo Fisher	FD0524	Schnellverdau KpnI Enzym
Quick Ligation Kit	New England Biolabs	M2200S	Fast DNA Ligation Kit
AflII Restriktionsenzym	Thermo Fisher	FD0834	Fast digest AflII enzym
SpeI Restriktionsenzym	Thermo Fisher	FD1253	Fast digest SpeI enzyme