Anatomisch inspirierte dreidimensionale Mikro-Gewebe-konstruierte Neuronale Netze für Nervensystem-Rekonstruktion, Modulation und Modellierung

Summary

Dieses Manuskript beschreibt die Herstellung von mikrogewebetechnischen neuronalen Netzen: dreidimensionale mikrometergroße Konstrukte, die aus lang ausgerichteten axonalen Traktaten bestehen, die aggregierte neuronale Populationen umfassen, die in einem tubulären Hydrogel umhüllt sind. Diese lebenden Gerüste können als funktionelle Relais dienen, um neuronale Schaltkreise zu rekonstruieren oder zu modulieren oder als biofidelische Testbetten, die grau-weiße Materie Neuroanatomie nachahmen.

Abstract

Die funktionelle Erholung tritt nach der Verletzung oder der krankheitsinduzierten Degeneration im zentralen Nervensystem (ZNS) aufgrund der hemmenden Umgebung und der begrenzten Neurogenesefähigkeit häufig auf. Wir entwickeln eine Strategie, um gleichzeitig den neuronalen und axonalen Wegverlust innerhalb des beschädigten ZNS zu adressieren. Dieses Manuskript stellt das Herstellungsprotokoll für Mikrogewebe-konstruierte neuronale Netze (Mikro-TENNs) dar, implantierbare Konstrukte, bestehend aus Neuronen und ausgerichteten axonalen Traktaten, die das extrazelluläre Matrix- (ECM-) Lumen eines vorgeformten Hydrogelzylinders umhängen, der Hunderte Mikrometer Durchmesser aufweist, der sich in Zentimeter erstrecken kann in Länge. Neuronale Aggregate sind auf die Extreme der dreidimensionalen Umhüllung abgegrenzt und werden durch axonale Projektionen überspannt. Micro-TENNs sind einzigartig als Strategie für den ZNS-Rekonstruktion, emulieren Aspekte der Gehirn-Connectome-Cytoarchitektur und potenziell Bereitstellung von Mitteln für den Netzaustausch. Die neuRonale Aggregate können mit Wirtsgewebe synapsen, um neue funktionale Relais zu bilden, um fehlende oder beschädigte Schaltkreise wiederherzustellen und / oder zu modulieren. Diese Konstrukte können auch als proregenerative "lebende Gerüste" fungieren, die in der Lage sind, Entwicklungsmechanismen für die Zellmigration und die axonale Pfadfindung zu nutzen, wobei synergistische strukturelle und lösliche Cues auf der Grundlage des Regenerationszustandes vorhanden sind. Mikro-TENNs werden hergestellt, indem flüssiges Hydrogel in eine zylindrische Form gegossen wird, die eine in Längsrichtung zentrierte Nadel enthält. Sobald das Hydrogel geliert ist, wird die Nadel entfernt, wobei eine hohle Mikrosäule zurückbleibt. Eine ECM-Lösung wird dem Lumen zugesetzt, um eine Umgebung bereitzustellen, die für neuronale Adhäsion und axonales Auswachsen geeignet ist. Dissoziierte Neuronen werden für eine präzise Aussaat innerhalb eines oder beider Enden der Mikrosäule mechanisch aggregiert. Diese Methodik produziert zuverlässig selbständige Miniatur-Konstrukte mit langprojektiven axonalen Traktaten, die Merkmale der Hirnneuroanatomie rekapitulieren können. Synaptic immUnauffällige und genetisch codierte Calciumindikatoren deuten darauf hin, dass Mikro-TENNs eine weitgehende synaptische Verteilung und intrinsische elektrische Aktivität besitzen. Folglich stellen Mikro-TENNs eine vielversprechende Strategie für eine gezielte neurochirurgische Rekonstruktion von Gehirnwegen dar und können auch als biofidelische Modelle zur Untersuchung neurobiologischer Phänomene in vitro angewendet werden .

Introduction

Ein gemeinsames Merkmal von Erkrankungen und Erkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS), wie z. B. traumatische Hirnverletzungen (TBI), Rückenmarksverletzungen (SCI), Schlaganfall, Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit, ist die Trennung von axonalen Bahnen und neuronaler Zelle Verlust ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Zum Beispiel, wenn ein ischämischer Schlaganfall unbehandelt wird, wird geschätzt, dass Axone mit einer Rate von 7 Meilen von Axonen pro Minute ⁵ verloren gehen. Im Falle von TBI, die etwa 1,7 Millionen Menschen jedes Jahr in den USA alleine erleben, kann die axonale Degeneration auch nach dem Trauma weiter auftreten, da die anfängliche Verletzung einen langfristigen neurodegenerativen Zustand auslöst ⁴ . Diese schädlichen Wirkungen verschärfen, hat das ZNS eine stark eingeschränkte KapazitätStadt zur Regeneration ^{1 , 7 , 8 , 9} . Nach der Verletzung entwickelt sich eine hemmende Umgebung, die durch einen Mangel an gerichteter Orientierung an entfernten Targets, die Anwesenheit von Myelin-assoziierten Inhibitoren, die das Auswachsen von Neuriten behindern, und die Bildung einer Glia-Narbe durch reaktive Astrozyten ^{8 , 10 , 11 , 12} gekennzeichnet ^ist . Die gliale Narbe dient als biochemische und physikalische Barriere gegen die Regeneration, wobei Moleküle wie Chondroitinsulfat-Proteoglykane das Axonwachstum ^{8 , 11} behindern. Darüber hinaus, obwohl neuronale Stammzellen in der erwachsenen ZNS gefunden worden sind, ist die Produktion von neuen Neuronen begrenzt, da konsequente Hinweise auf Neurogenese wurde nur in der olfaktorischen Glühbirne, die Hippocampal gefundenSubgranulare Zone, die periventrikuläre Fläche und der zentrale Kanal des Rückenmarks ^{13 , 14} . Diese Hindernisse verhindern die funktionelle Wiederherstellung von verlorenen Neuronen und der weißen Stoffarchitektur nach Verletzung oder Krankheit, was zu den oft lebensverändernden und verlängerten Wirkungen dieser Bedingungen führt.

Trotz des Mangels an regenerativer Kapazität im adulten ZNS wurde gezeigt, dass eine axonale Regeneration möglich ist, wenn den Wirtsneuronen ^{15 , 16 , 17 , 18} adäquate Umgebungsmerkmale präsentiert werden. Forscher haben versucht, Wachstumsfaktoren zu liefern und zu manipulieren ( zB Nervenwachstumsfaktor, epidermaler Wachstumsfaktor, glialabhängiger Wachstumsfaktor und neurotrophischer Faktor-3) und andere Leitmoleküle zur Stimulierung von Plastizität und Axonregeneration ^{14 , <}/ Sup> ^{18 , 19} Obwohl diese Studien bestätigt haben, dass erwachsene Axone in der Lage sind, auf Wachstumsfaktoren zu reagieren, sind diese Strategien durch die geringe Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke und die spezifischen räumlichen und zeitlichen Gradienten, die zur Förderung der Regeneration ^{14 , 18 , 19} erforderlich sind, begrenzt. Andere Ansätze haben sich auf die Hyperaktivierung von regenerationsbedingten Transkriptionsfaktoren in ZNS-Neuronen gestützt. Zum Beispiel stimulierte die Überexpression des Stat3-Transkriptionsfaktors die axonale Regeneration im Sehnerv ²⁰ . Trotzdem ersetzen sowohl die Biomolekülabgabe als auch die Überexpression von Transkriptionsfaktoren die verlorenen neuronalen Populationen nicht. Zellbasierte Strategien konzentrierten sich vor allem auf die Verpflanzung von neuralen Stammzellen (NSCs) in das ZNS, wobei sie ihre Fähigkeit nutzen, ZNS-Neuronen zu ersetzen, trophische Faktoren freizugeben,Und unterstützen die Neurogeneseversuche, die nach Verletzung auftreten ¹⁷ . Trotzdem gibt es immer noch dringende Herausforderungen, die diesen Ansatz behindern, einschließlich der behinderten Fähigkeit, transplantierte neuronale Zellen zu überleben, mit dem Wirt zu integrieren und räumlich auf den verletzten Bereich ^{6 , 14 , 17 , 21} zu beschränken. Darüber hinaus ist die Zelllieferung allein nicht in der Lage, die Cytoarchitektur von beschädigten oder verlorenen axonalen Wegen wiederherzustellen. Ein alternativer Ansatz, der die Probleme der Zelle und der Arzneimittel- / Chemikalienabgabestrategien anspricht, kombiniert diese Ansätze mit dem Einsatz von Biomaterialien ^{14 , 22 , 23} . Biomaterialien wie Hydrogele sind in der Lage, die biochemischen und physikalischen Eigenschaften der extrazellulären Matrix (ECM) zu emulieren, wobei sie in der Zellabgabe undD Retention innerhalb des verletzten Bereichs und liefert Wachstumsfaktoren und andere bioaktive Moleküle mit kontrollierter Freisetzung ²² . Die attraktiven Merkmale dieser biomaterialbasierten Strategien haben zu einer Nachweis der in vivo axonalen Regeneration nach der Transplantation von Gerüsten in den Läsionsbereich ^{24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 geführt} . Allerdings ersetzen azelluläre Biomaterial-Strategien nicht verlorene neuronale Populationen; Wenn sie als Lieferfahrzeuge für neuronale, gliale oder neuronale Vorläuferzellen verwendet werden, sind Biomaterialien nicht in der Lage, Fern-Axonal-Netzwerke zu rekonstituieren. Die Herausforderung, einen Ansatz zu entwickeln, der sowohl die axonale Wegdegeneration als auch den neuronalen Verlust, der mit der ZNS-Verletzung und der Krankheit verbunden ist, bekämpft, bleibt noch <Sup class = "xref"> 31.

Unsere Forschungsgruppe berichtete bisher über die Entwicklung von implantierbaren mikrogewebetechnischen neuronalen Netzwerken (Mikro-TENNs), die eine Art von "lebendem Gerüst" sind, bestehend aus neuronalen Zellkörpern, die auf ein oder beide Enden einer Agarose-Hydrogel-ECM-Mikrosäule beschränkt sind Mit ausgerichteten axonalen Traktaten, die sich im gesamten Inneren dieser dreidimensionalen (3D) Umhüllung ^{1 , 10 , 31 , 32} erstrecken. Einer der Hauptunterschiede zwischen dieser Technik und früheren Ansätzen besteht darin, dass die Cytoarchitektur von Mikro-TENNs vollständig in vitro erzeugt und danach nach ^{33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 ,} <transplantiert wirdSup class = "xref"> 39 ^{, 40 , 41} . In-vitro- Fertigung bietet eine ausgedehnte räumliche und zeitliche Kontrolle von zellulärem Phänotyp und Orientierung, mechanisch-physikalischen Eigenschaften, biochemischen Cues und exogenen Faktoren, die die Integration dieser Gerüste mit dem Wirt nach der Implantation ^{41 , 42} zugute ^kommen . Mikro-TENNs sind anatomisch inspiriert, weil sie die Hirnneuroanatomie emulieren und axonale Traktate zeigen, die denen ähnlich sind, die verschiedene funktionale Bereiche des Gehirns überbrücken (Abbildung 1A ) ¹ . Daher kann diese Strategie in der Lage sein, die verlorenen weißen Materie Traktate und Neuronen nach der Implantation in eine läsionierte Region physisch zu ersetzen. Diese Technik wird auch von Entwicklungsmechanismen inspiriert, in denen "natürliche lebende Gerüste", die durch radiale Gliazellen und wegweisende Axone gebildet werden, als Wegweiser für Zelle dienenMigration aus der subventrikulären Zone und axonale Auswüchse bzw. ⁴³ . Diese Mechanismen werden in den ausgerichteten axonalen Traktaten von Mikro-TENNs rekapituliert, die lebende Wege für die neuronale Zellmigration und die axonale Regeneration durch axonvermitteltes axonales Auswachsen darstellen können (Abbildung 1C ) ⁴³ . Darüber hinaus nutzt diese Strategie die synaptische Integration zwischen den Mikro-TENN-Neuronen und nativen Schaltkreisen und bildet neue Relais, die zur funktionellen Wiederherstellung beitragen können (Abbildung 1B ) ⁴³ . Die Fähigkeit zur Synapsenbildung kann auch diesem Ansatz die Möglichkeit geben, das ZNS zu modulieren und auf das Gewebe nach Netzwerkrückmeldung zu reagieren. Zum Beispiel können optogenetisch aktive Neuronen in den lebenden Gerüsten stimuliert werden, um Host-Neuronen durch synaptische Wechselwirkungen zu modulieren (Abbildung 1D ).

Darüber hinaus ist die Biomaterial-basierte RohrkonstruktionDie Vermeidung von Mikro-TENNs bietet eine adäquate Umgebung für die Zelladhäsion, das Wachstum, die Neuritenverlängerung und die Signalisierung, während die Miniaturabmessungen der Konstrukte potentiell eine minimal invasive Implantation ermöglichen und eine teilweise sequestrierte Mikroumgebung für eine allmähliche Integration in das Gehirn bieten. In der Tat haben die jüngsten Veröffentlichungen das Potenzial von Mikro-TENNs nachgewiesen, um neuronale Wege nach der Implantation in das Rattenhirn zu imitieren. Nach der stereotaktischen Mikroinjektion haben wir bisher den Nachweis des mikro-TENN-neuronalen Überlebens, die Aufrechterhaltung der axonalen Traktarchitektur und die Neuritenerweiterung in den Wirtskortex mindestens 1 Monat in vivo ^{10 , 31} gemeldet. Darüber hinaus lieferte die Markierung mit Synapsin histologische Hinweise auf die synaptische Integration mit dem nativen Gewebe ^{10 , 31} . Insgesamt können Mikro-TENNs eindeutig geeignet sein, um beschädigt zu rekonstruieren und zu modulierenZNS durch Ersetzen verlorener Neuronen, synaptische Integration mit Host-Schaltungen, Wiederherstellung der verlorenen axonalen Cytoarchitektur und in bestimmten Fällen die Bereitstellung von regenerierenden Axonen mit den entsprechenden Pfadfindungs-Cues.

Abbildung 1: Grundsätze und Inspirationen hinter der Entwicklung von mikrogewebetechnischen Neuronennetzen (Mikro-TENNs). ( A ) Micro-TENNs imitieren die Cytoarchitektur des Gehirnverbundes (violett), in der funktionell unterschiedliche Bereiche durch lange, ausgerichtete Axonaltrakte in einer unidirektionalen (rot, grün) oder bidirektionalen (blauen) Weise verbunden sind. Beispielsweise könnten Mikro-TENNs verlorene Verbindungen in kortikothalamischen und nigrostriatalen Bahnen oder im perforanten Weg von der entorhinalen Kortex zum Hippocampus (angepasst von Struzyna et al. , 2015) rekonstituieren. ( B ) Diagramm einer UnidirektionaL und bidirektionale Mikro-TENN (rot und blau) synaptisch mit der Host-Schaltkreise (lila) integriert, um als funktionales Relais zwischen beiden Enden einer Läsion zu dienen. ( C ) Schematische Darstellung der axonalen Traktate eines unidirektionalen Mikro-TENN (grün), die als Leitfaden für die axon-erleichterte Regeneration von Wirts-Axonen (violett) zu einem Ziel dienen, mit dem das Mikro-TENN wechselwirkt. ( D ) Konzeptionelle Darstellung der Verwendung von optogenetisch aktiven Mikro-TENNS als Neuromodulatoren unter Ausnutzung der synaptischen Integration mit exzitatorischen oder inhibitorischen Neuronen (unten). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Das aktuelle Manuskript beschreibt die Methodik, die zur Herstellung von Mikro-TENNs unter Verwendung von embryonal abgeleiteten zerebralen kortikalen Neuronen verwendet wird. Bemerkenswerterweise könnten Mikro-TENNs mit anderen Arten von neuralen Zellen hergestellt werden. Für exReichlich, die ersten Berichte über die erfolgreiche Mikro-TENN-Entwicklung vorgestellten Dorsal Wurzelganglion (DRG) Neuronen ³² . Die Hydrogel-Mikrosäulen können erzeugt werden (Abbildung 2A ) durch Zugabe von flüssiger Agarose zu einer maßgeschneiderten, lasergeschnittenen zylindrischen Kanalanordnung oder zu Kapillarrohren, die beide ausgerichtete Akupunkturnadeln enthalten. Die Nadel bildet das Lumen und bestimmt den Innendurchmesser (ID) der Mikrosäule, während die Kapillarröhren-ID und der Durchmesser der Zylinder in der Laserschneidvorrichtung den Außendurchmesser (OD) der Konstrukte diktieren. Die OD und ID können entsprechend der gewünschten Anwendung gewählt werden, indem man unterschiedliche Durchmesser für die Geräte / Kapillarrohre bzw. die Akupunkturnadeln auswählt. Die Länge der Mikrosäulen kann auch variiert werden; Bisher haben wir den Bau von Mikro-TENNs bis zu 20 mm in der Länge ¹⁰ gemeldet und betreiben aktiv noch längere Längen. Nach den Agarosegelen und der Akupunktur nEedles werden entfernt, eine ECM-Lösung, die im allgemeinen aus Kollagen Typ I und Laminin besteht, wird dem Lumen der Konstrukte hinzugefügt ( Fig. 2C ). Der ECM-Kern sorgt für ein Gerüst zur Unterstützung der neuronalen Zelladhäsion und des axonalen Auswuchses. Anfänglich wurden primäre Ratten-kortikale Neuronen in den Mikrosäulen unter Verwendung von dissoziierten Zellsuspensionen ^{10 , 31 , 32} plattiert. Allerdings hat dieser Ansatz in allen Fällen nicht die Ziel-Cytoarchitektur hervorgebracht, die als die neuronalen Zellkörper definiert wurde, die auf die Enden der Mikrosäulen beschränkt waren, wobei das zentrale Lumen aus reinen, ausgerichteten axonalen Traktaten bestand. Seither hat die Verwendung eines erzwungenen neuronalen Aggregationsverfahrens (basierend auf Protokollen von Ungrin et al .) Eine zuverlässigere und konsistentere Herstellung von Mikro-TENNs mit der idealen Struktur ermöglicht (Abbildung 2B ) ⁴⁴ . Neben der Beschreibung der aktuellenMethodik, wird dieser Artikel zeigen repräsentative Phasenkontrast und konfokale Bilder von Mikro-TENNs, die die Bildung von axonalen Traktaten im Laufe der Zeit, sowie die finalisierte Ziel-Zytoarchitektur zeigen. Dieses Manuskript wird auch auf bemerkenswerte Aspekte des Protokolls und die verbleibenden Herausforderungen und zukünftigen Richtungen der Mikro-TENN-Technologie erweitern.

Abbildung 2: Schematische Darstellung des dreistufigen Mikro-TENN-Herstellungsprozesses. ( A ) Entwicklung des Agarose-Hydrogels: (i) Zunächst wird eine kleine Akupunkturnadel ( z. B. 180-350 μm Durchmesser) in die zylindrischen Kanäle einer maßgeschneiderten, lasergeschnittenen Form oder eines Kapillarrohres ( z , Durchmesser von 380-700 μm). Im nächsten Schritt wird flüssige Agarose in DPBS in die zylindrischen Kanäle oder Kapillarrohre eingeführt. (Ii) Nach den Agarosegelen wird die Nadel entfernt undDie Form wird zerlegt, um die hohlen Agarose-Mikrosäulen zu ergeben. (Iii) Diese Konstrukte werden dann sterilisiert und in DPBS gelagert. ( B ) Primäre Neuronenkultur und die Aggregatmethode: (i) Die neuronale Aggregation wird in pyramidenförmigen Mikro-Well-Arrays durchgeführt, die aus 3D-bedruckten Formen gegossen werden, die in die Vertiefungen einer 12-Well-Kulturplatte passen. (Ii) Mikro-TENNs umfassen primäre Rattenneuronen, die von fetalen Gehirnen von Embryon-Tag-18-Ratten dissoziiert sind. Nach der Gewebedissoziation mit Trypsin-EDTA und DNase I wird eine Zelllösung mit einer Dichte von 1,0-2,0 x 10 & ^sup6; Zelle / ml hergestellt. (Iii) 12 & mgr; l dieser Lösung werden in jede Vertiefung in dem pyramidenförmigen Mikro-Well-Array übertragen. Die Platte, die diese Mikro-Vertiefungen enthält, wird zentrifugiert, um Zellaggregate zu erzeugen. (Iv) Diese werden dann über Nacht vor dem Plattieren in den Mikrosäulen inkubiert. ( C ) ECM-Kernherstellung und Zellseeding: (i) Vor der Zellseedung wurde eine ECM-Lösung mit 1 mg / ml Typ I Kollagen und 1 mg / mlLaminin wird in das Innere der Mikro-TENNs überführt und polymerisiert. (Ii) Abhängig davon, ob unidirektionale oder bidirektionale Mikro-TENNs hergestellt werden, wird ein Aggregat an einem oder beiden Extremen der Mikrosäule platziert. (Iii) Nach einer Inkubationszeit zur Förderung der Adhäsion werden Mikro-TENNs in Petrischalen gezüchtet, die mit einem ergänzten embryonalen neuronalen Basalmedium überflutet sind. (Iv) Nach 3-5 Tagen in Kultur sollte die endgültige Mikro-TENN-Struktur Zelle Aggregate an den Extremen der Mikrosäule zeigen, wobei axonale Traktate ihre Länge überspannen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Protocol

Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden von den Institutional Animal Care und Use Committees an der University of Pennsylvania und dem Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center genehmigt und beachteten die Richtlinien, die in der NIH Public Health Service Policy für Humane Care und Use of Laboratory dargelegt wurden Tiere (2015).

1. Entwicklung des Agarose-Hydrogels (Acelluläre Komponente von Mikro-TENNs)

1. Agarose-Lösungsvorbereitung
   1. In einem Biosicherheitsschrank werden Reservoirs für die Mikrosäulen vorbereitet, indem 20 ml Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) in jede von zwei 10-cm-Petrischalen überführt werden. Sterilisieren Sie feine Zangen und Mikroskalpelle mit einem heißen Wulst-Sterilisator.
   2. 3 g Agarose wiegen und in ein steriles Becherglas im Biosicherheitsschrank überführen. 100 ml DPBS für eine Endkonzentration von 3% Gewicht / Volumen (w / v) zugeben. Füge einen sauberen Magnetstab ein und decke den Becher mit Alumi abNum folie
   3. Mit einer Heißplatte / Rührer den Becher bei 100 ° C erwärmen und bei 120-200 U / min umrühren, um die Agarose vollständig aufzulösen (die Lösung wird von bewölkt zu klar). Halten Sie das Erhitzen und rühren danach, um die Gelierung zu verhindern und die Heiztemperatur nach Bedarf zu ändern, um die Verbrennung der Agarose zu vermeiden.
      HINWEIS: Die Fertigung mit dem Laserschnitt und den Kapillarrohren ist nachfolgend in den Abschnitten 1.2 bzw. 1.3 dargestellt. Fahren Sie mit dem Unterabschnitt 1.4 fort, nachdem Sie die in beiden Unterabschnitten beschriebenen Schritte beendet haben. Für beide Mikro-Säulen-Herstellungsverfahren, fügen Sie die flüssige Agarose schnell, wie Agarose verfestigt sich schnell, wie es abkühlt. Bei der Sterilisation mit einem Autoklaven in einem der folgenden Schritte, verwenden Sie die Standardbedingungen für Glaswaren.
2. Mikro-Säulen-Zubereitung mit einem Laserschnitt
   HINWEIS: Die Lasergeschnittene Vorrichtung wird aus transparentem Acryl mit einem handelsüblichen CO ₂ -Laserschneider geschnitten. Das fabriKation von Strukturen und Geräten durch Laserschneiden ist für eine Reihe von Ingenieur- und Forschungsanwendungen ^{45 , 46 , 47} gut dokumentiert. Diese Form ( Figur 3 ) besteht aus einer Anordnung von fünf zylindrischen Kanälen mit jeweils einem Durchmesser von 398 μm und einer Länge von 6,35 mm. Diese zylindrischen Arrays werden entlang ihrer Länge um zwei Stücke gebildet: eine untere Hälfte (Länge: 25,4 mm, Breite: 6,35 mm, Höhe: 6,0 mm) und eine obere Hälfte (Länge: 31,5 mm, Breite: 6,35 mm, Höhe: 12,7 mm ), Wie in den Fig. 3A und 3B gezeigt . Die beiden Hälften können durch die in Abbildung 3C beobachteten vorderen und hinteren Kappen (Länge: 31,5 mm, Breite: 6,35 mm, Höhe: 12,7 mm) zusammengeklemmt werden, die vier Ausrichtungslöcher aufweisen, die mit zwei Löchern jeweils oben und unten zusammenfallen Stücke und das hilft, alle Teile bei der Verschraubung zu sichern. Diese Caps auch incLügen Sie fünf Löcher, konzentrisch zu den zylindrischen Kanälen, in die die Akupunkturnadeln eingefügt werden können, um das Lumen der Mikrosäulen zu bilden.
   1. Sterilisieren Sie die in Abbildung 3 dargestellte Vorrichtung, indem Sie sie mit Aluminiumfolie und Autoklavieren abdecken. Montieren Sie das Gerät wie in Abbildung 3D gezeigt, indem Sie die vorderen und hinteren Kappen mit nur dem unteren Halbstück ausrichten und die drei Teile mit zwei # 4-40 Schrauben und Muttern (Gewindedurchmesser: 3,05 mm) in den unteren Ausrichtungslöchern befestigen.
   2. Führen Sie eine Akupunkturnadel (Durchmesser: 180 μm, Länge: 30 mm) vollständig in die Nadellöcher an der vorderen oder hinteren Kappe des Gerätes ein (Abbildung 3D ). Mit einer Mikropipette gießen Sie genug flüssige Agarose (~ 1 ml für die fünf Kanäle) auf das untere Halbstück, um alle zylindrischen Kanalhälften vollständig zu füllen.
   3. Setzen Sie das Oberteil des Gerätes sofort auf die untere Hälfte und wenden Sie den Druck bis zum Anschlag festPlatz, um die zylindrischen Kanäle zu vervollständigen (Reibung zwischen den Kappen und dem Oberteil hält diese an Ort und Stelle). Warten Sie ~ 5 min bei Raumtemperatur nach Agarose-Zugabe, um die Gelierung innerhalb der Kanäle des Gerätes zuzulassen.
   4. Manuell die Nadel aus jedem der Löcher auf die Kappen des Gerätes herausziehen. Entfernen Sie die Schrauben und trennen Sie die beiden Kappen und die obere Hälfte manuell von der unteren Hälfte, wo die letzteren die Hydrogel-Mikrosäulen halten werden.
   5. Verwenden Sie eine feine Zange, um die Mikrosäulen vorsichtig aus den Kanälen auf dem unteren Halbstück zu entfernen und in die zuvor hergestellte Petrischale mit DPBS zu legen (Schritt 1.1.1). Wiederholen Sie das Gerät für eine weitere Runde der Mikrosäulenfertigung. Weiter mit Unterabschnitt 1.4.
3. Mikrosäulenfertigung mit Kapillarrohren
   1. Übergangsglas-Kapillarrohre (Durchmesser: 398,78 μm, Länge: 32 mm) zur Innenseite des Biosicherheitsschrankes. Manuell brechenLange Röhrchen in 2,0-2,5-cm-Fragmente geben und eine Akupunkturnadel (Durchmesser: 180 μm, Länge: 30 mm) vollständig in jedes Fragment einfügen (Abbildung 2A ).
   2. 1 ml flüssige Agarose aus dem Becher auf die Oberfläche einer leeren Petrischale geben. Halten Sie das Kapillarrohr und die eingeführte Nadel, legen Sie ein Ende des Röhrchens in Kontakt mit dem flüssigen Agarose-Pool, um es durch Kapillarwirkung zu füllen. Bewegt die Tube, um den Kapillaraufstieg zu fördern.
      HINWEIS: Füllen Sie die Kapillarrohre mit flüssiger Agarose so hoch wie die Kapillarwirkung erlaubt ist. Danach können diese Mikrosäulen je nach gewünschter Länge in kleinere Konstrukte geschnitten werden. Der 1-mL-Agarose-Pool wird typischerweise nur für ein Röhrchen verwendet, da sich die Agarose schnell abkühlt und sich schnell risst und eine weitere Kapillarwirkung verhindert.
   3. Wenn die Flüssigkeit aufhört zu steigen, entfernen Sie das Kapillarrohr aus dem Pool und legen Sie es waagerecht auf die Oberfläche einer Petrischale. Warten Sie 5 min, um das Agarosegel in die Röhrchen zu lassen. </ Li>
   4. Setzen Sie den Daumen und Zeigefinger auf beiden Seiten des Rohres und drücken Sie dagegen. Benutze die andere Hand, um schnell die Nadel herauszuziehen, während du den Daumen und den Zeigefinger benutzt, um zu verhindern, dass die Mikrosäule selbst aus dem Rohr herausrutscht. Setzen Sie eine 30-Gauge-Nadel in das Kapillarrohr ein, um die Mikrospalte langsam in eine Schale zu bringen, die DPBS enthält (Schritt 1.1.1).
4. Micro-Säulen-Trimmen und Sterilisation
   1. Zutritt eine Mikrospalte von DPBS auf eine leere Schale mit feiner Pinzette übertragen. Füge 10 μl DBPS an die Spitze der Mikrosäule mit einer Mikropipette hinzu, um ein Trocknen zu verhindern. Legen Sie das letztere Gericht unter ein Stereoskop zur visuellen Führung.
      ANMERKUNG: Während des Protokolls bezieht sich die Mikrosäulentrocknung oder -trocknung auf den Erwerb einer zerknüllten Struktur, die visuell von dem typischen, hydratisierten Aussehen dieser Konstrukte unterscheidbar ist. Dehydrierte Mikrosäulen fest an der Oberfläche von Petrischalen und cAnnot kann leicht bewegt werden, während hydratisierte Konstrukte dazu neigen, über die Oberfläche zu gleiten, nachdem sie mit einer Pinzette manipuliert wurden. Ein Phasenkontrastbild einer vollständig getrockneten Mikrosäule ist in Fig. 8A gezeigt .
   2. Die Mikrospalte mit einem Mikroskalpel abschneiden, um sie auf die gewünschte Länge zu verkürzen (hier 2-5 mm). Transportieren Sie die getrimmte Mikrosäule mit feiner Pinzette zu der anderen in Schritt 1.1.1 hergestellten DPBS-Petrischale.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.1 und 1.4.2 für jede gefertigte Mikrosäule.
   4. Sterilisieren der Mikrosäulen in den DPBS-haltigen Petrischalen unter UV-Licht für 1 h. Die Petrischalen bei 4 ° C vor der ECM-Zugabe und der Zellbeschichtung aufbewahren.

2. Primäre Neuronenkultur und erzwungene Zellaggregationsmethode

1. Vorbereitung des pyramidenförmigen Mikro-Well-Arrays
   HINWEIS: Dieser Abschnitt verwendet eine 3D-bedruckte Form, die aus einer zylindrischen Basis (Durchmesser: 2,2 cm, Höhe: 7,0 mm) a bestehtNd neun quadratische Pyramiden oben (Seitenlänge: 4,0 mm, Neigungswinkel: 60 °), organisiert in einem 3 x 3 Array, wie in Abbildung 3E gezeigt . Das Additiv-Herstellungsverfahren mit handelsüblichen 3D-Druckern ist gut dokumentiert. Computergestützte Design-Software kann verwendet werden, um die Form zu entwerfen. Die daraus resultierende Designdatei kann dann digital in einen Werkzeugweg für einen 3D-Drucker umgewandelt werden. Jeder Drucker hat unterschiedliche Spezifikationen, und die Anweisungen zum Einrichten und Betreiben eines 3D-Druckers variieren entsprechend.
   1. Verwenden Sie einen 3/32 "Bohrer, um 16 Löcher in einem 4 x 4 Array zu punktieren (Seitenlänge: 4 cm, Lochtrennung: 1 cm), zentriert in den Deckel einer 10 cm Petrischale. Im Inneren einer chemischen Dunstabzugshaube verwenden Das untere Stück der Petrischale, um 27 g Polydimethylsiloxan (PDMS) und 3 g Härtungsmittel (für ein Verhältnis von 1:10) zu wiegen. Mit einem Mikrospatel rühren, um das Mittel gleichmäßig zu verteilen.
   2. Decken Sie das PDMS / Härtungsmittel mit dem punktierten Deckel ab. Verbinden Sie ein Ende eines Schlauches mit dem VakuumM Port der Dunstabzugshaube und stecke das andere Ende in den Stamm eines Trichters ein (Munddurchmesser: 10 cm, Stammlänge: 3 cm, Stammdurchmesser: 1,5 cm).
   3. Machen Sie eine Öffnung mit einem 3/32 "Bohrer an der Oberseite einer 1 mL Pipette Glühbirne und legen Sie eine 1000 μL Mikropipettenspitze in die Öffnung (mit dem spitzen Ende nach oben) ein. Legen Sie die Lampe und die Spitze in den Schlauch und ziehen Sie sie Der Schlauch nach oben, bis die Lampe den Schlauch in den Stamm des Trichters abdichtet.
   4. Setzen Sie den Trichter auf den Lochblechdeckel und sichern Sie den Schlauch mit einer stabilen Stütze. Das Vakuumventil für 5 min zum Ansaugen öffnen und die Luftblasen an die Oberfläche bringen.
   5. Schließen Sie das Ventil, entfernen Sie den Trichter und schlagen Sie die Petrischale gegen die Oberfläche der Dunstabzugshaube ~ 3 mal, um alle verbleibenden Luftblasen zu platzen.
   6. Legen Sie eine pyramidenförmige 3D-bedruckte Form in jede der Vertiefungen in einer 12-Well-Kulturplatte, wobei die Pyramiden nach oben zeigen. Gießen Sie das PDMS / Härtungsmittel oben auf die Formen, bis jede Vertiefung von tEr ist gefüllt Die 12-Well-Platte mit dem Deckel bedecken und 1 h bei 60 ° C in einen Ofen geben, um zu trocknen.
   7. Entfernen Sie vorsichtig jedes PDMS-Mikro-Well-Array (Abbildung 3F ) von der Platte mit einem Mikrospatel. Die PDMS-Arrays mit Aluminiumfolie abdecken und durch Autoklavieren sterilisieren. Innerhalb eines Biosicherheitsschranks ein Mikro-Well-Array in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte einführen (Abbildung 2B ).
2. Kortikale Neuronisolation aus Rattenföten
   1. Füge ~ 20 ml Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS) zu jedem von vier bis sechs 10 cm Petrischalen (eine für jedes seziertes Gewebe) in einem Biosicherheitsschrank hinzu. Übertragen Sie diese Gerichte zu einer Dissektionshaube und legen Sie sie auf Eis. Sterilisieren Sie Dissektionsinstrumente, wie Mikroskalpelle, Scheren und Pinzetten, mit einem heißen Wulst-Sterilisator.
   2. Vorwarmes embryonales Neuron basales Medium + 2% serumfreies Supplement + 0,4 mM L-Glutamin (hier als "Kulturmedium" bezeichnet)R) und 0,25% Trypsin + 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei 37 ° C. Tau-Desoxyribonuklease (DNase) I durch Platzieren bei Raumtemperatur. Vorbereiten von 1,5 ml einer 0,15 mg / ml DNAse I-Lösung in HBSS und Aufrechterhalten der Lösung auf Eis.
   3. Euthanasieren Sie eine zeitlich schwangere Embryon-Tag-18-Ratte durch Kohlendioxid-Inhalation und bestätigen Sie den Tod durch Enthauptung. Übertragen Sie die Karkasse zu einer sterilen Dissektionshaube und legen Sie sie ventral nach oben. Spülen Sie den Bauch gründlich mit 70% Ethanol.
   4. Öffnen Sie den Uterus und entfernen Sie die Föten (meist ~ 11) aus den Fruchtwassersäcken mit einer Schere und übertragen Sie sie mit einer Pinzette zu einer Petrischale mit kaltem HBSS, wie beschrieben ⁴⁸ . Legen Sie einen gekühlten (-20 ° C) Granitblock unter das Stereoskop. Legen Sie die Petrischale auf die Oberfläche dieses kalten Blocks, um die niedrige Temperatur des HBSS während des Dissektionsprozesses zu erhalten.
   5. Spülen Sie die Welpen, indem Sie die HBSS herumschwingen und dann auf das nächste saubere Teller übertragenHBSS enthalten. Mit Hilfe des Stereoskops und der Sektionsinstrumente entfernen Sie nacheinander die Köpfe, die zerebralen Hemisphären und die Kortizes der Föten und übertragen jedes Gewebe mit einer Pinzette nach jeder Sektion auf eine neue HBSS-gefüllte Schale.
   6. Aspirieren Sie nur die Cortices mit einer Pasteurpipette und legen Sie das Gewebe in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Verwerfe die anderen zerlegten Gewebe. Spülen Sie die Cortices dreimal durch sequentielles Hinzufügen und Entfernen von ~ 5 ml HBSS mit einer serologischen Pipette. Legen Sie den Schlauch auf Eis, wenn nicht in Gebrauch.
   7. Übertragen Sie die Cortices mit einer Pasteurpipette auf ein 15-ml-Röhrchen, das vorgewärmtes Trypsin-EDTA (4-6 Cortices pro 5 ml Trypsin-EDTA) enthält. Manuell das Röhrchen einmal rühren und auf 37 ° C stellen. Umkehren Sie die Tube alle 3 min, um zu verhindern, dass das Gewebe verklumpt wird.
   8. Stoppen Sie die Exposition gegenüber Trypsin nach ~ 10 min, indem Sie das Gewebe mit einer Pasteurpipette entfernen und auf eine saubere 15-ml-Zentrifuge übertragenTube. Füge die 0,15 mg / ml DNase I-Lösung (1,5 ml) mit einer Pipette zum Röhrchen hinzu.
   9. Verwenden Sie eine Pasteurpipette, um Gewebeklumpen manuell aufzubrechen und dann vorzuräumen (~ 30 s), bis die Lösung homogen erscheint und es keine verbleibenden Gewebefragmente in der Flüssigkeit gibt. Wenn es nicht möglich ist, die Lösung vollständig zu homogenisieren, extrahieren Sie die unlöslichen Fragmente, indem Sie sie in die Spitze einer Pasteurpipette ziehen.
   10. Zentrifugieren der in Schritt 2.2.9 erhaltenen homogenen Zelllösung bei 200 xg für 3 min. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pasteurpipette und achten Sie darauf, die pelletierten Zellen nicht zu stören. Füge 2 ml Kulturmedium mit einer serologischen Pipette hinzu und verwirre, um die Zellen zu resuspendieren.
   11. Zählen Sie die Anzahl der Zellen in der in Schritt 2.2.10 hergestellten Lösung unter Verwendung eines Hämocytometers; Die erwartete Ausbeute beträgt 3,0-5,0 x 10 ⁶ Zellen / kortikale Hemisphäre. 1 ml oder mehr Zellsuspension im Kulturmedium mit einer Dichte von 1,0-2,0 x 10 & ^sup6; Zellen / ml zubereiten.
3. Bildung von neuronalen Zellaggregaten
   1. Mit einer Mikropipette fügen Sie 12 μl der 1,0-2,0 x 10 ⁶ / mL Zellsuspension in jede Mikro-Vertiefung des PDMS-Arrays hinzu (das in Schritt 2.1.7 in die Platte gelegt wurde).
      HINWEIS: Die Zellkonzentration kann in Abhängigkeit von der Mikrosäulen-ID und der gewünschten Zell-Aggregat-Größe eingestellt werden, da höhere Konzentrationen größere Aggregate ergeben.
   2. Zentrifugieren der Platte bei 200 xg für 5 min, um die Aggregation von Zellen an der Unterseite der Mikro-Vertiefungen zu zwingen ( 2B ). Sorgfältig fügen Sie ~ 2 ml Kulturmedium an die Spitze jedes PDMS-Arrays, um alle geimpften Mikro-Brunnen zu decken, wobei darauf geachtet wird, dass die aggregierten Zellen nicht gestört werden.
   3. Wenn die Zellen nicht mit einem viralen Vektor transduziert werden, inkubieren Sie die Platte für 12-24 h bei 37 ° C und 5% CO ₂ und gehen dann weiter zu Abschnitt 3. Wenn die Aggregate transduziert werden, überspringen Sie die Inkubation und fahren Sie mit Abschnitt 2.4 fort .
4. TranSduktion mit einem viralen Vektor zur Beobachtung der Kalziumsignalisierung
   Anmerkung: Diese Schritte werden durchgeführt, um Neuronen mit einem viralen Vektor zu transduzieren, der einen genetisch codierten Calciumindikator (GECI) enthält. Die in diesem Artikel gezeigten Ergebnisse wurden unter Verwendung eines handelsüblichen Adeno-assoziierten Virus (AAV) (Serotyp 1) mit GCaMP6f, einem GECI mit schneller Kinetik bestehend aus grünem Fluoreszenzprotein (GFP), Calmodulin (CaM) und dem M13-Peptid, Angetrieben durch den menschlichen Synapsin I-Promotor. Die virale Vektorlösung kann eine Verdünnung in sterilem DPBS vor der Transduktion erfordern, abhängig von der Konzentration der Stammlösung. Zell-Gesundheit / Morphologie und GCaMP6f Signalstärke muss im Laufe der Zeit für eine Reihe von Vektor-Konzentrationen beobachtet werden. Diese Optimierungsprozedur muss von jedem Forscher durchgeführt werden, um den geeigneten Titer für ihre eigenen Zellkulturen zu bestimmen. Die typische GCaMP6f-Expressionszeit beträgt 7-8 Tage nach der Transduktion, die während der Inkubation in stEp 2.4.2.
   1. Mit einer Mikropipette fügen Sie das erforderliche Volumen der viralen Vektorlösung (für eine Endkonzentration von ~ 3,0 x 10 ⁹ genomischen Kopien pro Aggregat) dem Kulturmedium hinzu, das die Aggregate bedeckt. Langsam Pipettieren nach oben und unten, um sicherzustellen, dass die Vektorlösung homogen im gesamten Kulturmedium verteilt ist.
   2. Inkubieren Sie die Platte mit den seedierten pyramidenförmigen Mikro-Vertiefungen für 24 h bei 37 ° C und 5% CO ₂ , um die virale Transduktion von GCaMP6f zu ermöglichen.
      

3. Entwicklung der zellulären Komponente von Mikro-TENNs

1. ECM Kernfertigung
   1. Nach der aggregierten Inkubation fügen Sie Typ I Kollagen und Laminin dem Kulturmedium (für eine Konzentration von jeweils 1 mg / ml) in einem Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, um die ECM-Lösung herzustellen. Führen Sie die Schritte 3.1.2-3.1.4 bei Raumtemperatur durch, aber pflegen Sie das Röhrchen mit ECM auf Eis, wenn es nicht benutzt wird, um eine vorzeitige Gelierung zu verhindern.
      
   2. Den pH-Wert der ECM-Lösung durch Übertragen von 1-2 & mgr; l auf Lackmuspapier einstellen, um den anfänglichen pH-Wert zu verifizieren, wobei 1 & mgr; l 1 N Natriumhydroxid (NaOH) und / oder 1 N Salzsäure (HCl) Und wiederholen, bis der pH-Wert 7,2-7,4 ist. Sicherstellen einer Homogenisierung der ECM-Lösung durch Pipettieren auf und ab, während die Bildung von Luftblasen vermieden wird.
   3. Übertragen Sie die Mikrosäulen mit sterilisierter Pinzette aus dem Geschirr in Schritt 1.4.3, um 35- oder 60-mm-Petrischalen zu entleeren. Arbeiten Sie an 4-5 Mikrosäulen zu einer Zeit, um Austrocknung zu verhindern. Befestigen Sie eine 10-μl-Spitze, die an einer 1000-μL-Spitze an einer Mikropipette befestigt ist. Mit dem Stereoskop zur visuellen Führung legen Sie die Spitze an einem Ende der Mikrosäulen und saugen, um restliche DPBS und Luftblasen aus dem Lumen zu extrahieren.
   4. Schnelles Auftragen von 4-5 μl ECM in einer Mikropipette. Beobachtung unter einem steReoscope, platzieren Sie die Spitze der Mikropipette an einem der Enden der Mikrosäulen und entladen Sie genug ECM, um das Lumen zu füllen. Bestätigen Sie die Abwesenheit von Luftblasen im Lumen, da diese das axonale Auswachsen durch das ECM hemmen können. Wenn Luftblasen vorhanden sind, entfernen Sie das ECM, wie in Schritt 3.1.3 erläutert, und fügen Sie das ECM erneut hinzu.
   5. Um eine Dehydratation zu verhindern, fügen Sie ~ 2 μl ECM um jede Mikrosäule hinzu. Inkubieren der Hydrogel / ECM-Mikrosäulen in den Petrischalen bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 25 min. Gehen Sie sofort nach der Inkubation zur Zellseedingung.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit in Schritt 3.1.5 soll die Zeit für die Polymerisation von Kollagen und Laminin innerhalb der Mikrosäulen ermöglichen.
2. Neuronale Zellsäen in den Mikrosäulen
   HINWEIS: Um das Kulturmedium der transduzierten Aggregate zu wechseln, neigen Sie die Platte, verwenden Sie eine Mikropipette, um das Medium zu entfernen, das an der Wand des Brunnens blinkt, und fügen Sie dann langsam ~ 1 ml gegen die(Um die Aggregate in den pyramidenförmigen Mikro-Brunnen zu stören). Wiederholen Sie diese Mitteländerung ein zweites Mal.
   1. Nach der Inkubationszeit in Schritt 3.1.5 übergeben Sie etwa 10-20 μl Kulturmedium auf zwei freie Bereiche in den Petrischalen, die die Mikrosäulen halten. Verwenden Sie eine Mikropipette, um die Aggregate einzeln auf die Petrischale zu übertragen, die die Konstrukte enthält, und verschieben Sie sie mit einer Pinzette zu einem der kleinen Becken des Kulturmediums, um die Zellgesundheit zu erhalten.
   2. Bei der Beobachtung unter einem Stereoskop ein Aggregat an jedem Ende der Mikrosäulen für bidirektionale Mikro-TENNs oder an einem Ende für eine unidirektionale Architektur (wie gewünscht) mit Pinzette einfügen. Bestätigen Sie die Platzierung der Aggregate innerhalb der Mikrosäulen mit dem Stereoskop. Verwenden Sie Pinzette, um die geimpften Mikro-Säulen in den anderen kleinen Pool von Kulturmedium zu bewegen, um Austrocknung zu vermeiden und die gesundheitliche Gesundheit zu bewahren.
   3. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 45 min zu aLlow die Aggregate, um das ECM zu halten. Vergewissern Sie sich, dass die Aggregate an den Enden der Mikrosäulen mit dem Stereoskop verbleiben; Die Zelle Aggregate wieder einführen und den Inkubationsschritt nach Bedarf wiederholen.
   4. Die Petrischalen, die die Mikro-TENNs enthalten, sorgfältig mit Kulturmedium (3 oder 6 ml für eine 35 bzw. 60 mm Petrischale) mit einer serologischen Pipette überschwemmen. Legen Sie das Geschirr in einen Inkubator bei 37 ° C und 5% CO ₂ für Langzeitkultur.
   5. Führen Sie Halbmedienwechsel alle 2 Tage mit Kulturmedium durch. Entfernen Sie die Hälfte des alten Mediums vorsichtig mit einer Pipette und verwenden Sie das Stereoskop zur visuellen Führung, um ein Absaugen der Mikro-TENNs zu vermeiden. Ersetzen Sie durch langsames Hinzufügen von frischem, vorgewärmtem Medium mit einer Pipette.
   6. Zur Wiederverwendung der PDMS-Mikro-Well-Arrays, entfernen Sie das Kulturmedium, kochen die Arrays in deionisiertem Wasser für 30 min und sterilisieren in einem Autoklaven für eine weitere Runde der Aggregatbildung und Kultur.
      HINWEIS: Zu den gewünschten ZeitpunktenDie Cytoarchitektur von Mikro-TENNs kann mittels Phasenkontrastmikroskopie nachgewiesen werden. Hier wurde eine Belichtungszeit von 5-8 ms und 10X (0,64 μm / pixel) und 20X (0,32 μm / pixel) Ziele verwendet, um die Phasenkontrastbilder zu erfassen. Die Fluoreszenz, die mit den Calciumkonzentrationsveränderungen in viral transduzierten Mikro-TENNs assoziiert ist, wurde unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzmikroskops mit einer Belichtungszeit von 50 ms, einem 10fachen Objektiv (0,64 & mgr; m / Pixel) und einem Festkörperlicht mit Bandpassfiltern von 480 aufgenommen Nm und ~ 510 nm zur Anregung bzw. Emission, um das GCaMP6f-Fluoreszenzsignal zu visualisieren.

4. Immunzytochemie für In-Vitro- Studien

Hinweis: Für die hier gezeigten Bilder wurden folgende primäre Antikörper verwendet: Maus-Anti-Tuj-1 / beta-III-Tubulin (1: 500) und Kaninchen-Anti-Synapsin-1 (1: 500) für die Markierung von Axonen und Pre -synaptische Boutons. Die sekundären Antikörper waren Esel anti-Mouse 568 (1: 500) und Esel Anti-Kaninchen 488 (1: 500). Die erforderlichen Volumina der vorbereiteten primären und sekundären Antikörperlösungen sowie die Volumina des Formaldehyds, des Pferdeserums und der Detergenslösungen hängen von dem Volumen ab, das zur vollständigen Bedeckung der Konstrukte erforderlich ist. Diese Volumina können unter Verwendung eines hydrophoben Barrierestiftes minimiert werden, um den Bereich zu umgeben, der jede Mikrosäule umgibt.

ACHTUNG: Dieser Abschnitt verwendet Formaldehyd und Hoechst. Formaldehyd ist eine toxische Verbindung, von der bekannt ist, dass sie krebserzeugend ist, und Hoechst ist ein bekanntes Mutagen. Daher müssen diese Verbindungen in einem geeigneten Abfallbehälter entsorgt werden. Behandeln Sie sie immer in einer chemischen Dunstabzugshaube, während Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung verwenden, wie zB ein Laborkittel, Schutzbrille und Handschuhe.

1. Bereiten Sie eine 4,0% Volumen / Volumen (v / v) Formaldehydlösung in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer chemischen Dunstabzugshaube vor.
2. Das Kulturmedium aus den Petrischalen entfernenNg die Mikro-TENNs mit einer Mikropipette. Fügen Sie genügend Volumen der Formaldehyd-Lösung zu den Gerichten, um die Mikro-TENNs vollständig zu bedecken. Die Mikro-TENNs in der Formaldehydlösung für 35 min bei 18-24 ° C einweichen, um die Zellen innerhalb der Mikrosäulen zu fixieren.
3. Entfernen Sie die 4,0% ige Formaldehydlösung aus den Petrischalen mit einer Pipette und entsorgen Sie sie nach den entsprechenden Richtlinien für gefährliche Stoffe.
4. Führen Sie zwei schnelle Spülungen durch, indem Sie genug PBS hinzufügen, um die festen Mikro-TENNs vollständig zu bedecken und dann das PBS mit einer Pipette zu entfernen. Führen Sie eine dritte lange Spülung durch Einweichen der Konstrukte in der PBS für 10 min.
   ACHTUNG: Das PBS, das zum Spülen verwendet wird, verwerfen, das möglicherweise Spuren von Formaldehyd enthält.
5. Vorbereitung einer 0,3% v / v Lösung von nichtionischem Detergens in 4% v / v Pferdeserum in PBS. Entfernen Sie das PBS aus den Petrischalen, die die festen Mikro-TENNs enthalten, und fügen Sie ein ausreichendes Volumen der 0,3% Detergenslösung hinzu, um die Konstrukte zu bedecken. Einweichen für 60 min bei 18-24 & #176, C, um die Zellen zu permeabilisieren.
6. Entfernen Sie die Waschmittellösung mit einer Pipette. Führen Sie zwei schnelle Spülungen durch Hinzufügen und anschließend Entfernen der PBS. Danach drei längere Spülungen durch Einweichen der Konstrukte in PBS für 5 min bei jedem Spülen durchführen.
7. Primäre Antikörper in 4% Pferdeserum verdünnen Entfernen Sie die PBS aus den Petrischalen, die die fixierten und permeabilisierten Mikro-TENNs enthalten. Fügen Sie genügend primäre Antikörperlösung zu den Mikrosäulen hinzu, um sie vollständig zu bedecken. Die Petrischalen mit Parafilm versiegeln, um Verdunstung zu verhindern und über Nacht (12-16 h) bei 4 ° C zu inkubieren.
8. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung aus dem Geschirr und spülen Sie, wie in Schritt 4.6 erläutert. Im Dunkeln die sekundäre Antikörperlösung in 4,0% Pferdeserum vorbereiten. Fügen Sie genügend sekundäre Antikörperlösung hinzu, um die Konstrukte vollständig zu bedecken, die Schalen mit Aluminiumfolie zu bedecken und für 2 h bei 18-24 ° C zu inkubieren.
9. Bereiten Sie die Hoechst-Lösung (1: 10.000) in PBS vor, um die Kerne zu färben.
HINWEIS: Bilder für die immunolierten Mikro-TENNs wurden mit einem Laser-konfokalen Mikroskop mit einer Auflösung von 2.048 (~ 8 s / Rahmen), einer 10fachen Objektiv- (0,64 μm / Pixel), 487-nm-Anregung und ~ 525 nm Emissionswellenlängen aufgenommen Grüne Fluoreszenz, 561 nm Anregung und ~ 595 nm Emissionswellenlängen für rote Fluoreszenz und ~ 3,22 μm / Scheibe mit ~ 60 Scheiben im Durchschnitt für die z-Stacks.

Representative Results

Mikro-TENNs wurden mittels Phasenkontrastmikroskopie zur Bewertung ihrer Cytoarchitektur und des axonalen Auswuchses untersucht (Abbildung 4 ). Innerhalb unidirektionaler, 2 mm langer Mikro-TENNs wurden neuronale Aggregate auf ein Ende der Mikrosäule beschränkt und ein Bündel von Axonen durch den inneren Kern projiziert. Axone überspannten die gesamte Länge der Säule um 5 Tage in vitro (DIV) ( Abbildung 4A ). Es gab eine größere anfängliche axonale Wachstumsrate in bidirektionalen 2 mm langen Mikro-TENNs, da die Axone die gesamte Mikrosäule um 3 DIV überspannten (Abbildung 4B ). Mit 5 DIV zeigten bidirektionale Mikro-TENNs dichte axonale Traktate, die die an den Extremen der Mikrosäule gehaltenen Aggregate miteinander verbunden hatten. Diese Cytoarchitektur wurde auch in 5-mm-Mikro-TENNs beobachtet, wobei die Axone die Mikrosäule um 5 DIV überspannten (Abbildung 4C ). Wie in allen Fällen beobachtet, das ECM im Lumen und die geometrische restriDie von der Agarose vorgelegt wurden, lieferte die Richtungsabhängigkeit, die zur Bildung von axonalen Traktaten erforderlich ist, die die Merkmale der nativen Neuroanatomie strukturell nachahmen.

Immunzytochemie-Techniken wurden in diesem Protokoll angewendet, und konfokale Bilder wurden genommen, um die Komponenten der Mikro-TENN-Architektur zu verifizieren. Zellkeime, die mit Hoechst (blau) gefärbt wurden, wurden fast ausschließlich innerhalb von Aggregaten an den Extremen von unidirektionalen und bidirektionalen Mikrosäulen lokalisiert, wobei im wesentlichen keine Hoechst-Färbung im Inneren ( Fig. 5 ) vorhanden war. Diese Beobachtung bestätigte, was aus den Phasenkontrastbildern abgeleitet wurde: neuronale Populationen wurden auf die Enden beschränkt, und nur Axone (in Rot) überspannten das Lumen der Mikro-TENNs. Jedoch, nachdem die Axone die Aggregate kreuzten, wurde die Zellmigration entlang der axonalen Traktate in das innere Lumen beobachtet, wie durch die Anwesenheit von Keimen (blau) im Innern bei 28 DIV für einen 2 mm langen Bidire beobachtet wurdeCtional micro-TENN (Abbildung 6 ). Darüber hinaus wurde Synaptin I Immunolabeling (grün) in den Zellkörpern und axonalen Traktaten gefunden (Abbildung 6 ). Synapsin I ist ein vor-synaptisches terminales Protein, das in die Regulation der Neurotransmitter-Freisetzung verwickelt ist und auf das Vorhandensein von vor-synaptischen Terminals hindeutet, wenn es in einer Punctate-Verteilung gefunden wird; Es wurde zuvor mit der Bildung von aktiven Synapsen durch ganzzellige Patch-Aufnahmen ⁴⁹ korreliert. Die Synaptin-Färbung in der axonreichen zentralen Zone des Mikro-TENN ist wahrscheinlich eine Kombination von Puncta sowie Synapsin, die von Axonen zu vor-synaptischen Terminals transportiert werden. Dennoch deutet die Anwesenheit von Synapsin puncta innerhalb der Mikro-TENN-Aggregate darauf hin, dass diese Konstrukte die Fähigkeit haben, durch Synapsen zu kommunizieren, obwohl die Kolokalisierung von Synapsen mit einem post-synaptischen Protein für weitere strukturelle Nachweise von funktionellen Synapsen erforderlich wäre/ P>

Mikro-TENNs wurden auch mit aggregierten Neuronen hergestellt, die mit einem AAV, der den GCaMP6f-Calciumindikator enthielt, transduziert wurden, um die elektrophysiologischen Eigenschaften dieser Konstrukte vorläufig zu untersuchen. Diese Konstrukte drückten den Calciumindikator über ihre gesamte Länge aus, wie durch Fluoreszenz sowohl in den neuronalen Aggregaten als auch in den axonalen Traktaten gezeigt ( Fig. 7A ). Beachten Sie, dass aufgrund der Mikroskop-Einstellungen zur Maximierung der Intensität in den Aggregaten die Fluoreszenz in den axonalen Traktaten schwächer erschien. Diese transduzierten Mikro-TENNs wurden im Laufe der Zeit mit Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzmikroskopie (ohne externe elektrische Stimulation) analysiert und mehrere zellgroße Regionen von Interesse (ROIs) wurden zufällig in einem repräsentativen Mikro-TENN ausgewählt, um die Signalisierungskapazität dieser zu charakterisieren Konstrukte Calcium-Konzentrations-Bursts wurden in fast allen ROIs beobachtet, wie sich bei assDie fluktuierenden Fluoreszenzintensitäten im Laufe der Zeit (Abbildung 7B ). Insbesondere schienen verschiedene ROIs eine nahezu konstante Periodizität der Calciumkonzentration zu zeigen (Abbildung 7B ). Diese Calciumkonzentrationsänderungen werden als Ergebnis von spontanen, inhärenten Aktionspotentialen, Zellsignalisierung innerhalb einzelner Aggregate und / oder Signalisierung über Axone aus verschiedenen Aggregaten abgeleitet. Weitere Analysen sind erforderlich, um die elektrophysiologischen Eigenschaften von Neuronen und axonalen Traktaten innerhalb von Mikro-TENNs vollständig zu charakterisieren. Dennoch zeigen diese ersten Ergebnisse, dass Mikro-TENNs eine robuste endogene / baseline-elektrische Aktivität aufweisen.

Abbildung 3: Blaupausen der lasergeschnittenen Mikrospalten-Fertigungsvorrichtung und der 3D-gedruckten pyramidenförmigen Mikro-Well-Form für die Zellaggregation. ( A) - ( B ) Blaupause und Bild der unteren und oberen Hälften der zylindrischen Kanalanordnung, die zur Herstellung der Hydrogel-Mikrosäulen verwendet wurden. ( C ) Blaupause und Bild der Kappen, mit denen das Gerät zusammengehalten wird. Sowohl anterior als auch posterior Stücke teilen sich die gleichen Dimensionen. ( D ) Bild der zusammengesetzten Vorrichtung, die zur Herstellung der Mikrosäulen erforderlich ist. Nur die beiden Kappen und die untere Hälfte werden zusammen mit Schrauben in den unteren zwei Ausrichtungslöchern (links) geklemmt. Die gestrichelten Linien zeigen die Platzierung der Akupunkturnadeln durch die fünf Löcher auf jeder Kappe. Die flüssige Agarose wird der unteren Hälfte der Zylinder zugesetzt, und danach wird die obere Hälfte (rechts) auf die Vorrichtung gelegt, um die flüssige Agarose in Form zu formen. ( E ) Blaupause der 3D-bedruckten Formen zur Herstellung von PDMS-Mikro-Well-Arrays. ( F ) Bilder der 3D-bedruckten Form (links) und der PDMS-Mikro-Well-Arrays (rechts). Alle Maße sind in Milli Meter (mm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Beobachtung des axonalen Wachstums in Mikro-TENNS durch Phasenkontrast-Bildgebung von unidirektionalen und bidirektionalen Konstrukten als Funktion von Tagen in vitro . ( A ) Unidirektionale 2 mm lange Mikro-TENNs zeigen axonale Traktate, die sich fast die gesamte Länge der Mikrosäule um 5 DIV erstrecken. ( B ) Im Vergleich zu unidirektionalen Mikro-TENNs zeigen bidirektionale 2 mm Mikro-TENNs eine schnellere axonale Wachstumsrate. ( C ) Für 5 mm bidirektionale Mikro-TENNs belegen axonale Traktate die Länge der Mikrosäule bei 5 DIV. Diese Architektur wird mindestens bis 10 DIV gehalten. Maßstäbe = 200 μm/ftp_upload/55609/55609fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5: Micro-TENN-Cytoarchitektur, die mit konfokalen Bildern von immunoladierten unidirektionalen und bidirektionalen Mikro-TENNs beobachtet wurde. Die Zellen wurden für Zellkerne (Hoechst, Blau) und Axone (Tuj1; Rot) gefärbt. ( A ) Phasenkontrastbild eines 5 mm bidirektionalen Mikro-TENN (28 DIV). Konfokale Rekonstruktionen ( D ) - ( F ) und ( I ) - ( K ) eines 5 mm bidirektionalen (28 DIV) und eines unidirektionalen (25 DIV) Mikro-TENN zeigen markierte Zellkerne ( D ), ( I ) Und Axonen ( E ), ( J ) sowie die Auflage ( F ), ( K ). Maßstäbe: 500 μm. Einsätze in ( A F ) und ( K ) beziehen sich auf Phasenkontrast ( B ) - ( C ) und konfokale ( G ) - ( H ), ( L ) - ( M ) Zoom-Ins von neuronalen Aggregaten und axonalen Traktaten . Die Bilder zeigen die Aggregate, die auf die Enden des Mikro-TENN beschränkt sind, während das Lumen von ausgerichteten Axonaltrakten überspannt wird. Maßstäbe = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6: Expression des prä-synaptischen terminalen Proteins Synapsin I in einem repräsentativen bidirektionalen Mikro-TENN. Das Konstrukt wurde für Zellkerne (Hoechst, Blau), Axone (Tuj1, Rot) und prä-synaptische Boutons (synapsin I; grün) gefärbt. ( A ) Phase-contrAst Bild eines 2 mm bidirektionalen Mikro-TENN bei 28 DIV. ( D ) - ( G ) Konfokale Rekonstruktionen, die die Zellkerne ( D ), Axone ( E ), vor-synaptische Boutons ( F ) und eine Überlagerung ( G ) der drei Kanäle zeigen. Boxen zeigen die Zoom-Ins ( B ) - ( C ), ( H ) - ( I ) der Phasenkontrast- und Overlay-Bilder für die neuronalen Aggregate. Maßstäbe = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7: Spontane Signalisierungsaktivität in einem bidirektionalen Mikro-TENN, beobachtet durch die Expression eines genetisch codierten Calciumindikators. ( A ) FluoreszenzE-Mikroskopie bestätigte die Expression des GCaMP-Reporters, wie durch Fluoreszenz in den Aggregaten und Axonen beobachtet. Maßstab = 100 μm. ( B ) Fluoreszenzveränderungen, die mit Calciumkonzentrationsschwankungen assoziiert waren, wurden ohne externe Stimulation an verschiedenen interessierenden Regionen (ROIs) als Funktion der Zeit gemessen. Die nummerierten farbigen Kreise in ( A ) bezeichnen diese ROIs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 8: Phasenkontrastbilder von gängigen Ausfallarten in der Mikro-TENN-Methodik. ( A ) Eine vollständig dehydrierte / getrocknete Agarose-Mikrosäule als Ergebnis der Entfernung und / oder Verdampfung von DPBS in den Anfangsphasen der Herstellung. Maßstab = 5081; m. ( B ) Hydrogel-Mikrosäule mit dem Lumen, das die Außenwand des Konstrukts ausmacht, aufgrund der fehlenden konzentrischen Ausrichtung der Akupunkturnadel mit dem Kapillarrohr. Maßstab = 100 μm. ( C ) Seded micro-TENN mit beiden Aggregaten bei 1 DIV. ( D ) Eines der Aggregate fiel von der gleichen Mikrosäule wie ( C ) bei 3 DIV ab. ( E ) Unidirektionale Mikro-TENN bei 4 DIV. ( F ) Die aggregierten und axonalen Traktate fielen aus der Mikrosäule in ( E ) aus und blieben im Kulturmedium bei 5 DIV schwimmen. Maßstab für ( C ) - ( E ) = 300 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

ZNS-Verletzungen und Erkrankungen führen typischerweise zu einem Verlust oder einer Dysfunktion der Langstrecken-Axonalwege, die das Gehirn-Verbund umfassen, mit oder ohne begleitende neuronale Degeneration. Dies wird durch die begrenzte Kapazität des ZNS ergänzt, um die Neurogenese und Regeneration zu fördern. Trotz der Verfolgung von Reparaturstrategien wie Wachstumsfaktor, Zelle und Biomateriallieferung als einzelne oder kombinatorische Ansätze scheitern diese Techniken gleichzeitig sowohl für die Degeneration von neuronalen Zellen als auch für den Verlust der axonalen Verbindungen ^{14 , 22} . Diese Lücken in der Technik beschränken die Fähigkeit, neuronale Netze in einer kontrollierten und nachhaltigen Weise zu reparieren, zu verändern und zu untersuchen. Dementsprechend wurde die Mikro-TENN-Technologie entwickelt, um die Notwendigkeit einer neuronalen Reparaturstrategie zu bewältigen, die im Gegensatz zu bestehenden Methoden sowohl den neuronalen Ersatz als auch die Rekonstruktion von langen axonalen Verbindungen erleichtert. MicRo-TENNs sind implantierbare lebende Gerüste mit einer vorgeformten Cytoarchitektur, die sich den systembasierten Bausteinen des Gehirnverbundes nähert, die speziell für die gezielte Rekonstruktion, den Austausch und die Modifikation von Host-Neural-Schaltungen entwickelt wurden. Diese Gerüste bestehen aus diskreter Population (en) von Neuronen, die durch lange axonale Traktate innerhalb des ECM-haltigen Lumens von miniaturzylindrischen Agarose-Hydrogelen verbunden sind. Diese Konstrukte können in der Lage sein, als synaptische Relais zu funktionieren, um verlorene Wege zu ersetzen und dynamische native Schaltungen zu modulieren. Darüber hinaus können in Fällen von isolierter axonaler Degeneration (bei intuitiven Quellenneuronen) Mikro-TENNs als Leitfaden für die axonale Regeneration auf der Basis des Mechanismus der axon-erleichterten Axonregeneration dienen. Dieses Manuskript stellte das Fertigungsprotokoll vor, um zuverlässig Mikro-TENNs mit kontrollierter Geometrie, Phänotyp und Funktionsmerkmalen zu erzeugen. Phasenkontrastmikroskopie, ImmunzytochemiStry und konfokale Mikroskopie zeigten, dass mit dem Protokoll produzierte Mikro-TENNs die erforderliche Cytoarchitektur aufweisen und das prä-synaptische terminale Protein-Synapsen exprimieren. Weiterhin wurde gezeigt, dass Mikro-TENNs eine intrinsische Signalisierungsaktivität aufweisen, möglicherweise aufgrund von Aktionspotentialen, in Abwesenheit einer externen Simulation. Dies wurde durch die Anwesenheit von nahezu synchronen Fluktuationen in der Fluoreszenz, die mit einem genetisch codierten Calciumreporter verbunden sind, festgestellt.

Die Mikro-TENN-Entwicklung kann durch drei Schritte zusammengefasst werden: (1) die Herstellung des Hohl-Hydrogel-Röhrchens, (2) die Zugabe von ECM-Lösung zum Lumen des Röhrchens und (3) das Aussaat von Aggregaten isolierter Neuronen in die Enden der Tube. Die Mikrosäulen können mit Glas-Kapillarrohren oder mit einer mikrogefertigten Vorrichtung mit zylindrischen Kanälen hergestellt werden. Dieses Gerät kann mit jeder hochpräzisen Mikro-Fertigungsmethode für den Ermittler erstellt werden. FlüssigkeitAgarose wird in die Kanäle der Vorrichtung oder in Kapillarröhrchen gegossen, die eine zentrierte Akupunkturnadel enthalten, um die Hydrogel-Mikrosäulen zu erzeugen. Nach der Agarose-Gelierung wird die Akupunkturnadel entfernt, um das Hohllumen zu erzeugen. Mehrere häufige Fallstricke, die während der Herstellung oder des Wachstums auftreten, sind in Abbildung 8 hervorgehoben. Man beachte, daß einige der in Fig. 4 dargestellten Bilder und ein Extremfall in Fig . 8B den luminalen Teil prekär nahe an der Wand des Zylinders zeigen. Um bei Verwendung des Kapillarrohrverfahrens eine gleichmäßige Wanddicke zu erzielen, sollte die Rohrnadelanordnung aufrecht gehalten werden, wenn sie mit Agarose in Berührung gebracht wird, und die Nadel sollte in der Mitte des Rohres gehalten werden. Das Halten der Rohrnadelanordnung in einem Winkel relativ zur Agaroseoberfläche fördert die Dezentralisierung der Nadel. Trotzdem sind diese Vorsichtsmaßnahmen schwer zu implementieren, und die Nadel ist öfter als nicht stillG die Wände der Kapillarrohre. Im Gegenteil, der Hauptbestandteil der mikrogefertigten Vorrichtung besteht darin, daß sie Nadellöcher aufweist, die konzentrisch mit den zylindrischen Kanälen ausgerichtet sind, wodurch eine adäquate Zentralisierung der Nadel und des Lumens relativ zu dem Kanal bzw. der Mikrosäule gefördert wird. Darüber hinaus erhöht die Vorrichtung den Durchsatz, indem gleichzeitig die Herstellung mehrerer Mikrosäulen erleichtert wird. Trotz des von der Vorrichtung gelieferten Nutzens können auch nicht-mittlere Lumen mit Hilfe von gebogenen Akupunkturnadeln erzeugt werden. Mikro-Fertigungstechniken haben auch eine inhärente Toleranz, die ihre Wirksamkeit begrenzt. Im Allgemeinen sollte die Mikrosäulen-Dehydratation, für die ein Extremfall in Abbildung 8A gezeigt wird , kein Hindernis sein, wenn die im Protokoll enthaltenen Empfehlungen eingehalten werden. Beachten Sie, dass die physikalischen Eigenschaften der Agarose, die für äußere Umhüllung verwendet wird, eine Optimierung für alternative neuronale Subtypen benötigen, als verbesserte kortikale Neuronen sUrvival und Neuritenwachstum bei höheren (3-4%) gegenüber niedrigeren (1-2%) Agarosekonzentrationen wurde beobachtet ¹⁰ .

Die Mikro-TENN-Entwicklung setzt sich fort mit der Einführung von ECM in das Mikrosäulen-Lumen, das dazu dient, eine Umgebung bereitzustellen, die für die neuronale Adhäsion, das Überleben und das Auswachsen geeignet ist. Darüber hinaus beschränkt das ECM in Kombination mit der geometrischen Beschränkung und der geringen Porosität, die durch das Agarose-Hydrogel bereitgestellt wird, das axonale Wachstum in die Längsrichtung, um die erforderliche Architektur zu erzeugen. Der Inhalt der ECM-Lösung kann für die Art des verwendeten Neurons optimiert werden. Zum Beispiel fördert Kollagen allein das Überleben und das axonale Auswachsen in DRG-Mikro-TENNs, während eine Kombination von Kollagen und Laminin für kortikale Neuronen erforderlich ist ¹⁰ . Darüber hinaus ist die ECM-Polymerisation innerhalb der Mikrosäule vor der Zellplattierung kritisch, da die Co-Abgabe von Zellen mit unpolymerisiertem ECM zu vermindertem Neurit outgr führtOwth und faszikulation ³¹ Beachten Sie, dass, obwohl die Mikrosäule zunächst mit ECM-Lösung gefüllt ist, ihr Inhalt in ein weiches Gel polymerisiert und dazu neigt, sich während der Inkubationszeit zu kontrahieren, wodurch ein Raum geschaffen wird, der die Insertion der Zellaggregate ermöglicht. Darüber hinaus ist es wichtig zu bestätigen, dass das ECM in die Mikro-Säule Innenraum durch Inspektion unter dem Stereoskop eingegeben hat; Vollständige Abwesenheit und / oder Taschen von fehlenden ECM-Ergebnissen in einem Mangel an axonalen Auswuchs aus den Aggregaten. Die Mikro-TENN-Fertigung gipfelt in der Aussaat von kortikalen Neuronaggregaten an den Extremen des Gerüsts. Diese Neuronen wurden unter Verwendung bekannter Verfahren von Rattenfeten seziert. Es kann gefolgert werden, dass die Mehrheit der isolierten Zellen Neuronen sind, weil die embryonale Rattenrinde bei der zur Isolierung verwendeten Schwangerschaftszeit 99% Neuronen umfasst und das definierte Kulturmedium, das im Protokoll verwendet wird, metabolisch für die Gliaproliferation begrenzt ist ⁴⁹ Folglich sollte es eine minimale Glia-Kontamination geben, obwohl die Färbung für spezifische Marker zur Bestätigung erforderlich ist. Während dieses Manuskript die Mikro-TENN-Herstellung mit kortikalen Neuronen vorstellte, konnten Neuronen aus verschiedenen Hirnregionen ( z. B. nigral , thalamisch und hippocampal) oder mit verschiedenen Phänotypen ( z. B. exzitatorisch, inhibitorisch und dopaminergen) nach der gewünschten Anwendung verwendet werden Bereich der Implantation. Bisherige Iterationen des Mikro-TENN-Herstellungsprotokolls beinhalteten die Samen von dissoziierten Zellen ^{10 , 31 , 32} . Obwohl die gewünschte Cytoarchitektur nach dem dissoziierten Verfahren erhalten wurde, wurde es in allen Fällen nicht erreicht. In vielen Fällen überfluteten dissoziierte Zellen den Innenraum und führten zu mehreren Zellkörper-Clustern im gesamten Lumen, wobei Prozesse sie in einem umfangreichen 3D-Netzwerk verbindenRef "> 10 ^{, 31.} Die aggregierte Methode sorgt andererseits für die Eindämmung von Zellkörpern an den Extremen und ist daher ein integraler Bestandteil des Erfolgs der Mikro-TENN-Technologie (Abbildung 5 ). Die repräsentativen Mikro-TENNs wurden gezeigt In den Fig. 4-6 wurden mit größeren Aggregaten hergestellt, die nicht vollständig eingefügt wurden, und dies kann gelegentlich dazu führen, daß Aggregate aus den Mikrospalten in Kultur fallen, wie die in Fig. 8D und 8E gezeigten Beispiele. Um dies zu verhindern, können die Aggregate Vollständig in das Mikrosäulen-Interieur eingefügt werden.Wenn sich diese Situation auch nach der Anwendung der bisherigen Strategie präsentiert, kann die anfängliche Inkubationszeit verlängert werden, um genügend Zeit für die aggregierte Adhäsion an das ECM zu bieten. Während der Kultur ist die sanfte Handhabung von Mikro-TENNs Empfohlen, um die Integrität der Hydrogel-Umhüllung und der Cytoarchitektur zu bewahren, Probleme während der Mikro-TDie ENN-Manipulation ist die Ursache der in den ansonsten ausgerichteten axonalen Traktaten erhaltenen Krümmungen (Abbildung 5 ). Dennoch sollte nach dem in diesem Artikel vorgestellten Protokoll die konsistente Herstellung von Mikro-TENNs mit der erwarteten neuronalen / axonalen Architektur, der vor-synaptischen Boutonverteilung und der intrinsischen elektrischen Aktivität führen.

Trotz des Versprechens, dass Mikro-TENNs halten, gibt es noch herausragende Herausforderungen, die die Anwendungen dieser Technologie einschränken können. Die derzeitige Mikrosäulen-Fertigungstechnik wird durch die Dezentralisierung des Mikrosäulenlumens begrenzt, was zu einer inkonsistenten Darstellung von mechanischen Cues auf Zellen ( zB Steifheit), Zerreißen der Mikrosäulenwand und der nachfolgenden Exposition von Axonaltrakten führen kann Nach außen und Probleme bei der Implantation. Obwohl die Verwendung einer mikrogefertigten Vorrichtung das Ergebnis im Vergleich zu Kapillarröhren verbessert hat, wurde eine höhere Präzisions-Mikro-FabrikN-Techniken erforderlich sind, um die Dimensionsreproduzierbarkeit dieser Konstrukte zu erhöhen. Die Ergebnisse in diesem Manuskript zeigten, dass die Mikro-TENN-Methodik zuverlässig lebende Gerüste herstellen kann, die aus Neuronen und axonalen Traktaten bestehen, die der einheimischen Neuroanatomie ähneln, insbesondere den axonalen Traktaten, die unterschiedliche Hirnregionen verbinden. Dennoch ist die Mikro-TENN-Länge eine Hürde, abhängig von der Länge des Wirts-Axonalwegs, der ersetzt werden muss. Zum Beispiel sind Gewebe-Nerven-Transplantate (TENGs) eine separate lebende Gerüststrategie, die von unserer Forschergruppe genutzt wird, um extrem lange Nervenverletzungen zu reparieren. Um diese langen Lücken zu ersetzen, können die Axone in TENGs bis zu zehn Zentimeter verlängert werden, indem eine kontinuierliche mechanische Spannung in den kundenspezifischen Mechano-Bioreaktoren ^{1 , 23 , 50} angewendet ^wird . Diese "Stretch-Wachstum" -Technik wurde auch angewendet, um die astrozytische Prozesslänge zu betten zu manipulierenR imitieren die Struktur der radialen Gliawege ⁵¹ . Im Gegenteil, die vorliegende Mikro-TENN-Technologie bietet dieses Ausmaß der Kontrolle noch nicht an; Die maximal erreichbare Länge ist derzeit begrenzt, wie lange die axonalen Traktate in vitro auf der Grundlage einer traditionellen wachstumsvermittelten Erweiterung wachsen können. Darüber hinaus, obwohl das ZNS eine intrinsische Kapazität für die neurophysiologische Umverdrahtung als Reaktion auf verschiedene Reize hat und transplantierte Zellen die Fähigkeit haben, sich synaptisch mit nativen Schaltkreisen zu integrieren, ist eine weitere Einschränkung dieser Technologie, dass Mikro-TENNs auf die Plastizität des heimischen Gehirns angewiesen sind Und die Fähigkeit von Host-Netzwerken, sich funktionell mit dem implantierten Konstrukt ^{52 , 53 , 54 , 55} zu integrieren. Schließlich ist ein angeborener Mangel an allen Implantat-basierten Ansätzen wie Mikro-TENNs ihre Invasivität. Da neuronen sindIn der Regel in der Nähe von Kapillaren kann jede Art von chirurgischen Eingriffen eine Störung in der Blut-Hirn-Schranke, Leckage von Blutfaktoren in das Gehirn-Parenchym und eine akute (und sogar eine chronische) entzündliche Reaktion verursachen ³¹ . Diese Antwort kann Host- und Mikro-TENN-Neuronen beschädigen, was die vorteilhaften Aspekte dieser Technik negiert. Dennoch überlebten Mikro-TENNs, die in den Kortikothalamus-Weg der Ratten implantiert wurden, für mindestens 1 Monat und zeigten Hinweise auf eine strukturelle Integration mit dem Wirts-Hirnrinde ^{10 , 31} . Darüber hinaus präsentierte eine frühere Publikation aus unserer Forschungsgruppe eine Methodik, die die nadellose Implantation von Mikro-TENNs in Rattengehirn ermöglicht. In diesem Ansatz wurde diese Hydrogel-Umhüllungsstrategie um eine dünne (~ 20 μm) Beschichtung von Carboxymethylcellulose erweitert, die bei leichter Dehydratation eine ausreichende Steifigkeit zum Eindringen der Haut zeigteDas Gehirn ohne eine Nadel oder Führung ³¹ . Dieses nadellose Implantationsverfahren, gekoppelt mit dem kleinen Querschnitt der Mikrosäulen, sollte die Schädigung des Gehirns während und nach dem stereotaktischen Implantationsverfahren minimieren.

Trotz des vorläufigen Erfolgs von Mikro-TENNs in vivo müssen zukünftige Studien bestätigen, dass diese Konstrukte sich synaptisch mit nativem Gewebe integrieren und untersuchen, ob eine funktionelle Wiedergewinnung bei Modellen der ZNS-Verletzung und der neurodegenerativen Erkrankung ^{10 , 31} vorliegt. Beispielsweise können maßgeschneiderte Mikro-TENNs mit spezifischen Zell-Phänotypen entworfen und in den entsprechenden degenerierten Weg implantiert werden, um das Netzwerk zu rekonstruieren und die Funktion wiederherzustellen. Um die akute Entzündungsreaktion nach der Implantation zu reduzieren, kann die Mikro-TENN-Hydrogel-Schale mit entzündungshemmenden und überlebenden Mitteln dotiert sein. Alternative HerstellungTechniken ( zB 3D-Druck) können entwickelt werden, um die Hydrogel-Mikrosäulen mit größerer Leichtigkeit und mit präziseren Merkmalen, einschließlich der konsistenten Zentralisierung des Lumens und der Reproduzierbarkeit der Dimensionen, zu erzeugen. Das gleiche Biomaterial-Schema, das mit Mikro-TENNs verwendet wird, kann modifiziert werden, um andere charakteristische Pathologien von ZNS-Verletzungen und Krankheiten zu bekämpfen. Zum Beispiel hat unsere Gruppe zuvor Konstrukte entwickelt, die aus in Längsrichtung ausgerichteten astrozytischen Bündeln entlang des kollagenbeschichteten Lumens eines Agarose-Hydrogels bestehen, das die radialen Gliawege strukturell emuliert und die Glanzröhre zur Erleichterung der axonalen Regeneration und der neuronalen Migration ⁵⁶ . Zusätzlich können Stammzellen, wie menschliche embryonale Stammzellen (HESCs), induzierte pluripotenten Stammzellen (iPSCs) und adiposierte Stammzellen (ASCs) eingebaut werden, um autologe Mikro-TENNs auf einer Patienten-Basis zu mehr herzustellen Ähneln dem verlorenen Cytoarchitektur- und Zellphänotyp sehr. Diese futuRe-Modifikationen würden die Fähigkeit von Mikro-TENNs erhöhen, degenerierte Wege in vivo zu ersetzen und würden die Rekonstruktion von anspruchsvolleren Gewebearchitekturen ermöglichen, die unter anderem astrogliale Unterstützung und axonale Myelinisierung beinhalten. Genetisch entwickelte Neuronen könnten auch ausgesät werden, um entweder die regenerative Wirkung von Mikro-TENNs durch die Freisetzung von trophischen Faktoren zu verstärken oder die Modulation des ZNS durch die optogenetische Stimulation von lichtgesteuerten Ionenkanälen zu ermöglichen ⁴³ . Diese Gerüste können mit exzitatorischen oder hemmenden Neuronen hergestellt werden, um bestehende dysfunktionelle Wirtsverbindungen unter Bedingungen wie Epilepsie, Depression, Drogenabhängigkeit oder Schmerzstörungen synaptisch zu modulieren. Zum Beispiel können Mikro-TENNs, die überwiegend GABAergische oder glutamaterne Synapsen bilden, konstruiert werden, um durch synaptische Integration und / oder durch Massenneur zu unterdrücken oder zu stimulierenOtransmitterfreigabe Wichtig ist, dass solche in sich geschlossenen modulatorischen Konstrukte theoretisch auf der Grundlage von Host-Netzwerk-Feedback ¹ reagieren würden. Ebenso könnten Mikro-TENNs als Gehirn-Computer-Schnittstellen (BCIs) angewendet werden, wobei optogenetisch ausgearbeitete Mikro-TENNs als Zwischenprodukte zwischen dem Gehirn und anorganischen Stimulations- oder Aufzeichnungsgeräten dienen. Diese Anwendung kann eine Alternative zu Mikroelektroden-BCIs sein, denen kein spezifisches Zelle Targeting und mechanische Stabilität fehlt und entzündliche Reaktionen, gliale Narbenbildung und neuronale Migration oder Verlust verursacht haben, wenn sie in das Gehirn eindringen ^{57 , 58} .

Als In-vitro -Testbetten können Mikro-TENNs eine leistungsfähige Plattform für das Studium der Neurobiologie und Elektrophysiologie darstellen, die als biofidelische Modelle des Nervensystems dient. Darüber hinaus können 3D-Konstrukte als Testbetten für Behandlungsstrategien dienen, wenn sie als neuronale Verletzungen verwendet werdenIury und Krankheit Modelle ⁵⁹ . Als 3D-Konstrukte sind Mikro-TENNs in der Lage, die in vivo- Umgebung zu simulieren, die durch komplexe Zellzell- und Zell-ECM-Wechselwirkungen in allen Raumrichtungen charakterisiert ist, die in den planaren Kulturen ^{42 , 60 , 61 , 62 , 63} nicht genau dargestellt werden können ^{, 64 , 65} . In der Tat haben zahlreiche Untersuchungen festgestellt, dass die Art der Umgebung für die Zellen kritisch ist, um die Morphologie, die Proliferation, die Migration, die Genexpression, die Differenzierung und die Signalisierung in der nativen Umgebung zu präsentieren. Die Ähnlichkeiten zwischen der 3D-Umgebung dieser Gerüste und dem Gehirn selbst werden durch den Grad der Kontrolle ergänzt, den diese Konstrukte über ihre physikalischen und biochemischen pr bietenRäume ⁴² . Dies ermöglicht die Konstruktion von Mikro-TENNs mit verschiedenen Sätzen von mechanischen, haptotaxischen und chemotaxischen Signalen, um die Wirkung dieser Cues einzeln oder synergistisch auf das neuronale Überleben, die Reifung, die axonale Extension, die Synaptogenese und die Mechanotransduktion ^{32 , 42 , 63 zu} untersuchen. Darüber hinaus erlaubt die Gestaltungsflexibilität dieser mikrogewebetechnischen Technik den Bau von lebenden Gerüsten, die andere Merkmale des Hirngewebes nachahmen, wie die säulenförmige, kompartimentierte Struktur des Neokortex, die von den axonalen Traktaten des Verbundes überspannt ist, um weiter zu vergrößern Macht dieses Systems als In-vitro- Plattform, um das Gehirn zu studieren ⁶⁵ . Als Untersuchungsplattformen nutzen die Mikro-TENNs die kontrollierte Einstellung typischer In-vitro- Modelle, die expansive Verfügbarkeit von Designparametern im Gewebe enGineering-Ansätze und die erhöhte physiologisch-pathophysiologische Relevanz von 3D-Plattformen zu einem idealen Test-Bett, um neurobiologisches Wissen voranzutreiben. Die unzählige Zukunft für diese Technologie verkörpert die Vielseitigkeit von Mikro-TENNs. Dieses Manuskript hat gezeigt, dass das Mikro-TENN-Protokoll zuverlässig Gewebe-konstruierte lebende Gerüste produzieren kann, die wichtige Merkmale der Hirnneuroanatomie nachahmen, um neue Einblicke in neurobiologische Phänomene, einschließlich Entwicklung, Krankheit und Reparaturprozesse, zu bieten. Diese Konstrukte können auch synaptisch mit nativem Gewebe integrieren, um beschädigte Stoffe der weißen Substanz zu rekonstruieren, verlorene neuronale Zellen zu ersetzen und dysregulierte Wege nach ZNS-Verletzungen und Krankheiten zu modulieren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser cutter	Universal Laser Systems	PLS4.75	Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.
Laser-cut micro-column fabrication device	Custom-made	--------------	Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Screws	--------------	--------------	#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Nuts	--------------	--------------	#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Acupuncture needle (180 µm diameter)	Lhasa Medical	sj.16X40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Capillary tube (398 µm diameter)	Fisher	21170D	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N	Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Mouse laminin	Corning	354232	Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Neurobasal medium	Invitrogen	21103049	Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 Supplement	Invitrogen	12587010	Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Objet30 3D-Printer	Stratasys	--------------	Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.
3D-printed pyramidal well mold	Custom-made	--------------	Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent	Fisher	NC9285739	Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.
Funnel	Fisher	10-348C
1 ml pipette bulb	Sigma	Z509035
Micro-spatula	Fisher	S50821
12-well culture plate	EMESCO	1194-353043
Oven	Fisher	11-475-154
Incubator	Fisher	13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	UPenn Vector Core	36373	Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Triton X-100	Sigma	T8787	Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.
Horse serum	Gibco	16050-122
Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody	Sigma	T8578-200UL	Store at -20ºC.
Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody	Synaptic Systems	106-001	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC.  Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.  Therefore, it must be disposed of in a separate container.
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	--------------	Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon	--------------	Used for taking the phase-contrast images.  With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).
High-speed Fluorescence Microscope	Nikon	--------------	Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.
NIS Elements AR 4.50.00 Software	Nikon Instruments	--------------	Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope.