Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לבחון את היכולת של חלבון לשיתוף משקעים עם אקטין filamentous (F- אקטין), ואם מחייב הוא ציין, כדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה.
Abstract
אקטין אקטין (F- אקטין) ארגון בתוך תאים מוסדר על ידי מספר רב של חלבונים אקטין מחייב השולטים אקטין נוקלאציה, צמיחה, חוצה קישור ו / או פירוק. פרוטוקול זה מתאר טכניקה - אקטין שיתוף שקיעה, או גלולה, assay - כדי לקבוע אם חלבונים או חלבון תחום נקשר F- אקטין וכדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה ( כלומר, שיווי המשקל דיסוציאציה קבוע). בטכניקה זו, חלבון של עניין מודגרת הראשונה עם F- אקטין בפתרון. ואז, צנטריפוגה דיפרנציאלי משמש משקעים את החוטים אקטין, ואת החומר גלולה מנותח על ידי SDS-PAGE. אם חלבון של עניין נקשר F- אקטין, זה יהיה שיתוף משקעים עם חוטים אקטין. את המוצרים של התגובה מחייב ( כלומר, F- אקטין וחלבון של עניין) ניתן לכמת כדי לקבוע את הזיקה של האינטראקציה. אקטין pelleting assay היא טכניקה פשוטה לקביעתאם חלבון של עניין נקשר F-actin ולהעריך כיצד שינויים חלבון זה, כגון קשירת ליגנד, להשפיע על האינטראקציה שלה עם F- אקטין.
Introduction
אקטין הוא חלבון cytoskeletal חיוני אשר ממלא תפקיד קריטי בתהליכים סלולריים מרובים, כולל תנועתיות, התכווצות, הדבקה, מורפולוגיה 1 . אקטין קיים בשתי צורות: אקטין כדורית מונומריקית (G- אקטין) ו actin נימול polymerized (F- אקטין). בתוך התאים, F- אקטין הארגון נשלט על ידי אוסף גדול של חלבונים המווסתים את נוקלאציה, צמיחה, cross-linking, ופירוק של חוטים אקטין 2 , 3 , 4 . עם זאת, כמה מרובות אקטין מחייב תפקוד בתיאום כדי להסדיר ארגון רשת אקטין עדיין לא ברור במידה רבה.
מדידת האינטראקציות בין חלבונים לחלבון היא גישה חשובה להבנה כיצד חלבונים מפעילים את השפעתם על ההתנהגות הסלולרית ברמה הביוכימית. מבחני רבים יכולים לשמש כדי לזהות אינטראקציות בין חלבונים מטוהרים.גישות נפוצות עבור חלבונים מסיסים כוללים משיכות, קיטוב פלואורסצנציה, calorimetry טיטרציה איזותרמית, תהודה פלסמון פני השטח. חשוב לציין, כל מבחני אלה דורשים חלבונים להיות מסיסים, ולכן הם קשים להסתגל לשימוש עם חלבון פילמנטי, פילמנטי כגון F- אקטין. כאן, אנו מתארים טכניקה - אקטין שיתוף שקיעה, או גלולה, assay - כדי לקבוע אם חלבון או חלבון תחום נקשר F- אקטין וכדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה.
אקטין pelleting assay היא טכניקה פשוטה יחסית שאינה דורשת ציוד מיוחד, מלבד ultracentrifuge. כל ריאגנטים יכול להיעשות, בהנחה של ידע ביוכימיה בסיסית, או לרכוש. לאחר מחייב F- אקטין הוקמה, assay ניתן להשתמש כדי למדוד את הזיקה לכאורה ( כלומר, שיווי המשקל דיסוציאציה קבוע) 5 . כמו כן, ברגע זיקה היא הוקמה, assay pelletingהוא כלי שימושי כדי למדוד כיצד שינויים החלבון של עניין ( כלומר , שינויים לאחר translational, מוטציות, או ליגנד מחייב) להשפיע על האינטראקציה שלה עם F-actin 6 . טכניקה יש מגבלות (ראה דיון ) כי החוקר צריך להיות מודע לפני שתנסה assay.
Protocol
1. הכינו את החומרים
- לטהר את החלבון של עניין (ראה סעיף 2).
- הכן או קנה G-actin.
הערה: G- אקטין יכול להיות מבודד ממקורות מרובים 1 ; לחלופין, ניתן לרכוש אותו. אקטין G מחדש (ב 5 מ"מ טריס pH 8.0, 0.2 מ"מ m CaCl 2 , 0.2 מ"מ ATP (טריפוספט אדנוזין), ו 0.5 mith dithiothreitol (DTT)) צריך להיות קפוא פלאש, מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס ו> 10 מ"ג / מ"ל ב aliquots קטן (10-20 μL), והפשרה ממש לפני השימוש. G-actin aliquots לא צריך להיות refrozen. - הכן או לרכוש חלבון שליטה, כגון BSA (ראה שלב 4.4).
- הכנת 10x חיץ פילמור (200 מ"מ imidazole pH 7.0, 1 M KCl, 20 מ"מ MgCl 2 , 5 מ"מ ATP, ו 10 מ"מ EGTA (אתילן גליקול ביס (β-aminoethyl אתר) -N, N, N, חומצה tetraacetic)). הפוך את המניה 10x ולהתאים את ה- pH לאחר תוספת של ה- ATP, במידת הצורך. Aliquot (25 μL הוא נפח שימושי) ולאחסן ב -80 & #176;
- הכן חיץ תגובה 10x (200 מ"מ imidazole pH 7.0, 1.5 M NaCl, 20 מ"מ MgCl 2 , 5 מ"מ ATP, ו 10 מ"מ EGTA). הפוך את המניה 10x ולהתאים את ה- pH לאחר תוספת של ה- ATP, במידת הצורך. Aliquot (50-100 μL הוא נפח שימושי) ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
הערה: ההרכב של חיץ התגובה הוא גמיש וייתכן שיהיה צורך לכוונן את משקעי הרקע, להגביל את החיבור הלא ספציפי ו / או לשפר את הכריכה (צעדים 1.5.1-1.5.3).- התאם את ה- pH של חיץ התגובה בין 6 ל 8 כדי לייעל את יציבות החלבון. ב pH נמוך או גבוה יותר, תחליף מאגר מתאים עבור imidazole.
הערה: השתמש ב- pH 7.0 כנקודת התחלה, אלא אם כן חלבון מחייב pH נמוך או גבוה יותר ליציבות. אין להשתמש במאגר עם pH מתחת 6.0 או גבוה מ 8.0, כמו זה עלול לשבש את האקטין. מומלץ buffers (ריכוז סופי pH אופטימלי המפורטים) כוללים: 20 מ"מ MOPS (3- ( N- morpholino) חומצה propanesulfonic), pH6.5 3,000; 20 מ"מ imidazole, pH = 7.0; 10 מ"מ HEPES (4- (2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic חומצה), pH = 7.5; ו -20 מ"מ טריס, pH = 8.0. - שונה ריכוז המלח של חיץ התגובה, בהתאם לצרכים של assay.
הערה: אקטין הוא חלבון חומצי, וכמעט כל חלבונים אקטין מחייב להסתמך במידה מסוימת על אינטראקציות אלקטרוסטטיות כדי לקשר עם אקטין. לכן, הגדלת ריכוז המלח מקטין את האקטין מחייב ברוב המקרים. המאגר התגובה משתמשת ברמה הפיזיולוגית של מלח (150 מ"מ NaCl, ריכוז העבודה), וזה נקודת המוצא המומלצת. במידת הצורך, ריכוז מלח ניתן להוריד ( למשל, כדי 100 מ"מ) כדי לקדם מחייב או מוגברת להגביל את הגבול. - אל תשנה את ריכוזי MgCl 2 , ATP או EGTA במאגר התגובה, אלא אם כן יש סיבה ספציפית לעשות זאת.
- התאם את ה- pH של חיץ התגובה בין 6 ל 8 כדי לייעל את יציבות החלבון. ב pH נמוך או גבוה יותר, תחליף מאגר מתאים עבור imidazole.
2. הכן את Protein מבחן עבור Assay
- הכנהEa חלבון טוהר גבוהה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית לקבלת התוצאות הטובות ביותר 7 .
הערה: אם משתמשים בחלבון רקומביננטי, יש להסיר את תגי החלבון הגדולים, כגון גלוטתיון-S-transferase (GST) על-ידי חשיפת פרוטאז מחלבון המטרה, שכן הם עלולים להפריע לקשר. GST גם גורם homodimerization של חלבונים היתוך, אשר יכול להגדיל באופן מלאכותי את הזיקה של אקטין מחייב. - לקבוע את ריכוז החלבון על ידי מדידת ספיגה ב 280 ננומטר. מחלקים לפי מקדם הכחדה; את מקדם הכחדה ניתן לחשב מתוך רצף החלבון באמצעות ניתוח רצף או כלים מקוונים. לחלופין, לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות Bradford או BCA (חומצה bicinchoninic) שיטות.
הערה: עבור ניסויים ראשוניים, 50-100 μL של חלבון ב 20-40 מיקרומטר הוא בדרך כלל מספיק. זה יאפשר ניתוח של מחייב בטווח micromolar נמוך, נקודת התחלה שימושית עבור רוב חלבונים actin מחייב. קוואן גדול יותרלעיתים קרובות יש צורך בריכוז גבוה יותר של חלבון כדי ליצור עקומה מחייבת לחישוב הזיקה (ראה סעיף 5). - ממש לפני השימוש, קשה לסובב את החלבון (50,000-100,000 XG במשך 10 דקות על 4 מעלות צלזיוס) כדי להסיר את אגרגטים של חלבון מסיס. אם מסיסות היא דאגה, למדוד מחדש את ריכוז החלבון (שלב 2.2) לאחר צנטריפוגה.
3. הכינו את F- אקטין
- הסר aliquot של G- אקטין מ -80 מעלות צלזיוס מקפיא להפשיר אותו במהירות.
- הוסף את חיץ פילמור 10x ל- G- אקטין לריכוז סופי של 1x. ודא ריכוז G- אקטין במאגר פילמור 1x הוא לפחות 10-20 מיקרומטר, הרבה מעל הריכוז הקריטי. דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר (RT) כדי לאפשר את האקטין כדי לפלמר.
- לאחר פילמור, לאחסן את F- אקטין בפתרון ב 4 ° C, שם זה יהיה יציב במשך כמה שבועות. לפני השימוש ב- F- אקטין שוב לאחר אחסון, הפוך בעדינותאו קפיצי הצינור כמה פעמים כדי להבטיח כי כל אקטין הוא מומס באופן אחיד בפתרון.
הערה: (אופציונלי) הוסף phalloidin כדי להשיג יחס של 1: 1 טוחנת של G-actin: phalloidin. דגירה של 30 דקות ב RT כדי לאפשר את phalloidin לאגד ל- F- אקטין. Phalloidin מייצב F- אקטין ומשיג שני דברים: (i) זה מפחית את כמות אקטין זה לא משקעים במהלך צנטריפוגה ו (ב) הוא מאפשר F- אקטין להיות מדולל מתחת לריכוז קריטי (~ 0.5 מיקרומטר), אשר לעתים קרובות הכרחי אם משתנה כמות F- אקטין כדי ליצור עקומה מחייב (ראה סעיף 5 על מדידת הזיקה).
4. Pletlet Assay - פרוטוקול בסיסי
הערה: הפרוטוקול הבסיסי המתואר בסעיף 4 משמש כדי לקבוע אם חלבון של עניין שיתוף משקעים עם F- אקטין. לאחר הכריכה ל- F-actin, ניתן למדוד את זיקה של אינטראקציה זו בהתאם לפרוטוקול המתואר בסעיף 5.
- הכן את המאגר התגובה ביום השימוש על ידי דילול המניות 10x ל 1x ולהוסיף DTT לריכוז סופי של 1 מ"מ.
הערה: (אופציונלי) הוסף polidocanol לריכוז עובד הסופי של 0.02% במאגר התגובה. Polidocanol הוא פעילי שטח הפחתת מחייב רקע לא ספציפי ומסייע למנוע חלבונים הידרופובי מ דבק צינור ultracentrifuge. - לדלל את החלבון של עניין לריכוזים הרצוי במאגר התגובה 1x צינורות ultracentrifuge. שמור על כרכים מדגם נמוך (40-60 μL) כדי למנוע שימוש בכמויות גדולות של חלבון באמצעות צינורות ultracentrifuge עם כרכים מינימלי קטן ( למשל , צינורות 7 x 20 מ"מ מחזיקים 0.2 מ"ל כל אחד).
הערה: מאז רבים אקטין מחייב חלבונים יש זיקה ל- F- אקטין בטווח micromolar, בדיקות חלבון של עניין ב 2 ו 10 מיקרומטר מומלץ. אם מחייב לא נצפתה ב 10 מיקרומטר, אין זה סביר כי מחייב ייראה בריכוזים גבוהים יותר. אםהוסיף חלבון עושה יותר מ 10-20% של נפח התגובה הסופית, ייתכן שיהיה צורך dialyze את החלבון למאגר התגובה לפני ביצוע הניסוי. - הוסף F- אקטין לריכוז הסופי הרצוי.
הערה: 2 מיקרומטר הוא ריכוז שימושי עבור ניסויים ראשוניים כי זה הרבה מעל הריכוז הקריטי, ובכך שמירה על אקטין במצב נימי זה יהיה לייצר גלולה גלוי כאשר ניתח על ידי SDS-PAGE (צעד 4.10). - הכן את הפקדים הבאים צינורות ultracentrifuge לעשות את assay אינפורמטיבי.
- הכן מדגם (ים) המכיל את החלבון של עניין ללא F-actin. ודא כי ריכוז חלבון בדגימות אלה תואם את הריכוז של "פלוס F- אקטין" דגימות.
הערה: דגימות אלה יקבעו את כמות החלבון כי הוא מצטבר או תקוע לצדדים של הצינור ultracentrifuge בהעדר F- אקטין. - הכן דגימות בקרה שליליתבאותו ריכוז זהה או דומה (ים) המשמש החלבון של עניין. השתמש בחלבון שליטה שאינה קשורה ל- F-actin, עם או בלי אקטין.
הערה: זוהי שליטה חשובה כי חלבונים יכולים להיות "לכודים" ב חוטים actin ו גלולה עם F- אקטין, למרות שהם לא לאגד F- אקטין. כמות השמנה יכול להשתנות בהתאם המקור F- אקטין, תנאי חיץ, וכו ' לכן, שליטה זו צריכה להיכלל כל הניסויים. באופן אידיאלי, חלבון הבקרה צריך להיות משקל מולקולרי דומה חלבון של עניין ( למשל , עבור αE-catenin (~ 100 kDa), BSA (66 kDa) היא שליטה נאותה). סטנדרטים סינון ג'ל זמין מסחרי להפוך חלבונים שליטה מעולה, שכן הם מכסים מגוון של גדלים נוטים לא מכילים אגרגטים. - לחלופין, להכין דגימות בקרה חיובית המכיל חלבון שקושר F- אקטין, עם וללא אקטין F. ודא כי ריכוז (ים) דומים לאלה שלחלבון של עניין.
הערה: שליטה זו שימושית בכך שהיא מוכיחה כי תנאי הניסוי ( למשל, מוכן F- אקטין, חיץ התגובה, צנטריפוגה) היתר F- אקטין. מאז assay peling יכול להיכשל כדי לזהות חלש F- אקטין אינטראקציות (ראה דיון), מומלץ כי ידוע F- אקטין חלבון מחייב יש זיקה בינונית עד חלשה עבור F- אקטין ( כלומר, בטווח מיקרומטר נמוך ). מטוהרים F- אקטין חלבונים מחייב זמינים מסחרית.
- הכן מדגם (ים) המכיל את החלבון של עניין ללא F-actin. ודא כי ריכוז חלבון בדגימות אלה תואם את הריכוז של "פלוס F- אקטין" דגימות.
- לדגור את כל הדגימות למשך 30 דקות ב RT.
הערה: פעמים הדגירה ארוכה בסדר, בהנחה כי חלבון העניין הוא יציב, אם כי סביר מיותר. אם החלבון של עניין אינו יציב ב RT, ואז דגימות ניתן מודגרות על 4 מעלות צלזיוס. במקרה זה, פעמים הדגירה ארוך עשוי להיות נחוץ. - טען את הדגימות לתוך הרוטור צנטריפוגות. מקמו את הצינורות בתוך הרוטור כדי לסייע resuspending גלולה לאחר צנטריפוגה.לשם כך, לסמן את כל צנטריפוגות צינורות ( למשל, עם מספר לדוגמה) ומקום כל צינורות הרוטור באותו מיקום ( למשל, מספר פונה החוצה).
- צנטריפוגה ב XG 100,000 במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ב ultracentrifuge.
- לאחר צנטריפוגה, להסיר 3/4 של supernatant ( למשל , 45 μL אם נפח החל היה 60 μL) מכל צינור אחד ומערבבים עם כרכים 1/3 של חיץ מדגם 4x (15 μL במקרה זה) בצינור microcentrifuge נפרד.
- הסר את supernatant הנותרים עם טיפ ג'ל לטעון, נזהר לא להפריע גלולה (אשר עשוי להיות גלוי כנקודה מזכוכית).
הערה: חשוב להסיר את supernatant מן הצינורות בהקדם האפשרי לאחר השלמת הצנטריפוגה לרוץ להגביל את ההפרדה שלאחר הניתוק חלבון. כמו כן, לא לשטוף את גלולה עם חיץ התגובה מאותה סיבה.
- הסר את supernatant הנותרים עם טיפ ג'ל לטעון, נזהר לא להפריע גלולה (אשר עשוי להיות גלוי כנקודה מזכוכית).
- הוסף 4/3 כרכים של מאגר 1x המדגם לכל pelleT ( למשל , 80 μL אם נפח החל היה 60 μL).
הערה: זה עושה את הדילול זהה עבור supernatant (שלב 4.8, 1/3 כרכים של חיץ מדגם 4x נוספו), המאפשר השוואה ישירה בין גלולה דגימות supernatant וקביעת אחוז חלבון זה היה pelleted.- הוסף חיץ מדגם לכל צינורות דגירה של לפחות 5 דקות ב RT. אפשר גלולה לשבת במאגר המדגם כדי לשפר את התאוששות המדגם.
- Triturate המדגם 8-10 פעמים עם קצה פיפטה p200 כדי resuspended גלולה על ידי רצוף כביסה אזור גלולה של הצינור. בעדינות לגרד את קצה פיפטה על גלולה במהלך טחינה דקה כדי לעזור עם resuspension.
הערה: יש להקפיד להימנע מהכנסת אוויר לתוך המדגם במהלך טחינה דקה, כמו זה יגרום למאגר המדגם כדי הבועה ואת תפחית התאוששות המדגם. - מעבירים את הדגימות resuspended צינורות microfuge לאחר טחינה. </ Ol>
- ניתוח דגימות supernatant ו גלולה על ידי SDS-PAGE ו Coomassie מכתים 8 על ידי טעינת 10-15 μL של מדגם לנתיב; זה מספיק כדי לדמיין את החלבונים.
הערה: חלבונים כי שיתוף משקעים עם F- אקטין יהיה מועשר "פלוס F- אקטין" דגימות גלולה מעל "לא F- אקטין" גלולות דגימות ( איור 1 א ). מכתים סטנדרטי כחול קומסי מספיק לזיהוי אם ריכוז החלבון בטווח 0.1-10 מיקרומטר. Colloidal Coomassie 9 או המערבי סופג ניתן להשתמש כדי להגדיל את הרגישות אם ריכוז חלבון נמוך משמשים למדוד אינטראקציות זיקה גבוהה יותר. - תמונה ג'ל מוכתמת באמצעות סורק או סורק מערכת הדמיה (שלב 5.12).
5. Pletlet Assay - כימות
הערה: אם מחייב ספציפית F- אקטין הוא ציין, זה יכול להיות שימושי כדי למדוד את הזיקה של tהוא אינטראקציה. הדבר נעשה על ידי ביצוע מספר שינויים ותוספות לפרוטוקול המתואר בסעיף 4. לקבלת מדריך מצוין לתכנון ולפרשנות של מבחנים מחייבים, ראה פולארד 10 . תרשים זרימה ( איור 2 ) מסופק לסיוע בניתוח וכימות.
- לקבוע את טווח הריכוז כדי לבדוק.
הערה: טווח הריכוז יהיה תלוי בחלבון צריך להקיף ריכוז מתחת K לכאורה D ( למשל, 1 מיקרומטר) לריכוזים גבוהים מספיק כדי להרוות מחייב. זה קריטי כי מחייב מגיע הרוויה במספר דגימות בקצה הגבוה של טווח ריכוז ליצור עקומת מחייב מדויק ( איור 1 ג ). כפי שצוין לעיל, אקטין מחייב רבים חלבונים יש זיקה ל- F- אקטין בטווח micromolar נמוך (1-5 מיקרומטר). עבור חלבון עם K ד של 0.5-1 מיקרומטר, טווח ריכוז מתחיל שימושי יהיה 0.1-10 מיקרומטר. - קשה ספין (שלב 2.3) חלבון של עניין להסיר אגרגטים. סדרתי לדלל את החלבון לעשות סדרה ריכוז המכיל 7-8 דגימות ב 2x הריכוז הסופי להיבדק. לדוגמה, אם טווח הבדיקה היא 0.1-8 מיקרומטר, להכין את הדילולים הבאים במאגר התגובה 1x: 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.2 מיקרומטר.
הערה: כפי שצוין בשלב 4.2, אם חלבון נוסף מהווה יותר מ 10% -20% של הדילול הראשון (מדגם 16 מיקרומטר בדוגמה לעיל), ייתכן שיהיה צורך גם לרכז את החלבון יותר או dialyze את חלבון למאגר התגובה 1x. הקפד להכין מספיק דילול עבור כל "פלוס F- אקטין" ו "לא F- אקטין" דגימות. - הכנת דגימות (כמו בסעיף 4), על ידי דילול החלבון של עניין לריכוזים הרצוי במאגר התגובה 1x צינורות ultracentrifuge. שמור על כרכים מדגם נמוך (40-60 μL) כדי למנוע שימוש בכמויות גדולות של חלבון באמצעות ultracentצינורות שפופרת עם כרכים מינימלי קטן ( למשל , 7 x 20 מ"מ צינורות המחזיקים 0.2 מ"ל כל אחד).
- הוסף F- אקטין לריכוז הסופי הרצוי לדגימות המתאימות להעלות את עוצמת הקול באמצעות חיץ התגובה 1x. לדוגמה, עבור 50 μL תגובות באמצעות 2 מיקרומטר F- אקטין, להבטיח כי כל מדגם יש 25 μL של חלבון 2x, 10 μL של 10 מיקרומטר F- אקטין, ו 15 μL של חיץ התגובה 1x. כלול דגימות בקרה (שלבים 4.4.2 ו 4.4.3).
הערה: עבור בקרות שליליות וחיוביות, להשתמש בריכוז אחד בטווח כדי להיבדק (שלב 5.1), אידיאלי ליד באמצע עד סוף גבוה של טווח ( למשל, 4 מיקרומטר אם טווח הריכוז הוא 0.1-10 מיקרומטר).
- הוסף F- אקטין לריכוז הסופי הרצוי לדגימות המתאימות להעלות את עוצמת הקול באמצעות חיץ התגובה 1x. לדוגמה, עבור 50 μL תגובות באמצעות 2 מיקרומטר F- אקטין, להבטיח כי כל מדגם יש 25 μL של חלבון 2x, 10 μL של 10 מיקרומטר F- אקטין, ו 15 μL של חיץ התגובה 1x. כלול דגימות בקרה (שלבים 4.4.2 ו 4.4.3).
- לדגור את כל הדגימות למשך 30 דקות ב RT.
- לאחר 30 דקות, להסיר 1/5 של כל מדגם ( למשל, 10 μL של תגובה 50 μL) ומערבבים עם 20 μL של מים 10 μL של חיץ מדגם 4x.
הערה: אלה הם סך הכלAmples וישמש ליצירת עקומה סטנדרטית. - טען את דגימות לתוך הרוטור ultracentrifuge. צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 100,000 xg ו 4 ° C.
- לחלופין, לאחר צנטריפוגה, להסיר 3/4 של supernatant ( למשל, 30 μL אם נפח centrifuged היה 40 μL) מכל צינור ומערבבים עם חיץ מדגם 4x (10 μL במקרה זה) בצינור microfuge נפרד. הסר את supernatant הנותרים עם טיפ ג'ל לטעון, נזהר לא להפריע גלולה.
הערה: בעת מדידת זיקה מחייב, אין צורך להפעיל את supernatant. עם זאת, זה יכול להיות שימושי כדי להציל את supernatant, במיוחד כאשר בודקים חלבון חדש. - הסר את supernatant אם לא ניתוח (שלב 5.7).
- Resuspend גלולה בנפח 1 של חיץ מדגם 1x ( למשל, 40 μL אם נפח centrifuged היה 40 μL).
- הוסף חיץ מדגם לכל צינורות דגירה של לפחות 5 דקות ב RT.
- TrIturate המדגם 8-10 פעמים עם קצה פיפטה p200, הרף כביסה אזור גלולה של הצינור. בעדינות לגרד את קצה פיפטה על גלולה במהלך טחינה דקה כדי לעזור עם resuspension.
- מעבירים את החלב resuspended לצינור microcentrifuge.
הערה: אלה הן דוגמאות "גלולה". - לנתח את דגימות סה כ ו גלולה על ידי SDS-PAGE 8 . הפעל את כל הדגימות על ג'ל אחד במידת האפשר; אם לא, להפעיל את דגימות גלולה על ג'ל אחד ואת הדגימות הכולל על השני.
הערה: בהתחשב במספר הדגימות, מערכת ג 'ל גדול מומלץ לניתוח. אם פועל דגימות על שני ג'לים או יותר, חשוב כי כל ג'לים להיות מוכתמים באופן זהה ( כלומר, פתרון קומסי זהה באותו זמן כתם / destain). - Image ג'ומלים מוכתמים של קומאסי באמצעות מערכת הדמיה אשר מודד את עוצמות הלהקה חלבון על פני רחב ( כלומר, שניים עד שלושה יומן) ואת טווח ליניארי. ודא כי התמונות אמחדש שנאספו ללא פיקסלים רוויים.
הערה: מערכות הדמיה מבוססות לייזר מציעות את הרגישות הטובה ביותר ואת יחסי האות לרעש. - באמצעות ImageJ או תוכנית ניתוח דומה, למדוד את עוצמת הלהקה חלבון ולחשב את כמות החלבון מחויב.
הערה: עבור כל מדידות המדגם, השתמש בכלי הבחירה ב- ImageJ כדי לצייר אזור של עניין (ROI) סביב כל פס ולמדוד (Analyse> Measure) את האזור ואת הערך האפור הממוצע. לחשב את הרקע עבור כל ג'ל על ידי מדידת הערך האפור הממוצע מאזור ללא מדגם. הפחת את הערך האפור הממוצע הרקע מכל ROI פירושו ערך אפור ולאחר מכן להכפיל את האזור כדי לקבל את הערך צפיפות משולבת עבור כל הלהקה.- למדוד את החלבון של עוצמות הלהקה עניין מן הדגימות סה"כ ( איור 2 א ).
- יצירת עקומה סטנדרטית על ידי זומם את עוצמת הלהקה ( כלומר, מדידות צפיפות משולבת) לעומת מסת חלבון ( איור2 ב).
- למדוד את כמות החלבון של עניין זה שיתוף sedimented עם F- אקטין (Co-sedimented חלבון, איור 2 ג ).
- למדוד את כמות החלבון עניין כי sedimented בהעדר F- אקטין (שקיעה ברקע, איור 2 ד ).
- הפחת את שקיעת הרקע מן החלבון המשולב ( כלומר, להפחית את הערכים משלב 5.13.4 משלב 5.13.3) כדי לקבוע את כמות החלבון שקשור ל- F-actin.
- למדוד את כמות F- אקטין בכל גלולה ( איור 2E ). לקבוע את הכמות הממוצעת של F- אקטין לכל מדגם ולאחר מכן לחלק את כל המדגם על ידי הממוצע כדי לקבוע את היחס של F- אקטין בכל מדגם יחסית לממוצע ( כלומר, המספרים מתחת להקות).
- עבור כל מדגם, לחלק את כמות החלבון מחויב (מחושב בשלב 5.13.5) על ידי אקטין אקטין גלולה יחס (שלב 5.13.6) כדי להתאים את ההבדלים גלולה.
NOTE: ערך זה הוא חלבון מחויב מנורמל. - השתמש עקומת סטנדרטי (שלב 5.13.2) לחשב את כמות (מסה) של חלבון מחויב מנורמל (שלב 5.13.7) בכל מדגם.
הערה: חלבון הוסר בתחילה ("סך הכל" המדגם), כמו גם את הסכום טעון (אשר, אלא אם כל גלולה נטען, יהיה חלק כלשהו של גלולה), יש לקחת בחשבון בעת חישוב הסכום הכולל של חלבון כי pelleted. - לקבוע את הריכוז של חלבון קשור בכל מדגם מן המסה הכוללת של חלבון גלולה (מחושב בשלב 5.13.8) ואת נפח המדגם. הפחת ערך זה מן הריכוז מתחיל כדי לקבוע את כמות החלבון חינם. מחלקים את הריכוז של חלבון מחויב על ידי ריכוז actin (מיקרומטר / מיקרומטר של אקטין) ועלילה לעומת ריכוז של חלבון חופשי ליצור עקומה מחייב ( איור 1 ג ).
הערה: מאז F- אקטין אינו יחיד, מין אחיד הוא diffiכת כדי לשרטט את ריכוז טוחנת של F- אקטין ריכוז G- אקטין. השתמש ריכוז G- אקטין ההתחלתי כדי לקבוע את כמות החלבון מחויב (מיקרומטר / מיקרומטר של אקטין) ולהעריך את הריכוז לכאורה של אתרי מחייב בתגובה. הריכוז של אתרי קשירה הוא בדרך כלל פחות ריכוז של מונומרים אקטין בתגובה כי לא כל actin polymerizes וגם בגלל אקטין יחיד מולקולת חלבון מחייב יכול ליצור קשר עם מונומרים מרובים על חוט אקטין.
- באמצעות תוכנית סטטיסטית, לקבוע את הזיקה (K d ) ו- B מקסימום מן עקומת מחייב באמצעות רגרסיה ליניארית לפחות ריבועים.
הערה: מגרשים Scatchard הם discouraged לניתוח נתונים מחייב, בין השאר משום שהם יכולים לטשטש אם מחייב רווי ומכיוון שהם יכולים לעוות שגיאה ניסיונית 10 .
Representative Results
בדקנו αE-catenin homodimer מחייב F- אקטין assay שיתוף שקיעה. מאז ניסויים בעבר הראו כי זיקה של הומודימר αE-catenin עבור F- אקטין הוא סביב 1 מיקרומטר ו מקסימום B ליד 1 11 , ביצענו את assay עם ריכוז נמוך של אקטין F (0.2 מיקרומטר ולא 2 מיקרומטר, ראה הדיון). מאז 0.2 מיקרומטר הוא מתחת לריכוז קריטי, phalloidin נוספה לייצב את F- אקטין פולימר מ שריר השלד שריר G- אקטין (שלב 3.3). ריכוזים הולכים וגדלים של הומודימר αE-catenin (0.125-12.0 מיקרומטר) הודגמו בנוכחות או היעדר של 0.2 מיקרומטר F- אקטין. הדגימות היו centrifuged, וכתוצאה מכך pellets נותחו ( איור 1 א ). כצפוי, הומודימר αE-catenin שיתוף sedimented עם רקע F- אקטין מעל ( איור 1 א ' , להשוות את F- אקטין גלולות דגימות לא- F- ACדגימות פח). BSA היה לרוץ כמו שליטה שלילית ( איור 1 ב ). חלבון Bound היה לכמת זממו על חלבון חינם כדי לחשב את הזיקה של האינטראקציה ( איור 1C ). הנתונים המתויגים מתאימים ביותר למשוואת היל. K מחושב D היה 2.9 מיקרומטר, מקסימום B היה 0.2, ואת מקדם היל (ח) היה 4.8. לפיכך, הומודימר αE-catenin נקשר F- אקטין במשותף עם זיקה מיקרומטר נמוכה, עולה בקנה אחד עם עבודה קודמת (K ד של 2.9 מיקרומטר לעומת ~ 1.0 מיקרומטר) 11 .
איור 1: מהירות גבוהה F- אקטין co- שקיעה assay. ( א ) הגדלת ריכוזי (0.125-12.0 מיקרומטר) של הומודימר αE-catenin הודגרו עם (פאנלים שמאל) או ללא (מימין לוחות) 0.2 מיקרומטר F- אקטין התייצב עם phalloidiנ. הם הודגרו במשך 30 דקות ב RT ו centrifuged. סך הכל (7.5% מהחומר המוצא) וחומר pelleted (50% של חומר pelleted) הופרדו על ידי SDS-PAGE ומוכתמים עם צבע קומאסי. ( ב ) 4 מיקרומטר BSA היה להפעיל כמו שליטה שלילית. סך הכל גלולה דגימות, עם (+) או בלי (-) F- אקטין, הופרדו על ידי SDS-PAGE ומוכתמים עם צבע קומאסי. ( C ) Bound αE-catenin (μM / מיקרומטר actin) מ- A היה זממו נגד חינם αE-catenin (מיקרומטר), ואת הנתונים מתאימים למשוואת היל (קו אדום). K K, B מקסימום ומקדם היל (h) מפורטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: אקטין pelleting כימות תרשים זרימה. סכמטי זה מתאר את שלבי המפתח בסעיף 5, עם דוגמאות של דגימות סך ו גלולה ( A , CE ) ואת עקומת תקן ( ב ) המשמש לכימות. 5.13 צעדים: 1 ) למדוד את כמות החלבון של עניין במדגם הכולל (A). 2 ) ליצור עקומה סטנדרטית על ידי זומם את עוצמת הלהקה לעומת מסת חלבון (B). 3 ) למדוד את כמות החלבון עניין כי שיתוף sedimented עם F- אקטין ( ג ). 4 ) למדוד את כמות החלבון של עניין כי pelleted בהעדר F-actin ( D ). 5 ) לחסר D מ C כדי לקבוע את כמות החלבון קשור F- אקטין. 6 ) למדוד את כמות F- אקטין בכל גלולה (E), לחשב את הכמות הממוצעת של F- אקטין לכל מדגם, ולחלק כל מדגם על ידי הממוצע (המספרים שלהלן מראים את היחס). 7 )עבור כל דגימה, לחלק את כמות החלבון מחויב (מחושב בשלב 5) על ידי היחס גלולה F- אקטין (מחושב בשלב 6) כדי להתאים את ההבדלים גלולה. 8 ) השתמש עקומת סטנדרטי ( ב ) כדי לחשב את כמות (מסה) של חלבון מחויב מנורמל בכל מדגם (שלב 7). 9 ) לקבוע את הריכוז של חלבון חופשי וחלבון מחויב ליצור עקומה מחייב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
אקטין שיתוף assay משקע היא טכניקה פשוטה שיכולה לקבוע במהירות אם חלבון נקשר F- אקטין. עם כמה שינויים, הטכניקה יכולה לשמש גם כדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה. בנוסף נקודות שהועלו בפרוטוקול לעיל, הנושאים הבאים יש לקחת בחשבון בעת תכנון, ניסוי, ופרשנות assay.
חלבון של עניין
חלבון מוכן טרי או קפוא ניתן להשתמש assay. אם חלבון קפוא משמש, מומלץ מאוד להשוות את התוצאות עם חלבון טרי (מעולם לא קפוא) כדי להבטיח כי הקפאה אינה משפיעה על F- אקטין מחייב.
מקור G- אקטין
רבים ניסויים peliting להשתמש G- אקטין מבודדים מן השריר בגלל השפע היחסי שלה. ישנם שלושה אסתטינים אקטין עיקריים ביונקים - אלפא, ביתא וגאמא - דומים להפליא (> 90% רצף מזהיםTy). עם זאת, ישנם הבדלים תפקודיים בין האיזוטופים 12 , 13 . אם אפשר, אקטין G- אקטין המשמש assay מחייב צריך להתאים את איסוטיפ in vivo . לדוגמה, אם בדיקת חלבון לידי ביטוי שריר השלד, אקטין אלפא הוא הבחירה הטובה ביותר; אם בוחנים חלבון לידי ביטוי fibroblasts, בטא אקטין מומלץ.
השימוש Phalloidin
מאז phalloidin נקשר F- אקטין, זה יכול להפריע או אפילו לחסום את הכריכה של כמה חלבונים F- אקטין מחייב ( למשל, בלוקים phalloidin cofilin מחייב לחוטים actin) 14 . לכן, phalloidin יש להשתמש בזהירות עם התוצאות לעומת דגימות שאינן phalloidin שטופלו כאשר אפשרי.
רקע גבוה
אין זה נדיר עבור חלבונים משקעים בהעדר F- אקטין ( איור 1 א , לא F- אקטין גלולה מדגםS). עם זאת, רמות גבוהות של שקיעה ברקע יכול להסוות שיתוף פעולה אקטין אמיתי ולהקשות, אם לא בלתי אפשרי, כדי לקבוע אם חלבון נקשר F- אקטין או למדוד את הזיקה של האינטראקציה. הוספת polidicanol למאגר התגובה (שלב 4.1) יכול להפחית באופן משמעותי את הרקע הוא פתרון קל. אם זה לא להפחית את הרקע, התאמת למאגר התגובה, ריכוז מלח, ו / או טמפרטורת הדגירה עשוי לעזור.
עקומה מחייב
כדי ליצור עקומה מחייב, יש צורך לשנות את הריכוז של החלבון או של עניין או F- אקטין על פני סדרה של תגובות. בפועל, זה קל יותר עדיף לשמור F- אקטין בריכוז קבוע כדי לשנות את הריכוז של חלבון של עניין. שמירה F- אקטין בריכוז קבוע ( למשל, 2 מיקרומטר) ב assay pelleting גבולות שאינם ספציפיים השמנה בריכוזים גבוהים יותר של F- אקטין ומונעדה-פולימריזציה בריכוז נמוך יותר (<0.5 מיקרומטר) של F-actin. דה-פולימריזציה ניתן למנוע באמצעות phalloidin, אם כי זה מציג גורם סיבוך פוטנציאלי לתוך המערכת (ראה שלב 3.3 ומעלה). שמירה על F- אקטין בריכוז קבוע גם מאפשרת להשוות (לנרמל) את F- אקטין גלולה על פני דגימות לזהות ניסויים נכשלו ( כלומר, כאשר גלולה F- אקטין משתנה מאוד, מניעת ניתוח על פני ריכוזים). לבסוף, שמירה F- אקטין בריכוז קבוע מאפשר אחד כדי לקבוע אם מחייב נימה אקטין הוא שיתופי ( איור 1 ג ).
כריכה רוויה
כמו בכל הניסויים מחייב, זה קריטי כי מחייב F- אקטין רווי וכי ריכוז חלבון פלוס F- אקטין plateaus ( איור 1 ג ). ללא רמה, לא ניתן לחשב קבוע שיווי משקל דיסוציאציה קבוע. לכן, זהחשוב לתכנן בקפידה את סדרת הדילול שייבדקו ותמיד לכלול ריכוזים גבוהים יותר של חלבון ( כלומר, לפחות פי 5 עד פי 10 גבוה מהצפוי).
ניתוח מחייב
על מנת קבועי דיסוציאציה נמדד להיות חד משמעית, assay צריך להתבצע באמצעות ריכוז F- אקטין המאפשר ריכוז של אתרי קשירה ב- F- אקטין לחלבון של עניין להיות הרבה יותר נמוך מאשר זיקה. כדי לבדוק אם קריטריון זה נענה, להעריך את ריכוז של אתרי קשירה מ מקסימום B. לדוגמה, אם [F- אקטין] היה 2 מיקרומטר ו- B מקסימום = 0.5, ואז [מחייב אתרים] ≈ 1 מיקרומטר. K K צריך להיות לפחות 5 עד פי 10 גדול יותר מאשר [אתרי מחייב]. אם K K הנמדד הוא בסדר גודל זהה לזה של [קשירת אתרים], אזי ייתכן שהעקומה המחוברת הנצפית מייצגת טיטרציה של siTes ולא איסתרם מחייב אמיתי. אם זה נצפה, לחזור על assay באמצעות 10 פי נמוך ריכוז אקטין F כדי למדוד זיקה מדויקת. עבור אינטראקציות זיקה גבוהה, ייצוב phalloidin (שלב 3.3) עשוי להיות נחוץ כדי להשיג ריכוז F- אקטין נמוך מספיק כדי למדוד במדויק זיקה.
לבסוף, יש מגבלות היסוד עם assay שיתוף שקיעה כי החוקרים צריכים להיות מודעים בעת ביצוע והערכת assay. והכי חשוב, assay שיתוף שקיעה לא לייצר קבוע שיווי משקל קבוע. המוצרים של מחייב ( כלומר, חלבון פלוס F- אקטין) מופרדים מן המגיבים במהלך צנטריפוגה, ואז המוצרים יכולים ואז לנתק ליצור שיווי משקל חדש. כתוצאה מכך, assay co-sedmentation יכול לחשב או להיכשל לגלות אינטראקציות זיקה נמוכה. מאחר וחלבונים רבים של אקטין מחייב זיקה נמוכה ( כלומר, מיקרומטר) ל- F-actin, תוצאה שלילית (
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות גרנט HL127711 ל AVK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge | ThermoFisher Scientific | 46960 | |
| S100-AT3 rotor | ThermoFisher Scientific | 45585 | |
| Ultracentrifuge tubes - 0.2 mL | ThermoFisher Scientific | 45233 | |
| Actin, rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A8531 | |
| Polidicanol (Thesit) | Sigma | 88315 | |
| Phalloidin | ThermoFisher Scientific | P3457 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0862 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | O3196 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | M33 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 3779 | |
| Odyssey CLx Imaging System | LI-COR | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye | ThermoFisher Scientific | 20278 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | ThermoFisher Scientific | LC6025 |
References
- Pollard, T. D. Actin and Actin-Binding Proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).
- Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins. Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).
- Lappalainen, P. Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks. Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).
- Mullins, R. D., Hansen, S. D. In vitro studies of actin filament and network dynamics. Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).
- Miller, P. W., et al. Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin. J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).
- Wickline, E. D., et al. alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments. J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).
- Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2009).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Dyballa, N., Metzger, S. Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels. J Vis Exp. (30), (2009).
- Pollard, T. D. A guide to simple and informative binding assays. Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
- Hansen, S. D., et al. alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors. Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).
- Perrin, B. J., Ervasti, J. M. The actin gene family: function follows isoform. Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).
- Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).
- Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments. J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).
- Kuhn, J. R., Pollard, T. D. Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).
- Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays. Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).
