Une méthode pour préparer les cellules d'insectes et de les infecter avec le baculovirus à des fins de production de l'recombinante proteinand mCD1d générant tétramères mCD1d.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Un procédé de production de protéine recombinante mCD1d en cellules d'insectes.
Dans cet article
Résumé
Résumé
CD1 protéines constituent une troisième classe de molécules présentatrices d'antigène. Ils sont des glycoprotéines de surface cellulaire, exprimée en environ 50 kDa glycosylée lourdes chaînes qui sont non covalente associée à béta2-microglobuline. Ils se lier aux lipides plutôt que les peptides. Bien que leur structure confirme la similitude des protéines CD1 du CMH de classe I et molécules de classe II présentant l'antigène, la rainure mCD1d est relativement étroite, profonde et hautement hydrophobe et il a deux poches de liaison au lieu de la faible profondeur des poches de plusieurs classiques décrites pour la MHC- codée molécules présentatrices d'antigène. Sur la base de leurs séquences d'acides aminés, une telle rainure hydrobphobic fournit un environnement idéal pour la fixation des antigènes lipidiques.
Le Natural Killer T (NKT), les cellules utilisent leur TCR à reconnaître glycolipides liés à ou présentés par CD1d. Les cellules T réactives aux lipides présentés par CD1 ont été impliqués dans la protection contre les maladies auto-immunes et infectieuses et dans le rejet de la tumeur. Ainsi, la capacité d'identifier, purifier, et de suivre la réponse du CD1-réactive cellules NKT est de grande importance. La génération de tétramères d'alpha galactosyl céramide (une-GalCer) avec CD1d a aperçu significatif de la biologie des cellules NKT. Tétramères construits à partir d'autres molécules CD1 ont aussi été générés et ces nouveaux réactifs ont considérablement élargi les connaissances sur les fonctions des cellules T réactives de lipides, avec une utilisation potentielle dans le suivi de la réponse aux vaccins à base de lipides et dans le diagnostic des maladies auto-immunes et d'autres traitements.
Protocole
I. Décongeler les cellules
Prenez le flacon congelé des cellules TN5, et le placer dans un bain d'eau à 37 ° C. Ajouter 5 ml d'insectes express moyennes (Invitrogen, numéro de catalogue 10486-) dans 25cm 2 flacon de CT. Notez que cinq express vient sans glutamine; besoin d'ajouter 10ml de streptocoque stylo 100X glutamine ou glutamine seule à une des médias lt. Ajouter TN5 cellules en elle et incuber pendant 30 minutes dans un incubateur à 27 ° C. Ensuite, aspirer le milieu avec du DMSO en douceur sans perturber les cellules attachées au fond du flacon. Ajouter 5 ml de milieu frais.
II. Croiss....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Dans cette procédure, il est montré comment initier, grandir, infecter les cellules d'insectes et la façon de titrer la baculovirus utilisation de ces cellules. Les aspects les plus importants de cette procédure sont la maintenance des cellules et de connaître le titre exact de baculovirus. Une fois que vous avez généré CD1 tétramères, ils peuvent être utilisés comme un outil puissant pour l'analyse des glycolipides des cellules T réactives. Systèmes baculovirus sont également largement utilisées pour produire des protéines recombin.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| Express Five SFM | Milieu sans sérum | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Cellules d'insectes | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotiques | Invitrogen | 10378-016 | |
| Flacon TC 25 cm2 | En plastique | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Flacon TC 175 cm2 | Flacon à scellage par bouchon | Fisher Scientific | 10-126-8 | |
| Flacon Erlenmeyer | Flacon de culture cellulaire | Fisher Scientific | 07 200 672 | |
| Concentrateur YM 30 | 30 000 MWCO | EMD Millipore | UFC 903096 | |
| Équipement FPLC | GE Healthcare | |||
| Enzyme BrA et tampon | Kits de biotinylation | Avidity | BIRA500 | |
| Colonne de chromatographie Ni-NTA Agarose | Colonne de purification des protéines His-tag | GE Healthcare | ||
| Colonne de désalinisation | Pour éliminer le sel de la protéine | GE Healthcare | ||
| Colonne MonoQ | Chromatographie d'échange d'anions | GE Healthcare | ||
| Colonne S200 | Chromatographie d'exclusion par taille | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glycolipide | |||
| Streptavidine-PE | Pour la conjugaison des protéines | Molecular Probes, Life Technologies | S-866 |
Références
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
