Dieses Manuskript beschreibt die Herstellung von mikrogewebetechnischen neuronalen Netzen: dreidimensionale mikrometergroße Konstrukte, die aus lang ausgerichteten axonalen Traktaten bestehen, die aggregierte neuronale Populationen umfassen, die in einem tubulären Hydrogel umhüllt sind. Diese lebenden Gerüste können als funktionelle Relais dienen, um neuronale Schaltkreise zu rekonstruieren oder zu modulieren oder als biofidelische Testbetten, die grau-weiße Materie Neuroanatomie nachahmen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Anatomisch inspirierte dreidimensionale Mikro-Gewebe-konstruierte Neuronale Netze für Nervensystem-Rekonstruktion, Modulation und Modellierung
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die funktionelle Erholung tritt nach der Verletzung oder der krankheitsinduzierten Degeneration im zentralen Nervensystem (ZNS) aufgrund der hemmenden Umgebung und der begrenzten Neurogenesefähigkeit häufig auf. Wir entwickeln eine Strategie, um gleichzeitig den neuronalen und axonalen Wegverlust innerhalb des beschädigten ZNS zu adressieren. Dieses Manuskript stellt das Herstellungsprotokoll für Mikrogewebe-konstruierte neuronale Netze (Mikro-TENNs) dar, implantierbare Konstrukte, bestehend aus Neuronen und ausgerichteten axonalen Traktaten, die das extrazelluläre Matrix- (ECM-) Lumen eines vorgeformten Hydrogelzylinders umhängen, der Hunderte Mikrometer Durchmesser aufweist, der sich in Zentimeter erstrecken kann in Länge. Neuronale Aggregate sind auf die Extreme der dreidimensionalen Umhüllung abgegrenzt und werden durch axonale Projektionen überspannt. Micro-TENNs sind einzigartig als Strategie für den ZNS-Rekonstruktion, emulieren Aspekte der Gehirn-Connectome-Cytoarchitektur und potenziell Bereitstellung von Mitteln für den Netzaustausch. Die neuRonale Aggregate können mit Wirtsgewebe synapsen, um neue funktionale Relais zu bilden, um fehlende oder beschädigte Schaltkreise wiederherzustellen und / oder zu modulieren. Diese Konstrukte können auch als proregenerative "lebende Gerüste" fungieren, die in der Lage sind, Entwicklungsmechanismen für die Zellmigration und die axonale Pfadfindung zu nutzen, wobei synergistische strukturelle und lösliche Cues auf der Grundlage des Regenerationszustandes vorhanden sind. Mikro-TENNs werden hergestellt, indem flüssiges Hydrogel in eine zylindrische Form gegossen wird, die eine in Längsrichtung zentrierte Nadel enthält. Sobald das Hydrogel geliert ist, wird die Nadel entfernt, wobei eine hohle Mikrosäule zurückbleibt. Eine ECM-Lösung wird dem Lumen zugesetzt, um eine Umgebung bereitzustellen, die für neuronale Adhäsion und axonales Auswachsen geeignet ist. Dissoziierte Neuronen werden für eine präzise Aussaat innerhalb eines oder beider Enden der Mikrosäule mechanisch aggregiert. Diese Methodik produziert zuverlässig selbständige Miniatur-Konstrukte mit langprojektiven axonalen Traktaten, die Merkmale der Hirnneuroanatomie rekapitulieren können. Synaptic immUnauffällige und genetisch codierte Calciumindikatoren deuten darauf hin, dass Mikro-TENNs eine weitgehende synaptische Verteilung und intrinsische elektrische Aktivität besitzen. Folglich stellen Mikro-TENNs eine vielversprechende Strategie für eine gezielte neurochirurgische Rekonstruktion von Gehirnwegen dar und können auch als biofidelische Modelle zur Untersuchung neurobiologischer Phänomene in vitro angewendet werden .
Einleitung
Ein gemeinsames Merkmal von Erkrankungen und Erkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS), wie z. B. traumatische Hirnverletzungen (TBI), Rückenmarksverletzungen (SCI), Schlaganfall, Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit, ist die Trennung von axonalen Bahnen und neuronaler Zelle Verlust 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Zum Beispiel, wenn ein ischämischer Schlaganfall unbehandelt wird, wird geschätzt, dass Axone mit einer Rate von 7 Meilen von Axonen pro Minute
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden von den Institutional Animal Care und Use Committees an der University of Pennsylvania und dem Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center genehmigt und beachteten die Richtlinien, die in der NIH Public Health Service Policy für Humane Care und Use of Laboratory dargelegt wurden Tiere (2015).
1. Entwicklung des Agarose-Hydrogels (Acelluläre Komponente von Mikro-TENNs)
- Agarose-Lösungsvorbereitung
- In einem Biosicherheitsschrank werden Reservoirs für die Mikrosäulen vorbereitet, indem 20 ml Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) in jede ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Mikro-TENNs wurden mittels Phasenkontrastmikroskopie zur Bewertung ihrer Cytoarchitektur und des axonalen Auswuchses untersucht (Abbildung 4 ). Innerhalb unidirektionaler, 2 mm langer Mikro-TENNs wurden neuronale Aggregate auf ein Ende der Mikrosäule beschränkt und ein Bündel von Axonen durch den inneren Kern projiziert. Axone überspannten die gesamte Länge der Säule um 5 Tage in vitro (DIV) ( Abbildung 4A ). Es gab eine größere anfängliche axon.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
ZNS-Verletzungen und Erkrankungen führen typischerweise zu einem Verlust oder einer Dysfunktion der Langstrecken-Axonalwege, die das Gehirn-Verbund umfassen, mit oder ohne begleitende neuronale Degeneration. Dies wird durch die begrenzte Kapazität des ZNS ergänzt, um die Neurogenese und Regeneration zu fördern. Trotz der Verfolgung von Reparaturstrategien wie Wachstumsfaktor, Zelle und Biomateriallieferung als einzelne oder kombinatorische Ansätze scheitern diese Techniken gleichzeitig sowohl für die Degeneration von ne.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die finanzielle Unterstützung wurde von den National Institutes of Health U01-NS094340 (Cullen), T32-NS043126 (Harris) und F31-NS090746 (Katiyar)), der Michael J. Fox Foundation (Therapeutic Pipeline Program # 9998 (Cullen)), Die Penn Medicine Neuroscience Center Pilot Award (Cullen), die National Science Foundation (Graduate Research Fellowships DGE-1321851 (Struzyna und Adewole)), die Abteilung für Veteranen Angelegenheiten (RR & D Merit Review # B1097-I (Cullen)), die American Association Der neurologischen Chirurgen und des Kongresses der neurologischen Chirurgen (2015-2016 Codman-Stipendium in Neurotrauma und Critical Care (Petrov)) und der US Army Medical Resea....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Laserschneider | Universal Laser Systems | PLS4.75 | Wird zur Herstellung der lasergeschnittenen Mikrokanalform verwendet. |
| Lasergeschnittene Vorrichtung zur Herstellung von Mikrosäulen | Sonderanfertigung | -------------- | Kontaktieren Sie unsere Forschungsgruppe, wenn Sie interessiert sind. Abmessungen und Blaupausen, die im Manuskript bereitgestellt werden. |
| Schrauben | -------------- | -------------- | #4-40 mit einem Gewindedurchmesser von 3,05 mm |
| Muttern | -------------- | -------------- | #4-40 mit einem Gewindedurchmesser von 3,05 mm |
| Akupunkturnadel (180 & Mikro; m Durchmesser) | Lhasa Medical | sj.16X40 | Der Durchmesser kann je nach gewünschter Größe für das Mikrosäulenlumen variiert werden. |
| Petrischale | Fisher | 08772B | |
| Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) | Invitrogen | 14200075 | |
| Polystyrol serologische Einwegpipette | Fisher | 13-678-11D | |
| Agarose | Sigma | A9539-50G | |
| Kapillarröhrchen (398 & Mikro; m Durchmesser) | Fisher | 21170D | Der Durchmesser kann je nach gewünschter Größe für die Mikrosäulenschale variiert werden. |
| Heizplatte | Fisher | SP88857200 | |
| Magnetstab | Fisher | 1451352 | |
| Mikropipette | Sigma | Z683884-1EA | |
| 25 mm Gauge Nadel | Fisher | 14-826-49 | |
| Mikroskalpell | Roboz Surgical | RS-6270 | |
| Schere | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Pinzette | World Precision Instruments | 501985 | |
| Heißperlensterilisator | Sigma | Z378550-1EA | |
| Stereoskop | Nikon | SMZ800N | Wird für alle Dissektionsschritte und für die Mikro-TENN-Fertigung verwendet. |
| Rattenschwanz Typ I Kollagen | Corning | 354236 | bei 4 º C und nur bei Bedarf entfernen. Verwenden Sie Eis, um die Temperatur während des Gebrauchs zu erhalten. |
| Mikrozentrifugenröhrchen | Fisher | 02-681-256 | |
| Maus Laminin | Corning | 354232 | Beibehalten bei 4 & ordm; C und nur bei Bedarf entfernen. Verwenden Sie Eis, um die Temperatur während des Gebrauchs zu erhalten. |
| Neurobasales Medium | Invitrogen | 21103049 | Basalmedium für die Kultivierung von pränatalen und embryonalen neuronalen Zellen. Bei 4& ordm lagern; C und warm bei 37 ° C; C vor Gebrauch. |
| Natriumhydroxid (NaOH) | Fisher | SS2661 | |
| Salzsäure (HCl) | Fisher | SA48-1 | |
| Lackmuspapier | Fisher | 09-876-18 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | 14170112 | Bei 4 & ordm;C lagern. |
| 0,25 % Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | Lagern bei -20 & ordm; C und warm bei 37 ° C; C vor Gebrauch. |
| Pankreas-Desoxyribonuklease (DNase) bei Rinderpankreas I | Sigma | 10104159001 | lagern bei -20 º C und warm bei 37 ° C; C vor Gebrauch. |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 12587010 | Supplement zu Neurobasalem Medium für die Kultur von hippokampalen und kortikalen Neuronen. Bei -20 € lagern; C und warm bei 37 ° C; C vor Gebrauch. |
| L-Glutamin | Invitrogen | 35050061 | Lagern bei -20 & ordm; C und warm bei 37 ° C; C vor Gebrauch. |
| Sprague Dawley embryonaler Tag 18 Ratten | Charles River | Stamm 001 | |
| Pasteur-Pipette | Fisher | 22-042816 | |
| 15 mL Zentrifugenröhrchen | EMESCO | 1194-352099 | |
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| Zentrifuge | Fisher | 05-413-115 | |
| Hämozytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| Objet30 3D-Drucker | Stratasys | -------------- | Wird zur Herstellung der pyramidenförmigen Mikrowell-Formen verwendet. |
| 3D-gedruckte pyramidenförmige Well-Form | Maßanfertigung | -------------- | Kontaktieren Sie unsere Forschungsgruppe, wenn Sie interessiert sind. Abmessungen und Blaupausen, die im Manuskript bereitgestellt werden. |
| Polydimethylsiloxan (PDMS) und Härter | Fisher | NC9285739 | Kommt als Kit mit Elastomer und Härter. Verwendung in einem chemischen Abzug. |
| Trichter | Fisher | 10-348C | |
| 1 ml Pipettenbirne | Sigma | Z509035 | |
| Mikrospatel | Fisher | S50821 | |
| 12-Well-Kulturplatte | EMESCO | 1194-353043 | |
| Ofen | Fisher | 11-475-154 | |
| Inkubator | Fisher | 13 998 076 | |
| AAV1. Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 | UPenn Vector Core | 36373 | Bei -80°C lagern. Kommerziell erhältliches Adeno-assoziiertes Virus (AAV) mit dem GCaMP6f-Calciumindikator. |
| Formaldehyd 40% | Fisher | F77P-4 | Formaldehyd ist eine giftige Verbindung, die als krebserregend bekannt ist und in einem separaten Behälter entsorgt werden muss. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Nichtionisches Tensid zur Permeabilisierung von Zellmembranen. |
| Pferdeserum | Gibco | 16050-122 | |
| Maus Anti-Tuj-1/beta-III Tubulin Primärantikörper | Sigma | T8578-200UL | Bei -20°C lagern. |
| Kaninchen Anti-Synapsin 1 primärer Antikörper | Synaptic Systems | 106-001 | Bei -20°C lagern. |
| Donkey anti-mouse 568 Sekundärantikörper | Invitrogen | A10037 | Bei 4&C lagern. |
| Donkey anti-rabbit 488 Sekundärantikörper | Invitrogen | A21206 | Bei 4&C lagern. |
| Hoechst 33342, Trihydrochlorid | Invitrogen | H3570 | Lagern bei 4&C. Hoechst ist ein bekanntes Mutagen, das als krebserregend behandelt werden sollte. Daher muss es in einem separaten Behälter entsorgt werden. |
| A1RSI Konfokales Laserscanning-Mikroskop | Nikon | -------------- | Wird für die Aufnahme von konfokalen Rekonstruktionen von immunmarkierten Konstrukten verwendet. |
| Eclipse Ti-S Mikroskop | Nikon | -------------- | Wird für die Aufnahme von Phasenkontrastbildern verwendet. Bei der digitalen Bilderfassung mit einer QiClick-Kamera, die mit der Nikon Elements Basic Research Software (4.10.01) verbunden ist. |
| Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzmikroskop | Nikon | -------------- | Nikon Eclipse Ti Mikroskop gepaart mit einer ANDOR Neo/Zyla Kamera für die Kalziumbildgebung. |
| NIS Elements AR 4.50.00 Software | Nikon Instruments | -------------- | Wird verwendet, um Kalziumtransienten aus den Aufnahmen zu identifizieren, die mit dem Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzmikroskop aufgenommen wurden. |
Referenzen
- Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10 (5), 679-685 (2015).
- Tallantyre, E. C., Bø, L., et al.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
