Fractionnement des membranes cérébrales: une Ex Vivo Approche pour évaluer la localisation des protéines sous-synaptiques

Summary

Ici, nous présentons un protocole de fractionnement de la membrane du cerveau qui représente une procédure robuste pour isoler les protéines appartenant à différents compartiments synaptiques.

Abstract

L'évaluation de la composition et de la fonction de la protéine synaptique constitue un défi important en neuroscience. Cependant, il n'est pas facile d'évaluer la neurotransmission qui se produit dans les synapses car elle est fortement réglementée par des interactions protéines-protéines dynamiques et des événements de phosphorylation. Par conséquent, lorsqu'une méthode est utilisée pour étudier la transmission synaptique, un objectif majeur est de préserver ces modifications physiologiques transitoires. Ici, nous présentons un protocole de fractionnement de la membrane du cerveau qui représente une procédure robuste pour isoler les protéines appartenant à différents compartiments synaptiques. En d'autres termes, le protocole décrit une méthodologie biochimique pour effectuer l'enrichissement en protéines à partir de compartiments présynaptiques, postsynaptiques et extrasynaptiques. Tout d'abord, les synaptosomes, ou les terminaux synaptiques, sont obtenus à partir de neurones qui contiennent tous les compartiments synaptiques au moyen d'un gradient discontinu de saccharose. Il est à noter que la qualité de cette préparation initiale de la membrane synaptique est cRitical. Par la suite, l'isolement des différents compartiments sous-synaptiques est obtenu avec une solubilisation légère à l'aide de détergents doux à des conditions de pH différentiel. Cela permet une séparation par gradient et centrifuges isopyciques. Enfin, l'enrichissement en protéines dans les différents compartiments sous - synaptiques ( c'est-à-dire les fractions membranaires pré, post et extrasynaptiques) est validé au moyen d'une analyse par immunoblot en utilisant des marqueurs de protéines synaptiques bien caractérisés (SNAP-25, PSD-95 et synaptophysine, Respectivement), ce qui permet une évaluation directe de la distribution synaptique de toute protéine neuronale particulière.

Introduction

La transmission synaptique repose sur l'intégrité physique de la synapse, concept qui a été envisagé dès 1897 par Foster et Sherrington ¹ . Ainsi, la compréhension de la distribution de composants clés de neurotransmission ( p. Ex., Canaux ioniques, récepteurs, etc. ) est essentielle pour élucider la fonction synaptique, tant dans des conditions normales que pathologiques. La microscopie électronique (EM) a énormément contribué à la notion ultrastructurale actuelle des synapses prototypiques du système nerveux central (SNC). De telle manière, EM a établi avec précision les différences entre les densités pré et postsynapti....

Protocol

Toutes les procédures expérimentales animales ont été approuvées par le Comité d'utilisation et de soins des animaux (CEEA) de l'Université de Barcelone, conformément aux directives décrites dans le Guide pour la prise en charge et l'utilisation des animaux de laboratoire ¹¹ et à la suite de la Communauté européenne, loi 86/609 / CCE, FELASA et ARRIVE. Ainsi, les souris sont logées dans des cages standard, avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau, et sont maintenues dans des conditions standard contrôlées (12 h de cycle sombre / léger à partir de 7 h 30, température de 22 ° C et 66% d'humidité).....

Results

La méthodologie décrite a été largement utilisée pour l'analyse sous-synaptique des protéines neuronales en général et pour l'isolement et la caractérisation biochimique des récepteurs synaptiques ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9} en particulier. Fait intéressant, le résultat représentatif affiché ici montre l'utilité de cette procédure expér.......

Discussion

Le protocole présenté ici constitue un outil biochimique puissant pour l’étude de la distribution sous-synaptique de protéines spécifiques au sein de n’importe quelle région du cerveau. Cependant, il existe quelques inconvénients inhérents à la technique qui méritent d’être soulignés ici. Par exemple, l’une des principales limitations est la quantité relativement importante de tissu nécessaire pour purifier une quantité raisonnable de protéines afin d’effectuer l’analyse immunoblot de toutes les fractions sous-synaptique.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
saccharose	pancréatique ; mica SL, Barcelone, Espagne	1 316 211 211
CaCl2	Pancréac Quí ; mica SL, Barcelone, Espagne	2 112 211 210
MgCl2· ; 6H2O	Pancréas Quí ; mica SL, Barcelone, Espagne	1,313,961,210
Cocktail d’inhibiteurs de protéase Set III	Millipore, Darmstadt, Allemagne	535140
Trizma Base	Sigma, St. Louis, MO, USA	T1503
Tris-HCl	Pancréac ; mica SL, Barcelone, Espagne	1,236,541,209
Triton X-100	Sigma, St. Louis, MO, USA	X100
SDS	Sigma, St. Louis, MO, USA	L3771
Glycérol	Sigma, St. Louis, MO, USA	G5516
Bromophenol Blue	Pancréac Quí ; mica SL, Barcelone, Espagne	1 311 651 604
Dithiothreitol	Sigma, St. Louis, MO, USA	D0632
Tween 20	Sigma, St. Louis, MO, USA	P2287
Lait
NaCl	Pancréac Quí ; mica SL, Barcelone, Espagne	1 216 591 211
KCl	Pancréas Quí ; mica SL, Barcelone, Espagne	1 314 941 210
KH2PO4	Merck	4873
Na2HPO4	Pancreac Quí ; mica SL, Barcelone, Espagne	1,316,781,211
Basic 20 pH	Crison, Alella, Espagne
Polytron VDI 12 Homogénéisateur adaptable	VWR, Radnor, PA, États-Unis.
Tubes ultra-transparents (14x89mm)	Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelone	344059	Les tubes doivent être remplis presque complètement lorsqu’ils sont utilisés pour éviter l’effondrement dû à l’ultracentrifugation.
Filtres centrifuges Amicon Ultra-15 Ultracel -10K	Merck Millipore, Darmstadt, Allemagne	UFC901008
Centrifugeuse 5430R	Eppendorf, Hamburgo, Allemagne
Ultracentrifugeuse Optima L-90K	Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona
Sonifier 250	Branson, Danbury, Connecticut
Amersham Imager 600	GE Healthcare Europe GmbH, Barcelone, Espagne
Verre jetable Pasteur Pippetes 230 mm	VWR, Radnor, PA, USA	612-1702
Balance compacte EK-610	A& D, Tokyo, Japon
Pierce&trade ; Kit de dosage des protéines BCA	Pierce Biotechnology, Rockford, IL, États-Unis
Substrat pico-luminescent SuperSignal west Thermo	Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, États-Unis GR
200 Balance de précision	A& D, Tokyo, Japon
Anti-GPR37	Anticorps anti-GPR37 fait maison produit et validé dans le laboratoire Francisco Ciruela.		Les anticorps primaires utilisés à une concentration finale de 0,250 &mu ; g/mL
Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysine	Abcam, Cambridge, Royaume-Uni		Anticorps primaires dilués 1:10 000
IgG de chèvre conjugués HRP	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis.		Anticorps secondaire dilué 1:10 000
HRP chèvre anti-lapin IgG	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis.		Anticorps secondaires dilués 1:30 000