Imagiologia da morfogénese de embriões de insectos com microscopia de fluorescência com base em folha de luz tornou-se o estado da arte. Este protocolo descreve e compara três técnicas de montagem apropriadas para os embriões Tribolium castaneum, introduz dois novos feitos sob linhagens transgênicas bem adequado para imagens ao vivo, discute controles essenciais de qualidade e indica limitações experimentais atuais.
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Artigo de método
Luz Folha com base em microscopia de fluorescência de Vida ou fixados e corados
Neste artigo
Resumo
Resumo
A farinha vermelho besouro Tribolium castaneum tornou-se um importante organismo modelo inseto em genética do desenvolvimento e biologia evolutiva do desenvolvimento. A observação dos embriões Tribolium com microscopia de fluorescência com base em folha de luz tem várias vantagens sobre widefield convencional e microscopia de fluorescência confocal. Devido às propriedades únicas de um microscópio com base em folha de luz, imagens em três dimensões de espécimes vivos podem ser gravados com altas relações de sinal-para-ruído e reduzida significativamente foto-branqueamento, bem como foto-toxicidade ao longo de várias direcções ao longo de períodos que duram várias dias. Com mais de quatro anos de desenvolvimento metodológico e um aumento contínuo de dados, o tempo parece adequado estabelecer procedimentos operacionais padrão para o uso da tecnologia folha de luz na comunidade Tribolium, bem como na comunidade de insetos em geral. Este protocolo descreve três técnicas de montagem adequados fou finalidades diferentes, apresenta dois novos transgênicos linhas Tribolium feitos sob medida adequada para imagens ao vivo de longo prazo, sugere cinco corantes fluorescentes para rotular estruturas intracelulares de embriões fixos e fornece informações sobre o pós-processamento de dados para a avaliação atempada dos dados gravados. Os resultados representativos concentrar em imagens ao vivo a longo prazo, de corte tico e a observação do mesmo embrião ao longo de várias direcções. Os respectivos conjuntos de dados são fornecidos como um recurso para download. Finalmente, o protocolo discute controlos de qualidade para os ensaios de imagens ao vivo, as actuais limitações e a aplicabilidade dos procedimentos descritos para outras espécies de insectos.
Este protocolo destina-se principalmente para os biólogos do desenvolvimento que buscam soluções de imagem que superam equipamentos de laboratório padrão. Ela promove a tentativa contínua para fechar o intervalo entre os laboratórios tecnicamente orientadas / comunidades, que se desenvolvem e refinar microscopiar metodologicamente, e os laboratórios de ciências da vida / comunidades, que exigem soluções 'plug-and-play' para os desafios técnicos. Além disso, ele suporta uma abordagem axiomático que move as questões biológicas para o centro das atenções.
Introdução
A farinha besouro Tribolium castaneum vermelho, que pertence à grande família de escaravelhos pretos (Tenebrionidae), tem uma longa história no âmbito das ciências agrícolas e de vida e é o segundo mais bem estudada organismo modelo inseto modelo após a mosca da fruta Drosophila melanogaster. Durante as últimas quatro décadas, tornou-se um poderoso e popular organismo inseto modelo em genética do desenvolvimento, em biologia evolutiva do desenvolvimento e, durante os últimos vinte anos, na morfogênese embrionária para uma variedade de razões:
Drosophila e Tribolium ambos pertencem ao Holometabola, mas d....
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Protocolo
1. Criação de Culturas Tribolium
NOTA: As condições padrão são definidas como uma temperatura de incubação de 25 ° C e 70% de humidade relativa dentro de 12 h / 12 h brilhantes ciclo escuro. Para mais informações sobre Tribolium criação, respectivas diretrizes estão disponíveis 64. Este protocolo requer dois meios diferentes à base de farinha, que podem ser preparados em quantidades kg e armazenados durante vários meses.
- Antes de trabalhar com farinha e fermento seco inactivo, armazenar as embalagens fechadas, a -20 ° C durante 24 h e depois deixá-los aquecer até à temperatura ambiente.....
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Resultados
Este protocolo descreve um modelo experimental para imagiologia por fluoresccia de vida ou embriões Tribolium fixadas e coradas com LSFM. Devido aos baixos níveis de foto-branqueamento e foto-toxicidade, uma consequência directa da sua capacidade de seccionamento óptico, LSFM é particularmente bem adequado para imagens ao vivo a longo prazo.
O novo AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 linha transgénica expressa uma proteí.......
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Discussão
Controle de qualidade
Em ensaios de imagens ao vivo, o processo de preparação e de gravação deve ser não-invasivo, isto é, nem a mecânica e de manuseamento de produtos químicos (recolha, dechorionation, de montagem no suporte da amostra) nem a carga de energia integrada durante a observação deve afectar a viabilidade do espécime. Para estudos que caracterizam o desenvolvimento WT, recomenda-se usar dados apenas a partir de experimentos em que o embrião sobrevive o p.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Autor Contribuições
FS e EHKS concebeu a pesquisa. FS gerado as linhas AGOC transgénicos. imagiologia por fluorescência baseado em folha de luz foi realizado por FS e SK. FS e EHKS escreveu o manuscrito com a entrada de SK.
Agradecimentos
Agradecemos Sven Plath para suporte técnico. A linhagem transgênica Glia-azul era um presente amável de Gregor Bucher (Göttingen, Alemanha). A pesquisa foi financiada pelo Cluster de Excelência Frankfurt am Main para Complexos Macromoleculares (CEF-MC, EXC 115, orador Volker Dötsch) concedido em parte para EHKS no Instituto Buchmann Molecular Ciências da Vida (BMLS, diretor Enrico Schleiff) no Goethe Universität Frankfurt am Main pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| farinha de trigo integral | Demeter e.V. | 1.13E + 08 | EUA: farinha de trigo integral, Reino Unido: farinha integral |
| 405 farinha de trigo fina | Demeter e.V. | 1.13E+08 | EUA: farinha de pastelaria, Reino Unido: farinha macia |
| fermento seco inativo | Flystuff / Genesee Scientific | 62-106 | |
| Saine tamponada com fosfato (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| hipoclorito de sódio, ~12% Cl ativo | Sigma Aldrich | 425044-250ML | Cuidado: o hipoclorito de sódio é uma |
| agarose corrosiva de baixo ponto de fusão | Carl Roth | 6351.2 | |
| Placa de 6 poços | Orange Scientific | 4430500 | |
| Placa de 24 poços | Orange Scientific | 4430300 | |
| capilares de vidro, internos e Oslash; 0,46 mm | Marca GmbH + Co KG | 7087 09 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | 57020 | A preparação da solução de coloração é explicada na Tabela 2 |
| Iodeto YOYO-1 | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | A preparação da solução de coloração é explicada na Tabela 2 |
| BOBO-3 Iodeto | Thermo Fisher Scientific | B3586 | A preparação da solução de coloração é explicada na Tabela 2 |
| Alexa Fluor 488 Faloidina | Thermo Fisher Scientific | A12379 | A preparação da solução de coloração é explicada na Tabela 2 |
| Alexa Fluor 546 Faloidina | Thermo Fisher Scientific | A22283 | A preparação da solução de coloração é explicada na Tabela 2 |
| peneira, 800 µ m malha | VWR International | 200.025.222-051 | |
| peneira, 710 µ m malha | VWR International | 200.025.222-050 | para preparação do meio de crescimento (passo 1.1) |
| peneira, 300 µ m malha | VWR International | 200.025.222-040 | |
| peneira, 250 µ m malha | VWR International | 200.025.222-038 | para preparação de meio de postura de ovos (passo 1.2) |
| prato de vidro, Ø 100 mm &vezes; 20 mm | Sigma Aldrich | CLS70165102 | |
| pilha, 100 µ m tamanho da malha | BD Biosciences | 352360 | |
| pincel, cabeça e Oslash; | VWR International | 149-2121 | |
| , 1,0 mL | B. Braun Medical AG | 9166017V | |
| Sigma Aldrich | M1152-1000EA | ||
| paraformaldeído (PFA) | Sigma Aldrich | 158127 | Cuidado: o paraformaldeído é tóxico e corrosivo |
| N-heptano ≥ 99% | Carl Roth | 8654.1 | Cuidado: o n-heptano é inflamável e tóxico |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | Cuidado: Trition X-100 é corrosivo |
Referências
- Brown, S. J., Denell, R. E., Beeman, R. W. Beetling around the genome. Genet. Res. 82, 155-161 (2003).
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346, 763-767 (2014).
- Tong, K. J., Duchêne, S., Ho, S. Y. W., Lo, N.
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Reimpressões e permissões
